牙周膜干细胞来源的内、外囊泡对炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

摘要

目的 研究牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）来源的细胞内囊泡（intracellular vesicles,IVs）、细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）模拟的炎症微环境下PDLSCs成骨分化的影响，为IVs在牙周炎组织修复与再生的应用提供新的思路。方法 获得单位伦理审批，提取人来源的PDLSCs，收集第3～6代PDLSCs来源的IVs、EVs，使用透射电镜、纳米流式分析、Western Blot对其鉴定。取第3～6代PDLSCs分为：Control组、LPS组、LPS+100μg/mL EVs组（LPS+EVs组）和LPS+100μg/mL IVs组（LPS+IVs组）。通过CCK-8、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Western Blot、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色、茜素红染色（alizarin red staining,ARS）评估炎症微环境下IVs、EVs对PDLSCs抗炎和促成骨分化的影响。结果 透射电镜下PDLSCs来源的EVs、IVs呈现双层膜结构，纳米流式分析显示IVs、EVs的平均粒径分别为79.6 nm、82.1 nm,Western Blot检测IVs、EVs表面蛋白CD9、CD63、CD81表达阳性，Calnexin表达阴性，IVs、EVs获取成功。相较于Control组，LPS组PDLSCs增殖降低，炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平增高，成骨分化相关基因Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）mRNA表达降低，成骨分化相关蛋白RUNX2和骨桥蛋白（osteopontin,OPN）蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）；相较于LPS组，LPS+EVs组和LPS+IVs组PDLSCs增殖增高，炎症因子IL-6、TNF-α水平降低，RUNX2、ALP、OCN的mRNA表达增高，成骨分化相关蛋白RUNX2和OPN蛋白表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）；且炎症微环境下，IVs促进PDLSCs增殖、抑制TNF-α、促进RUNX2 mRNA表达、促进RUNX2蛋白和OPN蛋白表达，促进ALP活性及矿化结节生成的作用较EVs更为显著（P<0.05）。结论 PDLSCs来源的EVs、IVs均能够在炎症微环境下促进PDLSCs增殖，抑制炎症因子表达，促进PDLSCs成骨分化，且IVs的抗炎和成骨效果优于EVs。

关键词

牙周膜干细胞 / 细胞内囊泡 / 细胞外囊泡 / 成骨分化 / 炎症因子 / 白细胞介素-6 / 肿瘤坏死因子-α / Runt相关转录因子2 / 碱性磷酸酶 / 骨钙素 / 骨桥蛋白