发酵对红洋葱皮粗提物中硫醇化合物的影响及其抑菌性能研究

Effects of fermentation process on thiol compounds in crude extract of fermented red onion peels and their antibacterial activity

摘要

以红洋葱皮为原料，以硫醇类化合物（TCs）含量为指标，制备发酵红洋葱皮粗提物（FETCs），探讨发酵料液比、盐料比、发酵时间、发酵温度对TCs含量的影响，采用正交实验确定FETCs中TCs含量最高的最佳工艺条件。结果表明：各因素对FETCs中的TCs含量的影响大小为：发酵温度>发酵时间>盐料比>料液比，最佳条件为料液比1∶30（m∶V）、盐料比1∶15、发酵时间7 d、发酵温度40 ℃，在此条件下FETCs中TCs的含量为0.45%；FETCs抑菌实验结果表明，随着FETCs中TCs浓度的增加，抑制效果增强；FETCs中TCs最大的抑制率分别为：硫色镰刀菌（72.59%）>互隔链胞菌（67.39%）>金黄色球菌（34.97%）。

Abstract

In this study， the crude extracts of fermented red onion peels （FETCs） were prepared using red onion peels as raw material and the content of thiol compounds（TCs） as an indicator. In order to determine the optimum process conditions for the highest level of TCs in FETCs， the factors of ratios of material to liquid， salt to material， time and temperature of fermentation were investigated to establish an orthogonal experimental model， respectively. The results showed that the effects of various factors on the content of TCs in FETCs were fermentation temperature > fermentation time > ratio of salt to material > ratio of material to liquid. The optimum extraction conditions were 1∶30 （m∶V） of ratio of material to liquid， 1∶15 of ratio of salt to material， fermentation time of 7 d， fermentation temperature at 40 ℃，respectively. Under these conditions， the content of TCs in the crude extract was 0.45%. The results of FETCs bacteriostatic test showed that as the concentration of thiol compounds in the crude extract increased， the inhibition effect enhanced. The maximum inhibition rates of TCs in FETCs were Fusarium Sulphureum （72.59%） > Alternaria alternate（67.39%） > Staphylococcus aureus （34.97%）.

Graphical abstract

关键词

洋葱皮 / 发酵 / 硫醇化合物 / 工艺优化 / 抑菌性能

Key words

onion peel / fermentation / thiol compound / process optimization / antibacterial activity

0 引 言

洋葱（Allium cepa L），被称为“蔬菜皇后”^［1］。洋葱中主要活性物质为含硫化合物，鳞茎中还含有桂皮酸、咖啡酸、阿桂酸、芥子酸等^［2，3］。其中洋葱挥发油中富含蒜素、硫醇、二甲二硫化合物、三硫化物等含硫化合物^［4］，使得洋葱具有消炎抑菌、预防高血压、降低血糖等功能^［5］。洋葱硫化合物作用于动植物和微生物均有较强的生理活性。Qiu等^［6］研究洋葱皮提取物（OPEs）对硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）和互隔交链孢菌（Alternaria alternate）的抑菌活性，200 mL/L的OPEs对硫色镰刀菌抑制效果最好，抑制率达到93.48%。Hatono等^［7］研究显示水溶性有机硫化合物S⁃烯丙基半胱氨酸（SAC）可以导致大鼠的肝脏、小肠和结肠中谷胱甘肽转移酶（glutathione S⁃transferase， GST）活性的增加。因此，洋葱皮粗提物中硫醇类化合物具有重要的研究意义。

