白藜芦醇碳化聚合物点对炎症状态下的巨噬细胞极化及人牙周膜干细胞成骨分化的影响

摘要

目的 探讨白藜芦醇碳化聚合物点（resveratrol-derived carbonized polymer dots,RSV-CPDs）对炎症状态下的巨噬细胞极化与人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）成骨分化的作用及其机制，为RSV-CPDs治疗牙周炎提供实验依据。方法 将白藜芦醇（resveratrol,RSV）在催化剂氨水存在的条件下通过高温热解法制备成RSV-CPDs并且通过透射电镜（transmission electron microscope,TEM）、傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer,FTIR）、X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）以及X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）对RSV-CPDs进行表征验证；使用CCK8检测RSV-CPDs的细胞毒性。通过流式细胞术检测RSV-CPDs在牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖（Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide,P.g-LPS）刺激条件下对巨噬细胞的凋亡及细胞极化的影响：（1）细胞凋亡实验分组：将巨噬细胞（RAW264.7）分为对照组（不做任何处理）、P.g-LPS组[P.g-LPS（2μg/mL）处理细胞24 h]、RSV组[P.g-LPS（2μg/mL）+RSV（10μg/mL）处理细胞24 h]以及RSV-CPDs组[P.g-LPS（2μg/mL）+RSV-CPDs（50μg/mL）处理细胞24 h]，；（2）细胞极化实验分组：将巨噬细胞（RAW264.7）分为4组，分别为对照组（不做任何处理）、P.g-LPS+IFN-γ组[P.g-LPS（200 ng/mL）+IFN-γ（20 ng/mL）处理细胞24 h]、RSV组[P.g-LPS（200 ng/mL）+IFN-γ（20 ng/mL）+RSV（10μg/ml）处理细胞24 h]、RSV-CPDs组[P.g-LPS（200 ng/mL）+IFN-γ（20 ng/mL）+RSV-CPDs（50μg/mL）处理细胞24h]。收集上述细胞极化实验中各组巨噬细胞上清液并与成骨诱导培养基1:1混合，分别用于培养hPDLSCs，将hPDLSCs对应分组为对照组、P.g-LPS+IFN-γ组、RSV组以及RSV-CPDs组，采用碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase,ALP）、茜素红染色（alizarin red staining,ARS）检测hPDLSCs成骨趋势；实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测成骨相关基因表达的变化；Western blot检测hPDLSCs的成骨相关蛋白的表达结果。最后采用转录组学测试探究RSV-CPDs对炎症刺激下的巨噬细胞（THP-1）表型影响的机制。结果 TEM结果显示RSV-CPDs呈现均一的球形结构；FTIR结果显示，RSV-CPDs产生新的O-C=O峰；XRD结果证实新合成的RSV-CPDs呈现无定形结构；XPS结果显示RSV-CPDs形成了亲水基团羧基；CCK-8结果显示RSV在浓度超过10μg/mL时便对RAW264.7存在一定的毒性（P=0.011），而RSV-CPDs在浓度达到50μg/mL时对细胞依旧具有良好的生物安全性（P>0.05），因此后续试验浓度RSV为10μg/mL,RSV-CPDs为50μg/mL。流式细胞术结果显示：RSV-CPDs具有抑制炎性刺激状态下巨噬细胞凋亡的效果（P=0.008），且抑制效果优于其前体RSV（P=0.009）。RSV组以及RSV-CPDs组CD86⁺细胞相较于P.g-LPS+IFN-γ组有不同程度的降低（P<0.001,P=0.004），而CD206⁺细胞则存在不同程度的提升（P=0.006,P=0.008），并且RSV-CPDs组CD206⁺细胞比例高于RSV组（P=0.010）。与P.g-LPS+IFN-γ组对比，RSV-CPDs处理过的巨噬细胞上清液显著提升了hPDLSCs的ALP表达（P=0.005）、ARS水平（P=0.006），成骨相关基因RUNX-2、OCN以及COL-1的mRNA表达显著上升（P<0.05），以及RUNX-2蛋白水平也显著上升（P=0.001）。转录组学结果显示：与P.g-LPS+IFN-γ组对比，RSV-CPDs组的核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路以及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）信号通路均呈现下调趋势。结论 RSV-CPDs可抑制炎症状态下的巨噬细胞凋亡及使其向M2型极化，促进h P-DLSCs成骨分化，其机制可能与抑制NF-κB、TNF信号通路有关。

关键词

巨噬细胞极化 / 牙龈卟啉单胞菌 / 白藜芦醇 / 碳化聚合物点 / 脂多糖 / 炎症 / 人牙周膜干细胞 / 成骨分化