植物病毒资源属性和应用基础研究进展

Current status and future prospects of plant viruses in biotechnological applications

摘要

病毒作为地球上最简单的生命形式，通过感染人、动物和植物等寄主产生传染性疾病。与其他微生物相比，病毒具有基因组小、复制量大、遗传操作简单等特点，具有很强的生物资源属性。过去几十年，对植物病毒的研究主要集中于解析其致病机制、植物的抗性机制及如何防控植物病害。但是随着研究的深入及概念的革新，人们发现植物病毒还具有很强的生物资源属性。随着分子生物学以及基因组、转录组、蛋白组学等技术的发展，越来越多的植物病毒被发现、改造和利用。本综述着重围绕植物病毒的资源属性与病毒载体的改造利用及其在生物工程方面的应用等最新研究进展，讨论其广泛的应用前景，挖掘其资源化的潜力。

Abstract

As the simplest and non⁃cellular life forms on earth， viruses cause infectious diseases by infecting human， animal and plant. Viruses are also regarded as important biological resources attributing to their small genome size， high replication capacity， and easy genetic engineering， compared with other forms of microorganisms. Researches were mainly focusing on identifying viruses as one major source of pathogens and how to prevent these plant viral diseases. Important progresses have been made in the last decade about their roles and mechanisms in ecosystems for plant viruses. Almost 80% of the biomass on earth is made of plants. Plant viruses affect multiple layers of healthy ecosystem on earth. Viruses are now recognized as playing important ecological roles in influencing many biological invasions and emerging infectious diseases. With the advancement of technologies in molecular biology， genomics， transcriptomics and proteomics， new viruses have been identified and novel viral vectors， virus⁃based bioreactors have been engineered for further biotechnological utilizations. The potential of bioresource utilization of plant virus and its application in bioeconomy are also discussed.

关键词

植物病毒 / 生物资源 / 生态功能 / 纳米材料 / 媒介昆虫 / 病毒表达载体

Key words

plant virus / bioresource / ecological function / nanomaterial / vector insect / viral expression vector

0 引 言

地球上数量最多的生物类群是病毒，大约有1×10³¹数量级，而形形色色的植物作为整个地球生态系统的主要生产者，其体内所寄生的植物病毒，是最早被发现的病毒类型，最近也被视为重要的生态因子，在生态系统中发挥重要作用。只有一小部分植物病毒侵染植物后会呈现出明显症状，这些病毒作为主要的致病病原影响寄主的正常生理代谢过程，使植物产生畸形病症甚至是死亡，导致严重的作物病害流行，影响作物的产量和品质^［1］。大部分植物病毒同其他病毒类型一样，在自然界中通过感染寄主间接影响生态环境中的其他生物，因此具有重要的生态调节功能^［2，3］。从19世纪首次发现植物病毒以来，人们对各种植物病毒的致病机理及其生态学功能进行了大量研究，例如通过探究其侵染寄主、复制增殖、媒介传毒等过程的机制，设计病毒病害防控手段；通过构建病毒载体，利用植物作为寄主和生物反应器，以表达外源蛋白或者病毒诱导基因沉默的方法，发展新颖的生物技术解决方案；通过研究病毒感染植物以后调控其他媒介、非媒介或其他微生物关系等相关机制，发现并鉴定其新的生态学功能，探索利用其功能属性，从而更好地创造性利用病毒^［4~6］。随着科学技术的发展，大量新的植物病毒被发现，病毒基因组的改造利用与生物工程应用是国际上的研究热点。越来越多的研究表明，植物病毒不仅是植物的病原因子，更具备重要的生态学功能。植物病毒生态功能研究随着不断革新的理论和技术提升正如火如荼地进行着。另外由于植物病毒独有的一些特性，如短时间内快速增殖的能力，促使人类不断改造其基因组，开发出更多具有新功能的病毒载体，并将其作为植物功能基因组学研究的工具。本文就植物病毒的资源属性，特别是病毒所发挥的生态学功能，以及植物病毒资源化利用的最新研究进展进行介绍及讨论，对植物病毒的生态功能及其资源化属性进行总结，以期促进人类对植物病毒的多方面利用，为植物病毒的变害为益启发新思路。

