人骨髓间充质干细胞衰老削弱其衍生凋亡囊泡的骨诱导特性

摘要

目的 探讨亲代人骨髓间充质干细胞（BMSCs）的衰老状态对其衍生凋亡囊泡（apoVs）骨诱导特性的影响，为基于apoVs的牙槽骨缺损及骨质疏松治疗提供实验依据及质量控制参考。方法 本研究通过连续传代构建衰老BMSCs(A-BMSCs)模型，以年轻BMSCs(Y-BMSCs)作为对照。在星形孢菌素诱导细胞凋亡后，分别从Y-BMSCs和A-BMSCs中提取apoVs(Y-BMSCs来源apoVs,Y-apoVs;A-BMSCs来源apoVs,A-apoVs)。首先对2种囊泡的表征（形态、粒径、电位、产量及蛋白标志物等）进行系统鉴定。随后，将Y-BMSCs分为增殖培养（PM）组、成骨诱导（OM）组、OM+Y-apoVs组和OM+A-apoVs组，通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色及实时定量PCR检测成骨相关基因runt相关转录因子2(RUNX2)、ALP、骨桥蛋白（OPN）及成骨特异性转录因子（OSX）的表达，评估其体外骨诱导效能。获得单位实验动物伦理委员会批准，利用18月龄的C57BL/6老龄小鼠模型验证使用红色荧光染料PKH26标记的2种apoVs的体内分布及骨诱导效能，将小鼠随机分为Control组（注射PBS）、Y-apoVs组（注射Y-apoVs）和A-apoVs组（注射A-apoVs），连续8周尾静脉注射apoVs，通过微计算机断层扫描和组织学分析评估其骨再生效果。结果 电镜及粒径分析显示，Y-apoVs和A-apoVs均呈典型的双凹圆盘状结构，粒径主要分布在100～500 nm;Western blot证实两者均高表达囊泡通用标志物（CD9、CD63、CD81）及凋亡标志物Fas。Y-apoVs和A-apoVs的形态无差异，两者在粒径、电位、产量及蛋白标志物表达差异上均无统计学意义。体外实验显示，与PM组相比，OM组、OM+A-apoVs组、OM+Y-apoVs组均能显著增强靶细胞Y-BMSCs的ALP活性及钙结节沉积，并显著上调RUNX2、ALP、OPN、OSX的表达（P<0.05）；且与OM组及OM+A-apoVs组相比，OM+Y-apoVs组的上述促进作用更为显著（P<0.05）。体内实验证实，尾静脉注射的apoVs可有效归巢至骨组织，且Y-apoVs组能更有效地改善老龄小鼠的骨微结构，显著提高骨矿物质密度及骨体积分数，其疗效优于Control组和A-apoVs组（P<0.05）。结论 亲代细胞的衰老状态显著削弱了BMSCs来源apoVs的骨诱导能力。Y-apoVs是治疗年龄相关性骨丢失的有效生物制剂。

关键词

骨髓间充质干细胞 / 细胞衰老 / 细胞外囊泡 / 凋亡囊泡 / 骨质疏松 / 骨再生 / 成骨诱导 / 无细胞治疗

基金资助

国家自然科学基金项目（82401060）; 国家资助博士后研究人员计划（GZC20230138）; 北京市自然科学基金项目（7222224）