水产虾蟹microRNA组学研究进展

Research progress on microRNA omics in shrimp and crab

摘要

MicroRNA是一类广泛存在于真核生物，长度约为18~25个核苷酸的非编码RNA，对靶基因转录后的调控具有重要作用，广泛参与生长发育、免疫、增殖和凋亡等各种生物学过程。本文简要总结了microRNA的生成、调控机制及其检测方法，讨论了虾蟹microRNA对免疫调控、生殖发育、环境胁迫三方面的调节作用，以期促进对虾蟹microRNA研究现状的了解以及为microRNA在虾蟹免疫、生殖发育和应对环境胁迫的调控机制研究提供参考。

Abstract

MicroRNA（miRNA） is small non⁃coding RNA of 18~25 nucleotides， which widely exists in eukaryotes. It plays an important role in the post⁃transcriptional regulation of target genes and is widely involved in biological processes such as growth and development， immunity， proliferation and apoptosis. In this review， the generation， regulation mechanism and detection methods of microRNA are summarized briefly， and the regulation of microRNA in immunity， reproductive development and stress regulation are also discussed. This paper summarizes those results and benefits the understanding of the present situation of the microRNA research in shrimp and crab， and may be helpful for the promotion of the study in non⁃coding RNA.

关键词

microRNA组学 / 虾蟹 / 免疫调控 / 生殖发育 / 环境胁迫

Key words

miRNAomics / shrimp and crab / immune regulation / reproductive development / environmental stress

0 引 言

MicroRNA（miRNA）是长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA，是在基因转录后对其进行表达调控的重要调控因子。第一个miRNA是在研究秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）时被发现，并命名为lin⁃14^［1］，Reinhart等^［2］发现let⁃7可能对秀丽隐杆线虫的生长发育存在调控作用；甲壳动物中对miRNA的相关研究较少，最早是对作为甲壳动物研究的模式动物——蚤状溞（Dahnia pulex）的研究，通过测序，发现35种miRNA ^［3］。miRNA是参与多种生理调控的调节因子，本文对miRNA在甲壳动物虾蟹免疫、繁殖、生长等方面的研究进行了综述。

1 miRNA的产生及其作用机制

在真核生物中，miRNA首先通过RNA聚合酶Ⅱ，从基因组进行转录作用，形成长度几百至几千nt的前体转录本（pri⁃miRNA）；然后，在细胞核内pri⁃miRNA的茎环发夹结构被微小RNA处理器识别切割（微小RNA处理器是由RNA聚合酶III（Drosha）和辅助蛋白DGCR8/Pasha形成的复合体），产生60~80 nt的miRNA前体（pre⁃miRNA），在输送蛋白（Exportin⁃5）的介导下，pre⁃miRNA从细胞核转运到细胞质；最后，由RNA酶III家族的Dicer酶进行切割加工形成长度为21~24 nt的成熟miRNA，成熟miRNA的功能链与Argonaute（Ago2）蛋白质一起被加载到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，发挥沉默效应^［4，5］。在形成沉默复合体后，沉默复合体在miRNA的引导下靶向特定的mRNA区域，miRNA通过与靶标基因的3’⁃非翻译区（3’⁃UTR）互补，抑制mRNA表达或直接裂解mRNA。mRNA被抑制表达或被裂解主要在于miRNA与mRNA的互补程度，当完全配对时，mRNA即被miRNA降解，这种调控机制普遍存在于植物细胞；不完全配对时，miRNA可导致mRNA的稳定性降低或抑制其翻译，这种机制在动物细胞中被发现。通过研究发现miRNA也可与靶基因的编码区、5’⁃非翻译区（5’⁃UTR）和启动子区相结合并发挥作用^［6，7］。

2 miRNA的检测方法

miRNA 在多种生命活动中发挥着重要作用，也是多种生物机制中不可或缺的一员，随着对miRNA研究的深入，出现了越来越多的miRNA检测方法。检测miRNA的传统方法为miRNA克隆、印迹杂交技术（northern blotting）、微列阵芯片和定量⁃逆转录PCR法（qRT⁃PCR）^［8］。miRNA克隆是借助PAGE分离出长度约22 nt的RNA，将其连接到5’适配子和3’适配子上，再经过反转录和PCR，对PCR产物进行克隆，最后进行比对和验证^［9］；印迹杂交技术广泛应用于miRNA表达量的检测，首先通过变性凝胶对miRNA进行分离，然后将靶miRNA转移并固定到尼龙膜或硝酸纤维薄膜，和被标记的DNA探针进行杂交，最后利用显影来进行检测^［10］；微列阵芯片是将多个能够与目标miRNA进行序列互补的探针固定在芯片上，与被标记的miRNA进行杂交，最后经过信号检测，得到miRNA的分析表达谱^［9］；qRT⁃PCR是首先将miRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行PCR，在PCR反应中加入荧光基因，通过检测荧光信号的积累量来完成miRNA的定量分析^［11］。传统的检测方法虽然应用广泛，但其普遍存在灵敏度低，特异性差等问题，为解决这些问题，也兴起了一些新检测方法，如高通量测序技术^［12］、等温指数扩增法^［13］（exponential amplification reaction， EXPAR）、环介导等温扩增^［14］（loop⁃mediated isothermal amplification， LAMP）、滚环扩增^［15］（rolling circle amplification， RCA）、链置换扩增反应^［16］（strand displacement amplification， SDA）、解旋酶依赖性扩增法^［17］（helicase⁃dependent amplification， HDA）等，其中，高通量测序技术具有高质量、高通量、低成本的优点，其不仅能识别miRNA，而且还可为我们提供有关其表达水平信息的有效方法，极大地推动了虾蟹miRNA的研究进展（表1）。后期，在对miRNA靶基因进行功能验证时，我们通常会采用RNA干扰技术、基因敲除等方法来验证靶基因的功能。