目前，已有研究者提取洋葱中的化学组分，并对这些化学组分的结构和功能进行相应研究。张燕等^［8］采用超声波辅助方法提取洋葱叶多糖，洋葱多糖提取含量为9.23 mg/mL。王存堂等^［9］用乙醇提取洋葱总酚、总黄酮并测定了清除自由基的能力。结果表明，紫色洋葱外层果皮及果肉的总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性均高于黄色洋葱；洋葱外层果皮的总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性均高于内层果肉。李晓明等^［10］采用微波辅助提取洋葱抗氧化成分，测定总多酚含量。Qiu等^［6］采用蒸馏水和75%乙醇提取洋葱皮提取物，研究了提取物对硫色镰刀菌和互隔交链孢菌的抑菌浓度。但发酵对洋葱皮硫醇类化合物（thiol compounds， TCs）的影响研究未见报道。本研究以红洋葱加工副产物——红洋葱皮为原料，发酵红洋葱皮，以硫醇类化合物含量变化为指标获得粗提液，采用分光光度法在571 nm下测定粗提液中的硫醇化合物含量^［11］，通过单因素实验和正交实验探讨料液比、盐料比、发酵时间、发酵温度对红洋葱皮发酵过程中TCs含量的影响，在优化工艺条件下提取红洋葱皮粗提液，并研究其抑菌特性，为进一步研发生物抑制剂提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红洋葱皮：酒泉敦煌种业百佳食品有限公司；重铬酸钾（AR）：天津市大茂化学试剂厂；冰醋酸（AR）：广东光华科技股份有限公司；盐酸半胱氨酸：生物技术有限公司；琼脂（AR）：BIOSHARP；葡萄糖（AR）：北京远宏昌盛商贸有限公司；硫色镰刀菌、互隔交链孢菌，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus. aureus）由兰州理工大学生命科学与工程学院实验中心提供。

1.2 仪器与设备

752N⁃紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；L550台式低速离心机：长沙湘仪离心机有限公司；HH⁃S4型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；RE56⁃86A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHB⁃Ⅲ循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；YX280B灭菌锅：北京国华电气有限公司；HHB11⁃BS电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵红洋葱皮粗提物样品制备

红洋葱皮晾干至恒重，粉碎，过100目筛，即得红洋葱皮粉，置干燥器内备用。按1∶20料液比加水，自然微生物发酵，发酵液离心（3 800 r/min，30 min）取上清液，旋蒸浓缩至5 mL，定容至10 mL，即得含硫醇化合物的发酵红洋葱皮粗提物（fermented red onion peel extract containing thiol compounds， FETCs），低温避光4 ℃下保存，备用。

1.3.2 TCs含量的检测

硫醇化合物的检测主要采用重铬酸钾法^［11］、比色法^［12］、中和法^［13］以及电位滴定法^［14］等。本研究采用重铬酸钾法^［11］测定FETCs中TCs的含量。

标准曲线绘制：参考田益玲等方法^［11］。

样品检测：取样液5 mL于10 mL容量瓶中，加入2 mL重铬酸钾醋酸溶液后用蒸馏水定容，90 ℃恒温水浴保温10 min，在571 nm处测定吸光值^{［15，16］}。

TCs含量计算：分别称取洋葱粉10.00 g，按照1.3.1的实验方法发酵提取粗提液。发酵液经离心过滤去除沉淀，得上清液，将上清液浓缩，定容，于571 nm处测定吸光值。

TCs含量/%=\frac{C\times V\times N}{W\times \mathrm{1000}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：C为从标准曲线上查得的TCs的质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释的倍数；W为样品的质量，mg。

1.3.3 影响发酵红洋葱皮粗提液中TCs含量的因素

① 单因素实验

盐料比对TCs含量的影响。盐料比（m∶m）分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，料液比1∶30（m∶V），发酵温度30℃，发酵时间4 d。

料液比对TCs含量的影响。盐料比1∶20，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（m∶V），发酵温度30 ℃，发酵时间4 d。

发酵温度对TCs含量的影响。盐料比1∶20（m∶m），料液比1∶30（m∶V），发酵温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃，发酵时间4 d。

发酵时间对TCs含量的影响。盐料比1∶20，料液比1∶30，发酵温度30 ℃，发酵时间分别为1、3、5、7、9、11 d。

② 正交实验

在单因素实验的基础上，以单因素得到的最优条件为基本参数，选用料液比（A）、盐料比（B）、发酵时间（C）、发酵温度（D）4个因素，以TCs含量为指标，采用L₉（3⁴）正交实验进行优化。