1 植物病毒生态功能研究进展

植物病毒生态学通过关注生态环境中植物病毒种群与其寄主及周围环境生物的互作现象及机理，结合前沿的技术手段，比如植物病毒小RNA、宏基因组、转录组测序等，解析其对环境中寄主及其他生物的直接或间接调控作用，以达到全面且深入地揭示其生态功能的目标^［7~10］。植物病毒作为非细胞的生命形式，一般只包含作为遗传物质的DNA （或RNA） 和蛋白质，极少数的植物布尼亚病毒包被囊膜，因此必须寄生在其他细胞生物体内从而完成自身的增殖繁衍，比如植物、媒介昆虫、真菌和细菌等^［11］。因此，长期的进化过程使得病毒对其各种寄主实现了多样且精细地调控，从而对其周围的生态产生不可或缺的影响。目前关于病毒与环境生物互作的研究主要集中于植物病毒与寄主植物、植物病毒与媒介和非媒介昆虫、植物病毒与其他环境微生物间的直接或间接互作^［12］。同时，随着研究技术及理论的不断发展，宏数据分析技术也得到逐步充实并更新着我们对植物病毒的全面认识。植物病毒组的概念和技术正逐渐在国际舞台上展示其优势，并从更高更广的层面深入解析植物病毒的生态调控功能^［8，9］。

1.1 植物病毒与寄主植物的互作

生态环境中植物病毒对其寄主植物会产生有益或有害影响。在农业生态系统中，已鉴定了大量对各种重要农作物产量和品质具有严重威胁的植物病毒，如马铃薯Y病毒科（Potyviridae）病毒、双生病毒科（Geminiviridae）病毒等。因此，人类对于植物病毒的研究大多关注其有害的一面，比如关于植物病毒在寄主体内的增殖移动、与寄主的防御及反防御等过程的相关分子机理。科研人员也根据相关理论成果培育出一大批对植物病毒具有抗性的品种。例如，针对病毒增殖移动这些过程所需要的寄主因子，培育了相关隐性基因抗性品种；研究了高表达植物抗病毒免疫过程的抗性基因从而提高植物抗性等^［13~15］。同时也有许多研究表明，病毒在感染了某些植物后反而对寄主的生长和逆境耐受具有积极作用，即植物病毒可以帮助植物应对生物及非生物胁迫^［16］。例如黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus， CMV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus， TMV）侵染植物后可增强其寄主的抗旱能力^［17］；西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）可以通过调控植物挥发物从而间接抑制甲壳虫对植物病原菌的传播^{［18，19］}。植物病毒对寄主的综合效益才是我们考量能否最终利用其潜在资源属性的关键指标。如何减少其病理作用并保持有效的资源属性，是未来研究的方向，也为植物病毒的有效利用提供了重要保障。因此需要我们全面了解植物病毒与其生态环境中各种生物的互作关系，比如植物病毒⁃寄主⁃媒介⁃非媒介昆虫的多元互作，从而了解植物病毒对复杂生态环境的调控过程。

1.2 植物病毒改变媒介及非媒介昆虫行为与种群结构

植物不能像动物一样运动从而躲避病原微生物和害虫等的生物胁迫，大约80%的植物病毒需要通过媒介昆虫来实现其高效传播，一些植物病毒更呈现出与其媒介昆虫之间互惠的关系。因此，揭示植物病毒对生态环境中媒介、非媒介等调控机制，有助于我们更好地了解其生态作用，从而针对性地改造植物病毒、治理植物病害。关于植物病毒与其媒介昆虫的互作，可以分为直接互作或者通过寄主植物产生的间接互作。植物病毒与媒介的直接互作即感染病毒的媒介本身的生态适应性、生长发育特征及行为等变化，科学家们针对相关内容已进行了大量的研究报道^［12］。下面主要以植物病毒操纵寄主从而调控其媒介及非媒介这种更为复杂却典型的多元互作模式进行介绍。