3 miRNA在水产虾蟹中的研究

虽然关于虾蟹中miRNA的研究较少，但这些科学发现也为miRNA在甲壳动物中的调控作用研究奠定了一定的理论基础，以下将从免疫、生殖发育、胁迫调节三个方面来阐述miRNA在虾蟹的生理调节中具有怎样的作用。

3.1 miRNA与免疫

miRNA已确定为免疫细胞发育和功能以及疾病发病机理的关键调节因子，通过近年来的研究如对克氏原螯虾（Procambarus clarkii）研究^［18］，对其独特的调控网络也有了一定的了解，其中miRNA通过对靶蛋白浓度的调节来完成对免疫系统的高度调控^{［19，20］}。无脊椎动物免疫为先天性免疫，主要是通过细胞免疫和体液免疫来应对病毒和细菌等病原的侵染，科学家们在刺参（Apostichopusjaponicus）^［21］、栉节扇贝（scallop Chlamys farreri）^［22］和牡蛎（Crassostrea rivularis）^［23］等无脊椎动物的研究中发现并鉴定了上百个与免疫调节相关的miRNA。如表2所示，在虾蟹动物中miRNA通过靶向靶基因或对象来发挥自己的调控作用。Li等^［24］通过高通量技术对感染和未感染副溶血弧菌的拟穴青蟹（Scylla Paramamosain）进行研究发现，共有161个差异表达miRNA，其中miR⁃146，miR⁃132和miR⁃155显著上调，miRNA let⁃7家族中let⁃7k、let⁃7b⁃5p、let⁃7h、let⁃7a下调，这表明这些miRNA 可能在拟穴青蟹的先天免疫中起到重要作用。中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）在白斑综合病毒（WSSV）侵染过程中，miR⁃7和miR⁃217过表达可以增强WSSV病毒的复制，使WSSV 病毒对宿主的侵染速度加快^{［25，26］}。Ou等^［27］对健康和感染螺原体（Spiroplasma）的中华绒螯蟹的血细胞进行测序分析，确定了735种独特miRNA，其中228种独特miRNA存在明显的差异表达。miRNA在甲壳动物防御细菌与病毒感染中有着不可或缺的作用，但关于miRNA在甲壳动物应对寄生虫感染的免疫作用知之甚少，通过研究发现，在受到寄生性病原血卵涡鞭虫（Hematodinium parasites）攻击后，在肝胰腺中差异表达51个miRNA，对其假定靶基因进行分析表明，差异表达的miRNA可介导免疫相关途径和信号转导途径^［28］。

虾作为我国重要的经济物种，目前却缺乏其完整的基因组序列，研究者对其miRNA的了解也停留在初步阶段，周亚东^［29］通过对大西洋中脊盲虾（Rimicaris exoculata）的肌肉组织进行高通量测序，发现101条保守miRNA和34条特有miRNA，在甲壳动物中也首次发现mir⁃2001、mir⁃83和mir⁃235；通过高通量测序技术在对虾中鉴定到不同数量的保守和新miRNA，也发现了与WSSV感染相关的miRNA，扩展了甲壳动物基因调控的知识，为虾类中病毒感染的免疫研究提供了线索^{［30，31］}。

miRNA在虾体应对细菌及病毒的侵染时发挥着关键作用。研究发现，共有24个miRNA对吞噬作用、细胞凋亡有一定的影响作用，其中21种miRNA在动物中保守，表明这些miRNA在不同动物物种中可能具有相似或相同的功能^［32］。Yang等^［33］发现沉默miR⁃100使其不进行表达，可导致虾血细胞凋亡活性提高，虾中病毒基因组拷贝减少和病毒感染的虾死亡率下降，表明miR⁃100可介导细胞凋亡途径；miR⁃100也可能通过调节吞噬作用和酚氧化酶（PO）活性来促进虾的抗弧菌免疫反应，并在一定水平上影响WSSV感染的进程^［34］。对南美白对虾（Litopenaeus vannamei）受到副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）侵染组和非侵染组进行高通量测序分析发现，共有83个miRNA（上调47个，下调36个）差异表达显著，而这些miRNA预测得到222个靶基因，对miRNA的靶基因进行功能富集分析，发现靶基因参与了多种生物过程，包括代谢途径，霍乱弧菌感染等^［35］。Zhu等^［36］通过研究发现，与未感染虾相比，在受到溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）侵染24 h和48 h后的组织中，总共有55个miRNA出现表达差异，其中大多数miRNA在24 h和48 h时下调。在病原菌侵入虾体的过程中，miRNA可以通过调控细胞的凋亡和吞噬作用来进行防御，研究表明在虾受到侵染的不同阶段时miRNA出现差异表达，这些miRNA可能调节某些免疫通路中的免疫因子来进行免疫作用。

