血管生成素4对牙髓干细胞成牙本质向分化的作用

摘要

目的 探讨血管生成素4(angiopoietin 4,ANGPT4)对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响。方法 本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准，并获得患者知情同意。将人前磨牙进行固定、脱钙、脱水、包埋和切片，免疫荧光染色观察ANGPT4的表达及定位。体外分离培养人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs），于倒置相差显微镜下观察hDPSCs的生长状态及形态；流式细胞术检测细胞表面相关分子标志物的表达；碱性磷酸酶和茜素红S染色鉴定h DPSCs成牙本质向分化的潜能；油红O染色鉴定hDPSCs成脂向分化潜能。提取hDPSCs成牙本质向诱导后不同时间点的RNA，采用RT-qPCR分析hDPSCs体外成牙本质向分化过程中ANGPT4基因及成牙本质细胞相关基因的表达。采用siRNA基因沉默技术沉默hDPSCs中ANGPT4基因的表达，通过RT-qPCR和Western blot检测沉默效率；在hDPSCs中沉默ANGPT4基因表达24 h后进行成牙本质向诱导，在诱导的第7天和14天分别进行碱性磷酸酶和茜素红S染色，检测沉默ANGPT4后hDPSCs的成牙本质向分化能力。结果 人前磨牙的免疫荧光染色结果显示，ANGPT4在成牙本质细胞及成牙本质细胞下层多细胞区中表达。hDPSCs经分离培养14 d后状态良好，镜下观察到多个细胞集落，细胞形态均一，呈长梭形；流式细胞术结果显示，hDPSCs表达间充质干细胞标志物CD105(90.42%)和CD90(97.15%)，不表达造血细胞标志物CD45(0.01%)和CD34(0.08%)。将hDPSCs进行成牙本质向和成脂向诱导培养后，碱性磷酸酶染色、茜素红S染色和油红O染色均呈阳性。RT-qPCR结果显示，ANGPT4在hDPSCs分化的第5、7、11和14天均高表达（P<0.05），其中第5天表达水平最高。转染si-ANGPT4后，hDPSCs的ANGPT4 mRNA和蛋白表达显著下调（P<0.05）；碱性磷酸酶染色结果显示，si-ANGPT4组ALP染色强度和面积均显著低于阴性对照组；茜素红S染色结果显示，si-ANGPT4组钙结节形成明显低于阴性对照组。结论 ANGPT4基因在人前磨牙成牙本质细胞及下层多细胞区中表达；ANGPT4可能促进hDPSCs成牙本质向分化。

关键词

血管生成素4 / 牙髓干细胞 / 成牙本质细胞 / 基因沉默 / 成牙本质向分化 / 生长因子 / 组织再生 / 牙本质

基金资助

国家自然科学基金项目（81970903、81920108012、82270959）; 吉林省自然科学基金项目（2020020201527JC）; 吉林省卫生健康青年科技骨干培养计划项目（2019Q013）