由于植物病毒与媒介昆虫的互惠现象更容易引起田间病害的大爆发、大流行，因此科学家们更关注于这种互惠现象的机制研究，以期从分子生物学角度寻找有效的病虫害防控手段。例如，科学家对造成我国番茄产量严重损失的中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China virus， TYLCCNV）进行了系统且深入地研究，发现其卫星分子编码的βC1蛋白可以行使各种功能以操控寄主的多种途径（如寄主的代谢途径、泛素化途径、激素途径等），从而实现其与媒介昆虫烟粉虱的互惠共生，在促进自身传播的同时，有利于烟粉虱的种群增长^［20~22］。除了双生病毒科这种DNA病毒，其他的植物RNA病毒，如正番茄斑萎病毒科（Orthotospoviridae）的番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus， TSWV）及番茄环纹斑点病毒（tomato zonate spot virus， TZSV）也可以利用其编码的非结构蛋白NSs挟持寄主的MYC家族转录因子，从而降低其调控的趋避蓟马的萜烯类化合物的产生^［23］。这些研究结果表明，植物病毒（DNA或RNA病毒）操纵寄主增加寄主对其媒介昆虫的适合度是一种进化上的普遍机制。除了对其媒介昆虫的间接影响，植物病毒还可以利用寄主植物影响其非媒介昆虫。笔者所在实验室最新研究成果揭示了木尔坦棉花曲叶病毒（cotton leaf curl Multan virus， CLCuMuV）利用其致病因子βC1，挟持植物WRKY20转录因子来增强寄主对其媒介烟粉虱的适合度，同时抑制烟粉虱的主要竞争对手——棉铃虫和蚜虫的生长，从分子水平上解析了病毒通过调控植物免疫促进自身传播的机制，揭示了植物病毒的全新生态功能，并通过基因编辑技术鉴定获得了广谱抗病虫新靶点，也为“从分子水平解析植物病毒的生态功能从而设计绿色可持久的防控策略”这一目标提供了一个成功案例^［24］。

1.3 植物病毒与其他微生物的间接互作

在其漫长生活史中，自然环境中的植物通常被多种病原微生物所感染，如两种以上的植物病毒，甚至是植物病毒与植物病原真菌、细菌等的共同侵染。不同的病原物在同一寄主中可能相互协生抑或相互拮抗。因此，揭示这些病原微生物在共侵染植物时的直接或间接互作现象及机制，有助于我们创新性地开发抗病害策略，如利用减毒病毒株作为疫苗的原理，从而实现植物病毒的定向改造使其抵御其他植物病害。

目前关于植物病毒与其他病原微生物的互作主要分为植物病毒⁃植物病毒互作，植物病毒⁃植物病原细菌或真菌互作。植物病毒互作主要分为协同作用、干扰作用和交叉保护作用^［11］。植物病毒间的协同作用主要指两种或多种异源植物病毒侵染同一寄主时能够比单种病毒侵染产生更严重的病症。研究表明，病毒共侵染往往能产生更严重的作物病害及人类流行病的爆发，越来越多的数据表明共侵染不仅是普遍的，更具有流行、生态及进化上的重要性^［25~27］。因此深入研究其协同机制有助于我们针对性地阻止或打破其协生关系，从而有助于高效地预警及控制植物病毒病害的爆发。目前，应用植物病毒来防治植物病毒病的策略主要来自于病毒间的干扰作用及交叉保护的研究。自1929年McKinney发现植物病毒的干扰作用后，美国学者就提出了利用病毒弱毒株系来防控植物病毒病的设想，即用弱毒株系侵染寄主植物从而保护其免受近缘的强毒株系感染的现象，这就是植物病毒的交叉保护作用。通过该原理降低植物病毒病害发病率已经在田间试验中取得了一系列可观的成效^［28］。研究表明，类似于植物病毒的这种交叉保护作用，被植物病毒感染过的植物不仅对于其他的植物病毒，对植物病原细菌和真菌的侵染同样可以有效抵抗^［29~31］。Kathiria等^［29］研究表明，感染病毒的植株后代呈现增加的同源基因重组频率以及更高水平的抗性基因表达和胼胝质累积，使其能显著抵抗病毒、细菌及真菌病害。这进一步验证了“通过植物病毒特定处理可以使植物表现出高效的广谱抗性”这一理论的可实践性。因此，深入研究植物病毒与寄主及其环境中其他生物的互作现象及机理，有助于我们更加明确地定向改造植物病毒，使其更好地为人类利用。