miRNA通过控制宿主与病毒之间的相互作用来控制病毒对宿主的侵染，病毒miRNA可以与宿主细胞相互作用，使病毒逃脱免疫反应，但对病毒与宿主细胞miRNA的相互作用机制的研究还处于初步阶段^{［37，38］}。白斑综合病毒（WSSV）为虾种中的强致病性病毒，通过对在自然感染和实验感染的组织进行测序，共鉴定出23 365个已知miRNA和481个新miRNA，在表达量高的miRNA中，仅miR⁃210和与免疫通路相关的miR⁃29b在两种条件下的感染虾中共表达，虾体miRNA mja⁃miR⁃6489⁃3p也被发现靶向WSSV的早期病毒基因wsv001^［39］；在正常和WSSV感染条件下的南美白对虾中鉴定出8个miRNA差异表达，差异表达的miRNA的目标基因与免疫力、细胞凋亡和发育功能有关^［40］；正常毒力和低毒力（10⁶ copies/mL）的WSSV侵染南美白对虾，与低毒力感染文库相比正常毒力感染文库中有16个miRNA显著上调，21个miRNA显著下调，其中，Igi⁃miR⁃1175⁃3p是最显著不同的miRNA，其次为bmo⁃miR⁃1175⁃3p和ipu⁃miR⁃26b，Igi⁃miR⁃1175⁃3p、bmo⁃miR⁃1175⁃3p 与细胞功能密切相关，ipu⁃miR⁃26b可能通过靶向磷脂酰肌醇4⁃激酶α亚型来介导信号通路^［41］。抑制miR⁃10a和 miR⁃1959的表达，可能能够减少WSSV病毒在虾体内的拷贝数^{［42，43］}。Zhao等^［44］通过研究发现，miR⁃7和miR⁃184在红螯螯虾（Cheraxquadricarinatus）的免疫调节中起关键作用；在感染WSSV的斑节对虾（Penaeus monodon）血细胞中，鉴定出46个miRNA，miRNA靶向预测显示，miRNA靶向于一些免疫相关基因如编码抗菌肽、信号转导蛋白、凋亡相关蛋白、氧化应激蛋白、蛋白酶或蛋白酶抑制剂基因^［45］；pmo⁃miR⁃315、miR⁃9041和miR⁃9850可促进WSSV的复制，可进一步加剧WSSV 对寄主的感染^{［46，47］}，而mja⁃mir⁃35具有抑制WSSV感染活性的作用^［48］；采用高通量技术，对感染WSSV的中国对虾肝胰腺进行测序分析，共鉴定出129个已知miRNA和44个预测的新miRNA，25个miRNA在WSSV感染后有显著差异^［49］。

日本囊对虾（Marspenaeus japonicus）的miRNA研究较多集中在WSSV病毒，Huang等^［50］对在感染不同时间（0、6、24和48 h）WSSV的日本囊对虾进行测序，鉴定出63个宿主miRNA，其中48个保守miRNA，有31种在对病毒感染的反应中差异表达，其中25种上调，6种下调。宿主可通过吞噬作用和细胞凋亡来防止病毒的入侵，通过研究发现miR⁃71和miR⁃13b对于WSSV病毒感染和宿主自噬是必需的，且与宿主自噬和WSSV病毒感染都呈正相关关系^［51］； miR⁃12和miR⁃S5通过触发宿主吞噬作用和细胞凋亡来抑制WSSV的入侵，在虾体内miR⁃1对吞噬作用也具有重要作用^［52~54］；miR⁃1000的过表达和沉默可以导致虾凋亡活性和WSSV感染能力的变换，表明miR⁃1000通过靶向p53对细胞凋亡和病毒感染产生了重大影响，miR⁃1000也可以通过同时触发两个病毒mRNA（wsv191和wsv407）的降解来抑制WSSV病毒的入侵^{［55，56］}。Huang等^［57］通过研究共鉴定出89个预测的WSSV miRNA，也发现病毒miRNA WSSV⁃miR⁃N24可以抑制虾体内血细胞的凋亡，促进虾体内WSSV的拷贝。miR⁃965可以通过靶向虾ATG5（自噬相关5）基因来促进虾对病毒的吞噬作用，抑制WSSV病毒感染^［58］；病毒基因组编码的病毒miRNA已成为病毒—宿主相互作用的重要调控因子，研究发现对WSSV编码的miRNA （WSSV⁃ mir ⁃22）可以通过靶向宿主STAT基因并使其沉默，促进虾WSSV感染^［59］；Huang等^［60］发现miR⁃7在对WSSV感染的反应中被上调，并且miR⁃7可以靶向WSSV早期基因wsv477，表明miR⁃7参与了病毒DNA复制；dcp1⁃dcp2复合物可促进WSSV对虾的感染，WSSV⁃miR⁃N46 和 miR⁃87分别能抑制dcp1和dcp2的表达，从而影响病毒感染^［61］。 miR⁃34在WSSV感染期间被上调，表明其具有抗病毒活性^［62］；研究表明WSSV⁃miR⁃N13和WSSV⁃miR⁃N23这两个病毒miRNA可通过调节Dorsal表达，来抑制虾体内的Spz⁃Toll⁃Dorsal⁃ALF信号通路的免疫作用，促进病毒感染^［63］。WSSV⁃miR⁃66和WSSV⁃miR⁃68可促进WSSV对虾的感染而WSSV⁃miR⁃N32抑制WSSV对虾的感染^{［64，65］}。