1.3.4 发酵红洋葱皮粗提物的抑菌特性

称取洋葱粉100.00 g，按照正交实验最优条件发酵。发酵产物在离心机中3 800 r/min离心30 min，上清液在旋转蒸发仪中40 ℃浓缩至50 mL，FETCs浓度为9 g/L粗提取物，放置在-4 ℃冰箱下避光保存备用。

抑菌实验：参考张淑红等^［17］、龙绛雪等^［18］和Qiu等^［6］的方法并稍做修改。

抑制率（%）=\frac{(A-\mathrm{5})-(B-\mathrm{5})}{A-\mathrm{5}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：A为对照抑菌圈直径，cm；B为处理组抑菌圈直径，cm；5为琼脂块直径。

1.4 数据统计分析

实验重复3次，采用OriginPro 2017SR2软件进行绘图，利用Excel、SPSS Statistics V17.0软件对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 硫醇化合物（TCs）标准曲线

以半胱氨酸为TCs标准品^［11］，以吸光度为纵坐标，半胱氨酸浓度为横坐标，绘制TCs标准曲线，得到测定TCs含量的线性回归方程为Y=1.200 4X+0.029 6，相关系数R²=0.997 9，半胱氨酸浓度在0.2~1.2 mol/L范围内，线性关系良好。

2.2 发酵条件对TCs含量变化的影响

2.2.1 单因素实验结果与分析

不同料液比对TCs的含量有一定影响。见图1a显示，在一定的料液比范围内，TCs含量随着液体量的增加而增加，料液比为1∶30时达到最大值，后趋于平缓。溶剂影响原料内部与外部之间有效成分的传质过程^［19］。液体量比较低时，短时间内TCs就溶解达到平衡；但液体量过高时，TCs的溶出量达到一个恒定数值，不再增加。综上，故料液比选择1∶30为最佳。

不同盐料比对TCs的含量有一定影响。见图1b显示，在一定范围内，TCs含量随着盐料比的增加，呈现先增加后减少的趋势。这可能是盐的浓度影响了微生物的发酵，进而影响了原料内部有效成分释放^［20］。盐料比值在（1∶5）~（1∶20）范围内，随着比值的不断增加，生成的TCs含量逐渐减少，可能是盐浓度降低，导致微生物发酵，释放TCs；在（1∶20）~（1∶30）范围内，随着比值的不断减少，生成的TCs含量在不断减小，可能是其浓度不足以破坏其细胞膜的结构，不能使内TCs完全释放。综上，盐料比选择1∶20为最佳。

不同发酵时间对TCs的含量影响，见图1c显示，该因素对TCs的含量有一定影响。在一定范围内，TCs随着时间的延长含量明显增加，在发酵时间为7 d时达到最大，时间继续延长，含量略微下降后趋于平缓。结合实际情况，故发酵时间选择7 d为最佳。

不同发酵温度对TCs的含量影响，见图1d显示，该因素对TCs的含量有一定影响。在20~30 ℃范围内，发酵温度的升高，有利于微生物进行发酵作用，使得TCs含量逐渐上升，当温度达到30 ℃时，TCs含量最高，当温度高于30 ℃时，TCs含量随温度升高而减少，这可能是温度过高，会加速细胞膜的破裂^［21］，但是温度过高，一方面可能不利于微生物的发酵，另一方面可能使得TCs分解，使得TCs含量降低。综上，选择30 ℃为最佳发酵温度。

2.2.2 正交实验结果及分析

极差分析结果表明（表1），各因素的影响强度依次为：D>C>B>A，即发酵温度>发酵时间>盐料比>料液比。方差分析结果表明，发酵温度对含量影响极显著，发酵时间对含量影响较显著，料液比、盐料比对含量影响不显著。最优组合为A₂B₁C₂D₃，即料液比1∶30（m∶V），盐料比1∶15（m∶m），发酵时间7 d，发酵温度40 ℃。验证最优组合A₂B₁C₂D₃，3次重复，测得其TCs的平均含量为0.45%。