由于自然环境的复杂性，在深入解析生态环境中植物病毒与其他生物的两者或三者互作的基础上，更需要我们不断更新研究技术，扩展科学思维，去探寻更复杂的互作关系，比如植物病毒⁃寄主⁃媒介⁃非媒介⁃环境微生物等的多元互作，从而在更接近复杂的自然环境的条件下来揭示植物病毒的生态功能，实现其功能的定向改造，即减弱其有害的一面，充分扩大其有益的一面。目前，新的研究技术及理论已经渗入到对植物病毒生态功能的研究，通过病毒宏基因组测序、转录组分析等技术可以全面分析病毒在不同生长环境中自身以及与其他生物的相互作用^{［8，9，32］}。人类已经实现了对植物病毒的实验室功能改造和不断优化，使其作为各种功能载体，如表达载体、基因编辑载体、“递送”载体等，这无疑增加了我们对植物病毒载体优化利用的信心。

2 植物病毒资源化利用

2.1 植物病毒载体表达外源基因产物

利用植物病毒载体可以表达各种外源基因，转化到相应寄主从而产生各种基因工程产物，如疫苗、蛋白及各种药物等^［33~35］。目前关于植物病毒介导的利用植物瞬时表达各种基因工程产物已经有很多应用。相对于转基因植物来说，植物瞬时表达具有适用范围广，生产时间短，产量高等优势^［33］。植物病毒作为植物侵染病原之一，因其高效的复制增殖及侵染能力而被广泛关注。因此当植物病毒被发现后，在不到100年的时间内，科学家的探索便从揭示其致病机制转向挖掘其生产利用价值，改造其基因组使其定向地为人类所用。

改造植物病毒载体使其更加稳定高产地表达各种目标产物经历了几代革新。比如由最开始的将整个病毒的部分基因，如衣壳蛋白（coat protein，CP）基因与目的基因置换使其表达外源基因产物；到对病毒基因组进行重塑，即只保留病毒关键“复制子”单元，使其能稳定高效表达^［36］；同时发展了由病毒直接侵染或由农杆菌介导侵染等不同表达方式^［34］；并且由于不同植物病毒的寄主限制性又开发设计了不同应用范围的植物病毒表达载体，比如能在葫芦科作物、谷类作物中特异表达的载体^{［37，38］}。改造的这些植物病毒载体被广泛地应用于实际生产及生物医学研究中，为植物病毒的资源化利用提供了广阔前景。例如，通过重组TMV基因组，向其衣壳蛋白loop区第155到第156个氨基酸编码序列中插入流感病毒A 的M2e多肽编码序列，考虑到外源多肽的半胱氨酸残基可能会影响嵌合病毒的包装效率，研究者将M2e上的半胱氨酸突变成丙氨酸或者丝氨酸，形成改造病毒载体 TMV⁃M2e⁃ala和 TMV⁃M2e⁃ser，重组病毒在植物中高效表达流感病毒A的M2e抗原表位，其产生的抗体对流感病毒M2e的特异性远高于对TMV载体粒子的特异性，而且可以有效抵抗多种同源及异源流感病毒，有望被开发作为新一代的候选疫苗生产方案^［39］。除了表达抗原表位用于疫苗生产，植物病毒载体还被改造用于产生各种抗体，Prokhnevsky等^［40］基于甜菜黄化病毒（beet yellows virus， BYV）的改造载体，使其融合表达抗炭疽杆菌（Bacillius anthracis）抗体的重链和轻链，能够在新鲜的植物组织中获得浓度约为300 mg/kg的全长功能性抗体。