3.2 microRNA与生殖发育

水产动物性腺生长发育极大地影响着个体生长、数量和经济效益问题，miRNA通过靶向mRNA分子可抑制基因表达，并在调节许多基本生物学功能（包括细胞分化、发育、生长和代谢）中发挥重要作用^［66］。miRNA也参与水产动物性腺的发育过程，miR⁃24主要在大西洋庸鲽（Atlantic halibut）精巢中表达，miR⁃24的靶基因为kiss1r⁃2，kiss1r⁃2参与调控脊椎动物性腺的发育，miR⁃24可以抑制kiss1r⁃2的表达，表明miR⁃24可能调节大西洋庸鲽精巢的发育^［67］。Song等^［68］首次从中华绒螯蟹卵巢小RNA转录物中鉴定出大量miRNA，其中miR⁃2和miR⁃133在卵母细胞减数分裂成熟过程中表现出差异表达，并可调控蟹cyclin B基因3’⁃UTR的活性，并可抑制细胞周期蛋白B的翻译。对拟穴青蟹的睾丸和卵巢中6个差异表达的新型miRNA及其与繁殖相关的假定靶基因的进一步分析发现，miRNA和假定靶基因在性腺成熟期间均显示阶段特异性表达，表明它们在性别分化和生殖发育中的潜在调控作用^［69］；Jia等^［70］在拟穴青蟹睾丸和卵巢中鉴定出共表达了514个独特的miRNA，108个表达差异miRNA，睾丸中表达13个miRNA，在卵巢中仅表达2个miRNA，共表达93个miRNA。对差异表达的五个miRNA（spa⁃miR⁃9c，⁃279e，⁃263a，⁃263b，⁃9）进行靶基因预测，筛选出许多受miRNA调控性腺发育相关的基因，例如FAMET，VASA，Sox基因，表明，miRNA对拟穴青蟹的性腺的发育具有重要的调节作用。Meng 等^［71］分别从卵巢和睾丸中获得187个和225个miRNA，卵巢和睾丸共表达的6个最丰富的miRNA为let⁃7、let⁃7c、let⁃7f、mir⁃2、mir⁃184和mir⁃276，表明这些miRNA可能在性腺的发育和功能中发挥重要作用，对75个差异表达miRNA进一步分析发现， 其在卵巢和睾丸发育过程中表现出阶段性特异性表达，提示其在生殖发育中存在某些潜在作用，但对其调控机制的研究还需进一步深入。对中华绒螯蟹的睾丸组织进行测序分析发现，mir⁃17⁃3p在精原细胞分化过程中受到高度调节，暗示mir⁃17⁃3p可能在精原细胞分化的过程中发挥作用^［72］。

miRNA对虾的性别分化和性腺发育也可能存在调控作用，发现aca⁃miR⁃30b⁃5p， ame⁃miR⁃263b和cfa⁃miR⁃125a及其预测靶点的DEGs可能对日本沼虾（Macrobrachium nipponense ）的性别分化和性别决定有很强的影响^［73］；Jin等^［74］对日本沼虾性腺进行研究，共鉴定1 077个miRNA，对其预测的靶基因进行功能分析，也发现了一些潜在的与性别相关的miRNA。在斑节对虾的未发育卵巢组织和已发育卵巢组织之间发现43个差异表达的miRNA，对这43种miRNA所预测的4 102个靶基因，通过（KEGG）数据库进行聚类，获得了与卵巢发育有关的四个特定途径^［75］。通过研究发现bmo⁃miR⁃316⁃5p，ame⁃miR⁃125，dmo⁃miR⁃278和tca⁃miR⁃3885⁃5p在卵巢不同发育阶段可能具有调控作用^［76］。性别分化和性腺发育对于虾蟹的科学育种具有重要意义，通过研究发现miRNA在虾蟹的生殖发育存在调控作用，进一步加强miRNA在生殖发育中调控机理的研究对我们经济虾种和蟹种的养殖、育种具有重大意义。

3.3 miRNA与胁迫调节

miRNA不仅在虾蟹的免疫、生殖发育方面存在调节作用，在虾蟹适应外界环境变化时也发挥着调控作用，但miRNA的调节机制尚不清楚，在低盐条件下，太平洋牡蛎中的miR⁃1984、miR⁃92⁃3p表达量升高，miR⁃183、miR⁃2353 和miR⁃184⁃3p 的表达水平降低^［77］；对三疣梭子蟹处低盐胁迫下的组织进行测序分析发现，miRNA在其适应低盐环境机制中发挥着重要作用^{［78，79］}。Wang等^［80］研究拟穴青蟹在盐度突然下降时的miRNA表达谱，共鉴定出7个已知miRNA和43个新miRNA，18个差异表达miRNA，通过对差异表达miRNA预测所得的14 951个靶基因进行GO（Gene Ontology）分析发现，盐度从23‰突然下降到3‰时，与细胞过程相关的基因为578个，与代谢过程相关的基因有523个，与单细胞过程相关的基因为422个；KEGG通路分析表明，14条通路与氨基酸代谢有关，在渗透调节中起重要作用，说明miRNA通过调节靶基因来调整渗透压力和能量平衡，以适应盐度的突然变化。

