miR-34a骨粉复合胶原基水凝胶促进辐照区骨缺损修复

摘要

目的 探讨负载miR-34a的Bio-Oss^?骨粉与转谷氨酰胺酶交联明胶（transglutaminase crosslinked gelatin,Col-Tgel）的联合使用对辐照损伤大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的成骨分化作用及对辐照区骨缺损修复的作用。方法 本实验已获得单位实验动物伦理委员会批准。取2周龄SD大鼠长骨骨髓，培养BMSCs并进行鉴定。当BMSCs生长至贴满瓶底80%时，进行2 Gy剂量X线照射，制备BMSCs辐照损伤模型备用。将2.5、5μL Col-Tgel分别加入10 mg Bio-Oss^?骨粉（P）中，制备复合骨替代材料PG-2.5和PG-5，通过体外和体内实验筛选骨粉与水凝胶合适比例。将lipofectamine 2000分别与Cy3-agomiR-34a、agomiR-34a或agomiR NC混合，然后将各组混合液分别加入10 mg Bio-Oss^?骨粉（P）并进行冷冻干燥。将上述负载各组miR的10 mg Bio-Oss^?骨粉和未负载miR的Bio-Oss^?骨粉分别与2.5μL Col-Tgel混合，制备PG-Cy3-miR-34a、PG-miR-34a、PG-miR NC、PG组复合骨替代材料。将辐照后的BMSCs与PG-Cy3-miR-34a组复合骨替代材料共培养，使用共聚焦显微镜观察转染效果。将辐照后的BMSCs与PG-miR-34a组、PG-miR NC组、PG组复合骨替代材料共培养，使用RT-qPCR检测miR-34a表达、CCK-8检测细胞增殖，并在成骨诱导14 d后利用RT-qPCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2（Runt related transcription factor 2,Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）的表达。取8周龄SD大鼠进行双侧胫骨15 Gy剂量X线照射，3周后在胫骨干骺端骨骺线下方2～3 mm处制备直径3 mm、深度2 mm的胫骨缺损，缺损区分别置入PG-miR-34a组、PG-miR NC组、PG组复合骨替代材料，植入8周后取材行micro-CT和HE切片观察体内骨缺损修复效果。结果 2 Gy辐照影响BMSCs成骨分化能力，辐照组ALP染色浅于非辐照组，辐照组茜素红染色矿化结节少于非辐照组。10 mg Bio-Oss^?骨粉与2.5μL Col-Tgel构建的复合材料具有较好的操作性能和成骨性能，并用于后续实验。PG-Cy3-miR-34a可将负载的Cy3-agomiR-34a转染入辐照损伤BMSCs中。PG-miR-34a可提高辐照损伤BMSCs中miR-34a的表达水平，对细胞增殖无抑制作用，并能显著促进成骨相关基因Runx2、ALP、OCN的表达。在辐照区骨缺损修复实验中，micro-CT显示PG-miR-34a组骨缺损区新生骨体积高于其他组，HE切片染色结果也验证了PG-miR-34a可促进骨缺损修复。结论 miR-34a骨粉复合胶原基水凝胶可促进辐照损伤BMSCs体外成骨分化，促进辐照区骨缺损修复。

关键词

骨粉 / 骨髓间充质干细胞 / 成骨分化 / 骨修复 / miR-34a / 转谷氨酰胺酶交联明胶 / 辐照损伤 / 放疗