2.2 植物病毒载体编辑或沉默寄主基因

除了作为表达载体，植物病毒也被改造并应用于编辑寄主基因（沉默、突变、修饰等）以达到研究基因功能、培育抗性品种等目的。众所周知的病毒诱导的基因沉默系统（virus⁃induced gene silencing，VIGS），尽管其最初的发现是源于植物对病毒转录后水平的抗性机制研究，目前科学家已经根据其原理改造植物病毒实现了高效且稳定的沉默寄主基因的策略，并广泛应用于各种基础理论研究。关于植物基因沉默，相对于传统的稳定遗传转化系统，VIGS具有耗时短，效率高，操作简单，可操作寄主范围广等诸多优点^［41］。目前人们已经设计出了针对单子叶、双子叶等不同寄主的DNA或RNA植物病毒VIGS载体^［42~44］。例如基于烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）设计的被广泛应用于沉默模式植物本生烟草（Nicotiana benthamiana）系统，已经被用作研究植物基因功能的常见工具^{［45，46］}。基于此，各种DNA植物病毒也被开发用于不同寄主的基因沉默，例如双生病毒科TYLCCNV的卫星分子经改造后可以沉默心叶烟（N. glutinosa）、普通烟 （N. tabacum）及番茄 （Lycopersicon esculentum）的内源基因，这对不同植物基因功能研究提供了巨大便利^［47］。改造的植物病毒载体除了可以应用于基因沉默以外，还可以用来调控miRNA功能。模拟靶序列技术是近些年新开发的一种利用miRNA模拟靶序列去干扰寄主体内miRNA功能，从而研究植物miRNA功能的一门技术^［48］。目前已经对多种植物病毒如CMV、TRV等进行改造使其成为miRNA模拟靶序列的表达载体^{［49，50］}。研究表明，植物病毒载体表达的模拟靶序列可以降低病毒在寄主体内的积累量，基于此，有望建立抗植物病毒新方法^［51］。

研究寄主基因的功能，除了沉默该基因以外，也经常需要对研究对象进行突变、修饰等以便更加明确地鉴定其生物功能，寻找基因中的关键作用位点。因此基于细菌抵抗噬菌体原理的CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats ［CRISPR］/CRISPR associated endonuclease 9 ［Cas9］）技术应运而生。利用植物病毒改造载体来运送该系统中的基因编辑元件可以很好地解决寄主植物对外源DNA抑制表达的问题，并且可以实现精确地运送CRISPR/Cas9元件到寄主靶基因位置进行稳定表达，从而使其在植物体内顺利行使功能。目前科学家们正致力于改造植物病毒载体，以此实现对CRISPR/Cas9技术的效率提升。Baltes等^［52］首次报道了利用双生病毒作为CRISPR/Cas9的辅助载体，成功实现了植物基因编辑并且培育出基因编辑的植物愈伤组织和小植株。随后，越来越多基于植物病毒（DNA或RNA病毒）的CRISPR/Cas9载体被不断地改进并且成功应用^［53~55］。Mahas等^［56］最新发展了一套基于TRV介导的基因编辑系统，成功地实现了对本生烟基因的定向编辑功能，该研究指出该系统可以对任何能侵染TRV的寄主进行编辑，并且该技术可以适用于其他RNA植物病毒改造，因此应用相似的策略我们可以针对其他的植物病毒设计相应的植物病毒基因编辑系统，从而实现对不同植物的高效定向基因编辑。