虾的生存环境发生变化时，miRNA可能对其的适应调节中发挥重要作用。在铜离子胁迫下，发现4 524个已知miRNA和73个新miRNA，73个新miRNA存在显著差异表达，研究表明差异表达miRNA的靶基因与免疫防御、细胞凋亡和外源代谢有关，为深入了解南美白对虾抗环境胁迫的分子机制提供了有价值的信息^［81］。在中国对虾处于pH 8.2和pH 6.5 时，发现6个已知的miRNA和23个新miRNA 存在显著差异^［82］。 He等^［83］对处于28 ℃、冷适应16 ℃和常温的南美白对虾的肝胰腺组织进行测序，共鉴定出68个已知的成熟miRNA和47个新miRNA，表达分析表明，34个miRNA在冷适应反应中存在显著差异表达。在日本囊对虾处于热应激时，共鉴定出79个宿主miRNA，其中15个miRNA响应热应激而差异表达；此外，通过预测和分析来自WSSV的靶基因，总共获得了30个可能与白斑综合症病毒（WSSV）相互作用的宿主miRNA；也发现在热应激条件下，一些具有预测抗病毒能力的宿主miRNA被下调，表明宿主miRNA介导的抗病毒免疫反应受到抑制^［84］。南美白对虾在低氧胁迫下，共鉴定3 324个已知miRNA和8个新型miRNA，1 213个miRNA差异表达，并通过GO和KEGG富集分析进一步表明，差异表达的miRNA可能通过调节应激反应基因的表达来调节宿主对低氧的反应^［85］；在低氧环境下，通过对四个日本沼虾组织的miRNA芯片分析，发现存在880个共表达miRNA和39个特异性（25个常氧特异性和14个低氧特异性）miRNA，这些miRNA可能参与了对低氧环境的适应^［86］。虾蟹在应对环境胁迫时，机体也会相应的通过调节生物活动来适应环境的变化，在低氧、低温等环境中miRNA出现不同的表达水平，这也表明miRNA在虾蟹胁迫调节中发挥作用，这为我们进一步研究miRNA在机体的调控机制提供科学依据。

4 小结与展望

miRNA在机体中的各个生物机制中发挥着重要的调节作用，miRNA在甲壳动物虾蟹的免疫、生殖发育、应激调控以及其他生理过程中具有不可或缺的地位。虾蟹是我国重要的经济物种，我国作为虾蟹的养殖大国，随着养殖规模的不断扩大，频繁的贸易往来，虾蟹的病害也日益严重，造成了巨大的经济损失，深入研究miRNA在虾蟹免疫防御的调控机制，有助于对虾蟹免疫功能基因转录后的具体调控机制有更深入的了解， 也为后续我们对miRNA与长链非编码RNA（lncRNA）所可能构成的调控网络研究奠定基础；但是目前对虾蟹经济性状相关的研究还有待加强，例如研究与生长、经济性状相关的miRNA分子标记，将对虾蟹的择优育种具有重要意义。

参考文献

[1] Lee R C, Feinbaum R L, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene Lin⁃4 encodes small RNAs with antisense complementarity to Lin⁃14 [J]. Cell, 1993, 75(5): 843⁃854.

[2] Reinhart B J, Slack F J, Basson M, et al. The 21⁃nucleotide let⁃7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans [J]. Nature, 2000, 403(6772): 901⁃906.

[3] Wheeler B M, Heimberg A M, Moy V N, et al. The deep evolution of metazoan microRNAs [J]. Evol Dev, 2009, 11(1): 50⁃68.

[4] Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanism, and function [J]. Cell, 2004, 116(2): 281⁃297.

[5] Winter J, Jung S, Keller S, et al. Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation [J]. Nat Cell Biol, 2009, 11(3): 228⁃234.

[6] Lee I, Ajay S S, Yook J I, et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5′⁃UTR and 3′⁃UTR interaction sites [J]. Genome research, 2009, 19(7): 1175⁃1183.

[7] Castanotto D, Rossi J J. The promises and pitfalls of RNA⁃interference⁃based therapeutics [J]. Nature, 2009, 457(7228): 426⁃433.

[8] 景花,宋沁馨,周国华. MicroRNA定量检测方法的研究进展[J]. 遗传, 2010, 32(1): 31⁃40.

[9] Jing H, Song Q X, Zhou G H. Advances in approaches for the quantitative detection of microRNAs [J]. Hereditas, 2010, 32(1): 31⁃40.

[10] Lagos⁃Quintana M. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs [J]. Science, 2001, 294(5543): 853⁃858.

[11] 韦荣昌,赵欢,马小军,等. MicroRNA检测方法的研究进展[J]. 江苏农业科学, 2013, 41(9): 17⁃19.

[12] Wei R C, Zhao H, Ma X J, et al. Advances in approaches for the quantitative detection of microRNAs [J]. Jiangsu Agric Sci, 2013, 41(9): 17⁃19.

[13] 祝申蓉,吴旭日,陈依军. MicroRNA定量检测方法的研究进展[J]. 中国药科大学学报, 2015, 46(1): 40⁃49.

[14] Zhu S R, Wu X R, Chen Y J. Current progress in quantitative detection of microRNA [J]. J China Pharm Univ, 2015, 46(1): 40⁃49.

[15] 汤海明,陈红,张静,等.新一代测序技术应用于microRNA检测[J].遗传, 2012, 34(6): 784⁃792.

[16] Tang H M, Chen H, Zhang J, et al. Application of next generation sequencing in microRNA detection [J]. Hereditas, 2012, 34(6): 784⁃792.

[17] Jia H X, Li Z P, Liu C H, et al. Ultrasensitive detection of microRNAs by exponential isothermal amplification [J]. Angewandte Chemie Int Ed, 2010, 49(32): 5498⁃5501.

[18] Li C P, Li Z P, Jia H X, et al. One⁃step ultrasensitive detection of microRNAs with loop⁃mediated isothermal amplification (LAMP) [J]. Chem Commun, 2011, 47(9): 2595⁃2597.

[19] Cheng Y Q, Zhang X, Li Z P, et al. Highly sensitive determination of microRNA using target⁃primed and branched rolling⁃circle amplification [J]. Angew Chem Int Ed, 2009, 48(18): 3268⁃3272.