2.3 抑菌实验结果及分析

洋葱油中硫醇化合物对葡萄球菌，链球菌和弧状菌芽胞杆菌等多种细菌和真菌具有抑制作用^［22］。由图2a可知，空白组抑菌圈直径14.67 mm，在P<0.05水平上与0 g/L浓度处理组处于同一显著水平，高于0.20~1.80 g/L处理组，说明含硫醇化合物的FETCs对硫色镰刀菌生长具有抑制作用。FETCs浓度在0.36~1.8 g/L时，每个浓度对抑制率都存在显著差异。在处理组范围内，最小抑菌率15.19%（0.18 g/L），最大抑菌率为72.59%（1.80 g/L）；抑菌圈直径随FETCs浓度增大而减小，抑制率随浓度增加而增强。

由图2b可知，空白组抑菌圈直径13.12 mm，浓度在0~0.36 g/L时，其处理组抑菌圈直径处于同一显著水平，无显著性差异。当浓度在0.36~1.80 g/L时，其处理组抑菌圈直径都存在显著差异。其中，浓度在0.18~1.08 g/L时，处理组之间抑制率都存在显著差异，并且随处理浓度增高，抑制率逐渐增强。浓度在1.08~1.80 g/L时，抑制率显著性趋于同一水平，处理组间没有显著性差异。因此，1.08 g/L为FETCs对互隔交链孢菌的最佳抑菌浓度，抑菌率为62.19%。在处理组浓度范围内，最小抑菌浓度0.33%（0.18 g/L），最大抑菌率为67.39%（1.80 g/L）；抑菌圈直径随FETCs浓度增加而降低，抑制效果随浓度增加而逐渐增强。

由图2c可知，在同一个P<0.05，浓度在0~0.18 g/L、0.36~0.54 g/L和0.72~1.44 g/L时，处理组抑菌圈直径和处理组抑菌效果均不显著，但不同浓度梯度处理组抑菌圈直径和抑制率均有显著性差异。在处理浓度范围内，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌率为2.22%（0.18 g/L），最大抑菌率为34.97%（1.80 g/L）；抑菌圈直径随FETCs浓度增加而降低，抑制效果随浓度增加而逐渐增强。

3 结 论

本研究通过单因素和正交实验得到发酵红洋葱皮获得TCs含量最高的最佳工艺参数：料液比1∶30（m∶ V），盐料比1∶15（m∶m），发酵时间7 d，发酵温度40 ℃，在此条件下TCs含量为0.45%。

本实验FETCs抑菌实验，在实验浓度范围内，抑菌圈直径随FETCs浓度增加而降低，抑制效果随浓度增加而逐渐增强。FETCs低浓度0.18和0.36 g/L对菌株抑制生长较弱；高浓度1.08、1.44和1.80 g/L对菌株生长有显著的抑制作用。在浓度为1.80 g/L时FETCs对硫色镰刀菌抑制效果最高，对互隔交链孢菌次之，对金黄色葡萄球菌抑制效果最低；抑制率分别为72.59%、67.39%和34.97%。

参考文献

[1] 孙雪君, 徐怀德, 米林峰. 鲜洋葱和干洋葱挥发性化学成分比较[J]. 食品科学, 2012, 33(22): 290⁃293.

[2] Sun X J, Xu H D, Mi L F. Analysis of volatile compounds from fresh and dried Allium cepa L [J]. Food Science, 2012, 33(22): 290⁃293.

[3] Briggs W H, Folts J D, Osman H E, et al. Administration of raw onion inhibits platelet⁃mediated thrombosis in dogs [J]. J Nutr, 2001, 131(10): 2619⁃2622.