2.3 植物病毒在纳米材料技术上的应用

纳米技术是最近20年来迅速兴起的领域，人们试图通过纳米尺度的粒子进行各项基础与功能应用研究。大部分的植物病毒都在10~100 nm的尺度之间，使其成为改造纳米材料的优质选择。改造的植物病毒元素除了被广泛应用于理性设计的生物纳米材料、储能生物电极、生物压力传感器等多种生物基器件外；在基础科学研究中，科学家也将其运用到生物技术层面以期解决各种理论研究及生物医学、实际生产等问题^［57~62］。植物纳米病毒是最新兴起的一个概念，主要是利用纳米级植物病毒的物理及化学性质，通过对病毒粒子表面或者内部进行修饰改造，从而开发出一系列的生物技术应用产品。最早被发现的植物病毒TMV被广泛用于纳米材料研究。长棒状TMV病毒粒子由多个单一片层组成，单个片层单位又由34个CP组成外径18 nm，高5 nm，中空4 nm的结构。这一极其稳定的结构是纳米器件改造利用的优质选择。通过在外表面和中空内核进行化学修饰，获得了大量新特性的纳米材料。例如通过基因突变方法将CP第103位的苏氨酸改为半胱氨酸，利用新引进的半胱氨酸（T103C）上的巯基形成蛋白亚基间的二硫键（S-S），从而可以被纳米金颗粒特异结合，进一步加工形成各式的纳米器件^［63］；结合抗菌特性，TMV纳米材料利用光动力抗菌的原理，将修饰的烟草花叶病毒CP与具有聚集诱导发光性质的元件进行组装，从而形成高效的光动力抗菌纳米粒子^［64］；亦或是将杀虫剂与能够深入土壤的病毒粒子结合实现高效杀虫，大大减少了杀虫剂的使用量^［65］。类似的原理我们可以寻找符合期望的植物病毒使其搬运各种物质到达一般方法无法触及的地方去行使相应的功能。由于植物病毒对人类一般是无害的，我们也可以通过植物病毒纳米粒子携带药物，探索新的治疗各种人类疾病的方法^［66］。Carignan等^［67］基于木瓜花叶病毒（papaya mosaic virus， PapMV） 研制的棒状病毒样纳米颗粒被证明是一种Toll样受体——TLR7的激动剂，有望被应用于癌症免疫治疗。Lizotte等^［68］研究发现，二十面体的豇豆花叶病毒（cowpea mosaic virus， CPMV）纳米样颗粒能有效激发小鼠机体对肿瘤的免疫反应。此外，完整的病毒颗粒与外壳蛋白自组装的纳米颗粒具有同等的抗肿瘤效果。

除了生物医药学的应用，多种植物病毒，如TMV和CMV等通过改造作为纳米支架也可以被广泛用于工程应用研究^{［69，70］}。美国马里兰大学的科研人员利用TMV的CP开发了采用临时毛细管微流体和生物纳米结构制备出的超级电容器电极，可以大幅度提高电容量。他们采用光刻法在基底上构建梳状的铬⁃金电极对，并将光刻胶保持适当位置，然后经过等离子体处理后，吸引含有TMV的CP悬浮液的颗粒在金表面自动组装，从而克服了原先TMV纳米材料组装时间长、定位困难的难题^［70］。由此可见，植物病毒作为工程应用的基础原器件，具有巨大的开发应用潜力^［71］，不管是从分子水平还是从病毒粒子水平，都可以经过一定的修饰改造从而为人类所利用。

3 总结及展望

植物病毒占据重要的生态地位，不仅可以对其植物寄主产生重要影响，而且会直接或是通过其寄主间接影响其他环境生物。随着技术发展及概念创新，植物病毒有益的功能属性逐步刷新着人们对其的认知，其所发挥的重要生态功能也越来越多地被关注。植物病毒在实验室研究中的成功定向改造为我们实现其生态功能的改造提供了很大信心。未来的研究应该致力于开发应用植物病毒这种便利高效的科研工具，并且结合前沿理论及技术，例如各种宏数据采集分析技术、植物病毒纳米材料这种跨学科领域技术等，来帮助我们更系统性、深入性地研究植物病毒的生态功能，从而更大限度地开发利用其资源属性，实现以植物病毒来管理植物甚至是生态健康。

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基金资助

国家自然科学基金重点项目(31830073)

国家自然科学基金优秀青年基金(31522046)

中国科学院STS项目广西甘蔗产业科技专项(KFJ-STS-QYZD-199)