[20] Shi C, Liu Q, Ma C P, et al. Exponential strand⁃displacement amplification for detection of microRNAs [J]. Anal Chem, 2014, 86(1): 336⁃339.

[21] Ma F, Liu M, Tang B, et al. Sensitive quantification of microRNAs by isothermal helicase⁃dependent amplification [J]. Anal Chem, 2017, 89(11): 6182⁃6187.

[22] Ou J, Li Y, Ding Z, et al. Transcriptome⁃wide identification and characterization of the Procambarus clarkii microRNAs potentially related to immunity against Spiroplasma eriocheiris infection [J]. Fish Shellfish Immunol, 2013, 35(2): 607⁃617.

[23] O’Connell R M, Rao D S, Chaudhuri A A, et al. Physiological and pathological roles for microRNAs in the immune system [J]. Nat Rev Immunol, 2010, 10(2): 111⁃122.

[24] Xiao C C, Rajewsky K. MicroRNA control in the immune system: basic principles [J]. Cell, 2009, 136(1): 26⁃36.

[25] Li C H, Feng W D, Qiu L H, et al. Characterization of skin ulceration syndrome associated microRNAs in sea cucumber Apostichopus japonicus by deep sequencing [J]. Fish Shellfish Immunol, 2012, 33(2): 436⁃441.

[26] Chen G F, Zhang C Y, Jiang F J, et al. Bioinformatics analysis of hemocyte miRNAs of scallop Chlamys farreri against acute viral necrobiotic virus (AVNV) [J]. Fish Shellfish Immunol, 2014, 37(1): 75⁃86.

[27] Zhao X L, Yu H, Kong L F, et al. High throughput sequencing of small RNAs transcriptomes in two Crassostrea oysters identifies microRNAs involved in osmotic stress response [J]. Sci Rep, 2016, 6: 22687.

[28] Li S K, Zhu S, Li C B, et al. Characterization of microRNAs in mud crab Scylla paramamosain under Vibrio parahaemolyticus infection [J]. Plos One, 2013, 8(8): e73392.

[29] Huang Y, Wang W, Xu Z Q, et al. Eriocheir sinensis microRNA⁃7 targets crab Myd88 to enhance white spot syndrome virus replication [J]. Fish Shellfish Immunol, 2018, 79: 274⁃283.

[30] Huang Y, Han K K, Wang W, et al. Host microRNA⁃217 promotes white spot syndrome virus infection by targeting tube in the Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) [J]. Front Cell Infect Microbiol, 2017, 7: 164.

[31] Ou J T, Meng Q G, Li Y, et al. Identification and comparative analysis of the Eriocheir sinensis microRNA transcriptome response to Spiroplasma eriocheiris infection using a deep sequencing approach [J]. Fish Shellfish Immunol, 2012, 32(2): 345⁃352.

[32] Li M, Huang Q, Wang J F, et al. Differential expression of microRNAs in Portunus trituberculatus in response to hematodinium parasites [J]. Fish Shellfish Immunol, 2018, 83: 134⁃139.

[33] 周亚东. 大西洋中脊盲虾Rimicaris exoculata种群遗传和microRNA分析以及日本对虾抗病毒活性物质筛选[D]. 杭州:浙江大学, 2014.

[34] Zhou Y D. Population enetics&microRNA analysis of Rimicaris exoculata from mid⁃Atlantic ridge and antiviral compounds screening from Marsupenaeus japonicas [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014.

[35] Xi Q Y, Xiong Y Y, Wang Y M, et al. Genome⁃wide discovery of novel and conserved microRNAs in white shrimp (Litopenaeus vannamei) [J]. Mol Biol Rep, 2015, 42(1): 61⁃69.

[36] Ruan L W, Bian X F, Ji Y C, et al. Isolation and identification of novel microRNAs from Marsupenaeus japonicus [J]. Fish Shellfish Immunol, 2011, 31(2): 334⁃340.

[37] Yang G, Yang L, Zhao Z, et al. Signature miRNAs involved in the innate immunity of invertebrates [J]. Plos One, 2012, 7(6): e39015.

[38] Yang L, Yang G, Zhang X B. The miR⁃100⁃mediated pathway regulates apoptosis against virus infection in shrimp [J]. Fish Shellfish Immunol, 2014, 40(1): 146⁃153.

[39] Wang Z, Zhu F. MicroRNA⁃100 is involved in shrimp immune response to white spot syndrome virus (WSSV) and Vibrio alginolyticus infection [J]. Sci Rep, 2017, 7: 42334.

[40] Zheng Z H, Aweya J J, Wang F, et al. Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) related microRNAs in Litopenaeus vannamei infected with AHPND⁃causing strain of Vibrio parahemolyticus [J]. BMC Genom, 2018, 19: 335.

[41] Zhu F, Wang Z, Sun B Z. Differential expression of microRNAs in shrimp Marsupenaeus japonicus in response to Vibrio alginolyticus infection [J]. Dev Comp Immunol, 2016, 55: 76⁃79.

[42] Xiao C C, Rajewsky K. MicroRNA control in the immune system: basic principles [J]. Cell, 2009, 136(1): 26⁃36.

[43] Cullen B R. MicroRNAs as mediators of viral evasion of the immune system [J]. Nat Immunol, 2013, 14(3): 205⁃210.

[44] Shekhar M S, Karthic K, Kumar K V, et al. Comparative analysis of shrimp (Penaeus vannamei) miRNAs expression profiles during WSSV infection under experimental conditions and in pond culture [J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 93: 288⁃295.

