LED红光上调MAPK信号促进炎性环境中人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化

摘要

目的 探讨发光二极管（light-emitting diode,LED）红光对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）成骨/成牙本质分化的影响及机制。方法 本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准。组织块酶消化法培养hDPSCs，在0、1、5、10μg/mL脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激下，CCK-8法检测hDPSCs增殖，筛选LPS刺激浓度。设置CG组（矿化诱导）、LPS+CG组、LPS+CG+LED光照组（能量分别为2、4、6、8、10 J/cm²）。第7天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色及活性测定，实时荧光定量PCR检测ALP、成骨细胞特异性转录因子（osterix,OSX）、牙本质基质蛋白-1（dentin matrix protein-1,DMP-1）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）基因表达情况，第21天进行茜素红染色及钙结节定量分析，筛选最佳光照能量。设置LPS+CG组、LPS+CG+LED组（最佳能量），ELISA法检测第1、3、5、7天肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及白介素-1β（interlenkin-1β,IL-1β）表达量。Western blot法检测细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、p38、细胞外调节蛋白激酶5（extracellular regulated protein kinases 5,ERK5）及磷酸化蛋白表达。分别阻断ERK1/2、JNK、ERK5、p38通路后，Western blot法检测第7天ALP、OSX、DMP-1、DSPP蛋白表达。结果 CCK-8结果显示10μg/mL LPS诱导下，在第5、7天hDPSCs增殖低于0、1、5μg/mL LPS组（P<0.05），后续选择10μg/mL作为LPS刺激浓度。ALP染色及活性，ALP、OSX、DMP-1、DSPP的基因表达水平及钙结节定量结果示LPS+CG+4 J/cm²组均高于其他处理组（P<0.05）。4 J/cm²LED红光促成骨/成牙本质分化能力最强，作为后续实验光照能量。ELISA结果显示第5、7天，LPS+CG+LED组的TNF-α与IL-1β的分泌表达量低于LPS+CG组（P<0.05）。Western blot结果显示4 J/cm²LED红光促进p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、p-ERK5蛋白表达；分别阻断通路后，LPS+CG+LED+U0126（抑制ERK1/2）、SP600125（抑制JNK）、BIX02189（抑制ERK5）组ALP、OSX、DMP-1、DSPP蛋白表达量低于LPS+CG+LED组（P<0.001）,LPS+CG+LED+SB203580（抑制p38）组ALP、OSX、DMP-1蛋白表达量与LPS+CG+LED组比较无显著差异（P>0.05）。结论 LED红光促进炎症环境下hDPSCs成骨/成牙本质分化，其作用机制可能为通过上调ERK1/2、JNK、ERK5信号减少炎症因子TNF-α与IL-1β释放有关。

关键词

人牙髓干细胞 / 脂多糖 / 炎性环境 / 发光二极管 / 红光 / 成骨/成牙本质分化 / MAPK信号通路 / 成骨细胞特异性转录因子 / 牙本质基质蛋白-1 / 牙本质涎磷蛋白