高糖通过氧化应激及线粒体DNA释放加重牙龈成纤维细胞的炎症反应

摘要

目的 探讨高糖（high glucose,HG）环境是否加重牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）引起的人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGFs）炎症反应及其机制，为糖尿病加剧牙周炎的机制提供依据。方法 将HGFs分为4组，分别为对照组（基础培养基）、LPS组（加入5µg/mL P.g-LPS培养24 h）、HG组（加入25 mmol/L葡萄糖培养24 h）、HG+LPS组（加入25 mmol/L葡萄糖+5µg/mL P.g-LPS培养24 h）。在以上处理的培养基中培养24 h后取细胞进行实验。用2’, 7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2, 7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）和MitoSOX Red染色分别检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）和线粒体活性氧（mitochondria reactive oxygen species,mtROS），并通过共聚焦荧光显微镜分析荧光强度和直接测量细胞悬液的荧光强度。使用免疫荧光法检测HGFs的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)含量变化。通过实时荧光定量PCR检测胞浆及细胞上清中mtDNA含量。蛋白质免疫印迹检测环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）-干扰素刺激因子（stimulator of interferon genes,STING）通路相关蛋白的表达，并通过实时定量PCR检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的mRNA的表达水平。结果 与对照组相比，LPS组和HG组中ROS与mtROS均显著上升，且在HG+LPS组中升高更加显著，呈协同增强效应（ROS:F=396.5,P<0.001;mtROS:F=29.38,P<0.001, CI<1）。胞浆mtDNA含量在LPS组显著升高，HG+LPS组升高更显著（F=27.85,P<0.001）。上清液mtDNA在LPS组和HG组中均显著升高，HG+LPS组升高更加显著（F=15.26,P<0.001）。cGAS-STING通路中的p-STING、p-TBK1、p-P65在LPS组和HG组中有不同程度激活，在HG+LPS组中激活程度最高（p-STING:F=52.67,P<0.001;p-TBK1:F=15.67,P=0.001;p-P65:F=9.83,P=0.005）,p-IRF3在各组间无显著差异（P=0.072）。促炎细胞因子TNF-α在HG+LPS组中显著高于对照组（F=15.05,P<0.001）,IL-1β在LPS组、HG组中均上升，HG+LPS组上升更显著（F=30.98,P<0.001）,IL-6在各组间无显著差异（P=0.847）。结论 高糖与LPS协同加剧氧化应激，其机制为mtDNA释放增加，激活cGAS-STING通路，导致HGFs炎症反应加重。

关键词

人牙龈成纤维细胞 / 高糖 / 牙龈卟啉单胞菌 / 脂多糖 / 氧化应激 / 线粒体DNA / 线粒体活性氧 / 环鸟苷酸-腺苷酸合成酶 / 干扰素刺激因子 / 炎症 / 细胞因子