[45] Zeng D G, Chen X L, Xie D X, et al. Identification of highly expressed host microRNAs that respond to white spot syndrome virus infection in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei (Penaeidae) [J]. Genet Mol Res, 2015, 14(2): 4818⁃4828.

[46] Sun X Y, Liu Q H, Yang B, et al. Differential expression of microRNAs of Litopenaeus vannamei in response to different virulence WSSV infection [J]. Fish Shellfish Immunol, 2016, 58: 18⁃23.

[47] Huang J, Kang S, Chen I, et al. Shrimp miR⁃10a is Co⁃opted by white spot syndrome virus to increase viral gene expression and viral replication [J]. Front Immunol, 2017, 8: 1084.

[48] Xu X P, Yuan J, Yang L W, et al. The Dorsal/miR⁃1959/Cactus feedback loop facilitates the infection of WSSV in Litopenaeus vannamei [J]. Fish Shellfish Immunol, 2016, 56: 397⁃401.

[49] Zhao M R, Meng C, Xie X L, et al. Characterization of microRNAs by deep sequencing in red claw crayfish Cherax quadricarinatus haematopoietic tissue cells after white spot syndrome virus infection [J]. Fish Shellfish Immunol, 2016, 59: 469⁃483.

[50] Kaewkascholkul N, Somboonviwat K, Asakawa S, et al. Shrimp miRNAs regulate innate immune response against white spot syndrome virus infection [J]. Dev Comp Immunol, 2016, 60: 191⁃201.

[51] Jaree P, Wongdontri C, Somboonwiwat K. White spot syndrome virus⁃induced shrimp miR⁃315 attenuates prophenoloxidase activation via PPAE3 gene suppression [J]. Front Immunol, 2018, 9: 2184.

[52] Huang Y, Wang W, Ren Q. Two host microRNAs influence WSSV replication via STAT gene regulation [J]. Sci Rep, 2016, 6: 23643.

[53] Chen Y L, Zhang S Y, Cao J, et al. Shrimp antiviral mja⁃miR⁃35 targets CHI3L1 in human M2 macrophages and suppresses breast cancer metastasis [J]. Front Immunol, 2018, 9: 2071.

[54] Li X P, Meng X H, Luo K, et al. The identification of microRNAs involved in the response of Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis to white spot syndrome virus infection [J]. Fish Shellfish Immunol, 2017, 68: 220⁃231.

[55] Huang T Z, Xu D D, Zhang X B. Characterization of host microRNAs that respond to DNA virus infection in a crustacean [J]. BMC Genom, 2012, 13(1): 159.

[56] He Y D, Sun Y C, Zhang X B. Noncoding miRNAs bridge virus infection and host autophagy in shrimp in vivo [J]. FASEB J, 2017, 31(7): 2854⁃2868.

[57] Shu L, Zhang X B. Shrimp miR⁃12 suppresses white spot syndrome virus infection by synchronously triggering antiviral phagocytosis and apoptosis pathways [J]. Front Immunol, 2017, 8: 855.

[58] Wang Z, Zhu F. Different roles of a novel shrimp microRNA in white spot syndrome virus (WSSV) and Vibrio alginolyticus infection [J]. Dev Comp Immunol, 2018, 79: 21⁃30.

[59] Liu C L, Wang J J, Zhang X B. The involvement of MiR⁃1⁃clathrin pathway in the regulation of phagocytosis [J]. Plos One, 2014, 9(6): e98747.

[60] Gong Y, Ju C Y, Zhang X B. The miR⁃1000⁃p53 pathway regulates apoptosis and virus infection in shrimp [J]. Fish Shellfish Immunol, 2015, 46(2): 516⁃522.

[61] Gong Y, Ju C Y, Zhang X B. Shrimp miR⁃1000 functions in antiviral immunity by simultaneously triggering the degradation of two viral mRNAs [J]. Front Immunol, 2018, 9: 2999.

[62] Huang T, Cui Y, Zhang X, et al. Involvement of viral microRNA in the regulation of antiviral apoptosis in shrimp [J]. J Virol, 2014, 88(5): 2544⁃2554.

[63] Shu L, Li C R, Zhang X B. The role of shrimp miR⁃965 in virus infection [J]. Fish Shellfish Immunol, 2016, 54: 427⁃434.

[64] Ren Q, Huang Y, He Y D, et al. A white spot syndrome virus microRNA promotes the virus infection by targeting the host STAT [J]. Sci Rep, 2015, 5: 18384.

[65] Huang T, Zhang X. Functional analysis of a crustacean microRNA in host⁃virus interactions [J]. J Virol, 2012, 86(23): 12997⁃13004.

[66] Sun Y C, Zhang X B. Role of DCP1⁃DCP2 complex regulated by viral and host microRNAs in DNA virus infection [J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 92: 21⁃30.

[67] Cui Y L, Yang X Y, Zhang X B. Shrimp miR⁃34 from shrimp stress response to virus infection suppresses tumorigenesis of breast cancer [J]. Mol Ther ⁃ Nucleic Acids, 2017, 9: 387⁃398.

[68] Ren Q, Huang X, Cui Y L, et al. Two white spot syndrome virus microRNAs target the dorsal gene to promote virus infection in Marsupenaeus japonicus shrimp [J]. J Virol, 2017, 91(8): e02261⁃16.

[69] He Y D, Ma T T, Zhang X B. The mechanism of synchronous precise regulation of two shrimp white spot syndrome virus targets by a viral microRNA [J]. Front Immunol, 2017, 8: 1546.

