KEAP1-NRF2/HO-1通路介导LED红光促高糖诱导下人牙周膜干细胞成骨分化及减轻氧化损伤

摘要

目的 探讨Kelch样ECH相关蛋白1-核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Kelch-like ECH associated protein 1-nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1,KEAP1-NRF2/HO-1）通路介导发光二极管（light-emitting diode,LED）红光对高糖诱导下人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）成骨分化和氧化损伤的影响，为LED红光在细胞抗氧化损伤中的应用提供依据。方法 流式细胞术、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和茜素红染色鉴定hPDLSCs；高糖预处理hPDLSCs 48 h，用1、3、5 J/cm2LED红光照射细胞，CCK-8实验选择促细胞增殖率高的辐射曝光量进行后续实验。将hPDLSCs分为对照组、高糖组、高糖+光照组；ALP染色、ALP活性检测、茜素红染色和半定量分析检测成骨分化能力，qRT-PCR和Western blot检测细胞成骨相关基因ALP、Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）、成骨细胞特异性转录因子（osterix,OSX）基因和蛋白表达；qRT-PCR检测相关抗氧化酶基因超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2,SOD2）、过氧化氢酶（catalase,CAT）表达；荧光显微镜观察和流式细胞术测定细胞内活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）水平；ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）水平。以NRF2特异性抑制剂ML385抑制NRF2通路，ALP染色、ALP活性检测细胞早期成骨分化能力，q RT-PCR检测早期成骨分化标志物ALP、RUNX2、OSX基因表达，Western blot检测细胞KEAP1、NRF2、HO-1蛋白表达水平。结果 选择促高糖诱导下hPDLSCs增殖率最高的5 J/cm2辐射曝光量进行后续实验（P<0.05）。5 J/cm²LED红光促进高糖诱导下hPDLSCs的成骨分化（P<0.05），上调ALP、RUNX2、OSX的基因与蛋白表达（P<0.05），上调SOD2、CAT基因表达（P<0.05），降低细胞ROS水平（P<0.05），减少细胞上清液中TNF-α、IL-1β水平（P<0.05）。ML385抑制NRF2通路，细胞ALP活性降低（P<0.05）,ALP、RUNX2、OSX基因表达下降（P<0.05）,KEAP1蛋白表达上升（P<0.05）,NRF2、HO-1蛋白表达下降（P<0.05）。结论 LED红光可能通过KEAP1-NRF2/HO-1通路促进高糖诱导下hPDLSCs增殖和成骨分化，减轻氧化损伤。

关键词

发光二极管 / 人牙周膜干细胞 / 高糖 / 成骨分化 / 活性氧簇 / 抗氧化 / Kelch样ECH相关蛋白1 / 核因子E2相关因子2 / 血红素加氧酶-1