HIF-1α对BMSCs膜片成骨-成血管耦联的效应研究

摘要

目的 探讨低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）膜片成骨-成血管耦联的效应，为体外构建预血管化的组织工程骨提供依据。方法 获得医院实验动物伦理委员会批准，体外培养Wistar大鼠的BMSCs，将携带HIF-1α的慢病毒（lentivirus, LV）和空载慢病毒稳定转染至第三代大鼠BMSCs中，形成Lv-HIF-1α-BMSCs组和Lv-BMSCs组，同时以未转染慢病毒的BMSCs为空白对照（BMSCs组），荧光定量PCR和Western Blot验证转染HIF-1α的效果。将LV-HIF-1α-BMSCs进行诱导分化形成内皮样细胞（endothelial-like cells, iECs），光学显微镜观察形态，细胞流式CD31检测分化情况，Transwell实验检测HIF-1α对iECs的迁移能力。将LV-HIF-1α-BMSCs（实验组）和LVBMSCs（对照组）连续成骨诱导培养形成成骨细胞膜片（osteogenic cell sheets, OCTs），分别在第14、21天进行碱性磷酸酶和茜素红染色、拍照并计数其矿化能力。最终将iECs植入OCTs中构建预血管化的成骨膜片（prevascularized osteogenic cell sheets, P-OCTs），在第1、3、7、14天进行免疫荧光CD31检测并计算内皮血管网形成的数量；第1、7、14天进行骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和骨钙素（osteocalcin,OCN）的Western Blot检测，验证其成骨分化的能力。结果 慢病毒转染BMSCs的最佳感染复数（multiplicity of infection, MOI）为30，转染率>80%。荧光定量PCR和Western Blot结果显示，与LV-BMSCs组和BMSCs组相比，LV-HIF-1α-BMSCs组中的HIF-1α具有稳定且高的表达（P<0.05）。LV-HIF-1α-BMSCs向iECs分化效率高达91.81%。Transwell实验结果显示HIF-1α具有体外招募iECs的作用；碱性磷酸酶染色和茜素红染色证实LV-HIF-1α-BMSCs形成的OCTs具有明显的成骨分化能力，与对照组LV-BMSCs相比差异具有统计学意义（P<0.05）。当iECs植入LV-HIF-1α-BMSCs组OCTs中形成P-OCTs时，iECs大量增殖、迁移并快速融合，免疫荧光CD31染色显示进行性管腔和血管网的形成。OPN、OCN的表达与对照组Lv-BMSCs相比显著增强，OPN在第1天表达量最高，OCN在第7天表达量最高（P<0.05）。结论 HIF-1α增强表达的BMSCs经诱导分化后具有良好的成骨-成血管效应，为优化构建三维预血管化的骨组织提供实验基础。

关键词

低氧诱导因子-1α / 骨髓间充质干细胞 / 细胞膜片 / 预血管化 / 成骨-成血管耦联效应 / 骨组织工程 / 碱性磷酸酶 / 茜素红 / 骨桥蛋白 / 骨钙素