[70] He Y, Yang K, Zhang X. Viral microRNAs targeting virus genes promote virus infection in shrimp in vivo [J]. J Virol, 2014, 88(2): 1104⁃1112.

[71] Zhang N N, Hu G W, Myers T G, et al. Protocols for the analysis of microRNA expression, biogenesis, and function in immune cells [J]. Curr Protoc Immunol, 2019, 126(1): e78.

[72] Bizuayehu T T, Fernandes J M O, Johansen S D, et al. Characterization of novel precursor miRNAs using next generation sequencing and prediction of miRNA targets in Atlantic halibut [J]. Plos One, 2013, 8(4): e61378.

[73] Song Y N, Shi L L, Liu Z Q, et al. Global analysis of the ovarian microRNA transcriptome: implication for miR⁃2 and miR⁃133 regulation of oocyte meiosis in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis (Crustacea: Decapoda) [J]. BMC Genomics, 2014, 15: 547.

[74] Waiho K, Fazhan H, Zhang Y, et al. Gonadal microRNA expression profiles and their potential role in sex differentiation and gonadal maturation of mud crab Scylla paramamosain [J]. Mar Biotechnol, 2019, 21(3): 320⁃334.

[75] Jia X W, Zhou M C, Zou Z H, et al. Identification and comparative analysis of the ovary and testis microRNAome of mud crab Scylla paramamosain [J]. Mol Reprod Dev, 2018, 85(6): 519⁃531.

[76] Meng X L, Zhang X H, Li J, et al. Identification and comparative profiling of ovarian and testicular microRNAs in the swimming crab Portunus trituberculatus [J]. Gene, 2018, 640: 6⁃13.

[77] He L, Wang Y L, Li Q, et al. Profiling microRNAs in the testis during sexual maturation stages in Eriocheir sinensis [J]. Animal Reproduction Sci, 2015, 162: 52⁃61.

[78] Jin S, Fu H, Sun S, et al. Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles during the sex⁃differentiation sensitive period in oriental river prawn, Macrobrachium nipponense [J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 12011.

[79] Jin S B, Fu H T, Jiang S F, et al. Identification of androgenic gland microRNA and their target genes to discover sex⁃related microRNA in the oriental river prawn, Macrobrachium nipponense [J]. Genet Mol Res, 2015, 14(4): 18396⁃18406.

[80] Zhao C, Fan S G, Qiu L H. Identification of microRNAs and their target genes associated with ovarian development in black tiger shrimp (Penaeus monodon) using high⁃throughput sequencing [J]. Sci Rep, 2018, 8: 11602.

[81] Qiao H, Jiang S F, Xiong Y W, et al. Integrated analysis of differentially expressed microRNAs and mRNAs to screen miRNAs and genes related to reproduction in Macrobrachium nipponense [J]. 3 Biotech, 2019, 9(9): 327.

[82] Chen H, Xin L S, Song X R, et al. A norepinephrine⁃responsive miRNA directly promotes CgHSP90AA1 expression in oyster haemocytes during desiccation [J]. Fish Shellfish Immunol, 2017, 64: 297⁃307.

[83] Lv J, Liu P, Gao B Q, et al. The identification and characteristics of salinity⁃related microRNAs in gills of Portunus trituberculatus [J]. Cell Stress Chaperones, 2016, 21(1): 63⁃74.

[84] Chen X, Chen J, Shen Y, et al. Transcriptional responses to low⁃salinity stress in the gills of adult female Portunus trituberculatus [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: genomics and proteomics, 2019, 29: 86⁃94.

[85] Wang H, Wei H L, Tang L, et al. Identification and characterization of miRNAs in the gills of the mud crab (Scylla paramamosain) in response to a sudden drop in salinity [J]. BMC Genomics, 2018, 19(1): 609.

[86] Guo H, Lu Z C, Zhu X W, et al. Differential expression of microRNAs in hemocytes from white shrimp Litopenaeus vannamei under copper stress [J]. Fish Shellfish Immunol, 2018, 74: 152⁃161.

[87] He Y Y, Li Z X, Zhang H E, et al. Genome⁃wide identification of Chinese shrimp (Fenneropenaeus chinensis) microRNA responsive to low pH stress by deep sequencing [J]. Cell Stress Chaperones, 2019, 24(4): 689⁃695.

[88] He P P, Wei P Y, Zhang B, et al. Identification of microRNAs involved in cold adaptation of Litopenaeus vannamei by high⁃throughput sequencing [J]. Gene, 2018, 677: 24⁃31.

[89] Zheng J B, Cao J W, Mao Y, et al. Identification of microRNAs with heat stress responsive and immune properties in Marsupenaeus japonicus based on next⁃generation sequencing and bioinformatics analysis: essential regulators in the heat stress⁃host interactions [J]. Fish Shellfish Immunol, 2018, 81: 390⁃398.

[90] Wang W, Zhong P, Yi J Q, et al. Potential role for microRNA in facilitating physiological adaptation to hypoxia in the Pacific whiteleg shrimp Litopenaeus vannamei [J]. Fish Shellfish Immunol, 2019, 84: 361⁃369.

[91] Sun S M, Fu H T, Ge X P, et al. Identification and comparative analysis of the oriental river prawn (Macrobrachium nipponense) microRNA expression profile during hypoxia using a deep sequencing approach [J]. Comp Biochem Physiol Part D: Genom Proteom, 2016, 17: 41⁃47.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(31570176)

国家自然科学基金面上项目(31872601)

国家自然科学基金青年科学基金项目(31000072)