炎症环境下敲低SHP2对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

摘要

目的探讨炎症环境下含有Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology-2 domain containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP2）对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs）增殖及成骨分化的调节作用和相关机制，为牙周炎治疗提供新的靶点。方法使用慢病毒感染构建敲低SHP2基因的h PDLSCs细胞系，通过RT-q PCR、Western blot验证SHP2的敲低水平；使用肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）在体外模拟炎症环境；CCK-8检测正常及炎症条件下敲低SHP2对h PDLSCs增殖的影响；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色、ALP活性检测、ARS染色、RT-q PCR以及Western blot检测成骨指标；Western blot检测敲低SHP2在炎症条件下，对丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB(mitogen-activated protein kinase/nuclear factor-κB,MAPK/NF-κB）通路蛋白的影响。结果慢病毒感染细胞72 h后在荧光显微镜下显示出明显的绿色荧光，测得SHP2 sh RNA重组慢病毒的滴度为2.9×108TU/m L;Western blot及RT-q PCR检测发现，SHP2敲低组的SHP2蛋白及基因的表达显著降低（P<0.001）；在正常条件下，敲低SHP2在一定程度上抑制了h PDLSCs的增殖；敲低SHP2后，h PDLSCs的早期成骨指标增高，包括ALP活性显著增高，ALP和COL-1的表达增加（P<0.05），然而敲低SHP2对h PDLSCs最终产生钙结节的量无明显影响。在TNF-α和IL-1β诱导的炎症环境下，敲低SHP2对h PDLSCs的增殖无明显影响（P>0.05），敲低SHP2后，h PDLSCs成骨相关指标均增加（P<0.05），钙结节形成的量增多（P<0.05）；炎症环境下，敲低SHP2后，h PDLSCs中p65的磷酸化和IκB-α的降解降低，并且NF-κB上游MAPK通路蛋白p-p38和p-JNK的表达降低（P<0.05）。结论炎症环境下，敲低SHP2对h PDLSCs的增殖无明显影响，但可通过抑制MAPK/NF-κB通路促进h PDLSCs成骨分化。

关键词

牙周膜干细胞 / 增殖 / 牙周炎 / 肿瘤坏死因子-α / 白细胞介素-1β / 炎症环境 / Src同源结构域2的蛋白质酪氨酸磷酸酶2 / 基因沉默 / 成骨分化 / 碱性磷酸酶 / COL-1 / MAPK/NF-κB信号通路