[4] 郭玉华, 李钰金, 殷诗强. 洋葱食品的研究进展[J]. 中国调味品, 2009, 34(11): 35⁃37.

[5] Guo Y H, Li Y J, Yin S Q. Advances on the research of onion food [J]. China Condiment, 2009, 34(11): 35⁃37.

[6] 赵国平, 戴慎, 陈仁寿, 等. 中药大辞典[M]. 上海:上海科学技术出版社, 2006.

[7] Zhao G P, Dai S, Chen R S, et al. Chinese medicine dictionary [M]. Shanghai: Shanghai Science and Technology Press, 2006.

[8] 王强, 曹爱丽, 王苹, 等. 洋葱油的提取价值及其技术研究[J]. 食品科学, 2001, 22(8): 56⁃58.

[9] Wang Q, Cao A L, Wang P, et al. Study on the extraction value and technology of onion oil [J]. Food Science, 2001, 22(8): 56⁃58.

[10] Qiu Y, Zhao P, Rui W J, et al. Ultrastructural aspects of Fusarium sulphureum and alternaria alternate affected by extracts of onion peel [J]. J Biobased Mat Bioenergy, 2017, 11(3): 193⁃199.

[11] Hatono S, Jimenez A, Wargovich M J. Chemopreventive effect of S⁃allylcysteine and its relationship to the detoxification enzyme glutathione S⁃transferase [J]. Carcinogenesis, 1996, 17(5): 1041⁃1044.

[12] 张燕, 潘步昌, 陈波. 洋葱叶多糖超声辅助提取工艺优化[J]. 黑龙江农业科学, 2017(1): 97⁃100.

[13] Zhang Y, Pan B C, Chen B. Optimization of polysaccharides extraction with ultrasonic⁃assisted method from onion leaves by orthogonal experiment [J]. Heilongjiang Agricultural Sciences, 2017(1): 97⁃100.

[14] 王存堂, 李建立, 张译心, 等. 黄、紫洋葱外层干皮和内层果肉总酚、总黄酮含量及抗氧化活性研究[J]. 江苏农业科学, 2018, 46(8): 180⁃182.

[15] Wang C T, Li J L, Zhang Y X, et al. Study on total phenolics, total flavonoids content and antioxidant activity from outer and inner layers of yellow and purple onions [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2018, 46(8): 180⁃182.

[16] 李晓明, 张飒乐, 李英, 等. 葡萄酒泡洋葱总多酚的提取及含量测定[J]. 现代交际, 2017(9): 191.

[17] Li X M, Zhang S L, Li Y, et al. Extraction and determination of total polyphenols from wine soaked onions [J]. Modern Society, 2017(9): 191.

[18] 田益玲, 贾英民, 李慧静, 等. 紫外分光光度法测定面粉中的巯基含量[J]. 中国粮油学报, 2005, 20(4): 125⁃128.

[19] Tian Y L, Jia Y M, Li H J, et al. Determination method of sulfhydryl in flour [J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2005, 20(4): 125⁃128.

[20] 罗明江, 罗春霞, 吴赣香. Ellman’s试剂比色法测定食品中蛋白质的巯基和二硫键[J]. 郑州粮食学院学报, 1986, 7(1): 92⁃95.

[21] Luo M J, Luo C X, Wu G X. Determination of sulfhydryl group and disulfuric chain of protein in food by ellmans's reagent colorimetric method [J]. J Zhengzhou Grain Coll, 1986, 7(1): 92⁃95.

[22] 赵中杰, 韩长柏. 中和法测定硫醇的改进[J]. 分析化学, 1986, 14(4): 317⁃318.

[23] Zhao Z J, Han C B. Improvement of determination of mercaptan by neutralization method [J]. Analytical Chemistry, 1986, 14(4): 317⁃318.

[24] 朴健淑. 电位滴定法测定原油中硫醇硫含量[J]. 油气田环境保护, 2014, 24(3): 52⁃54, 81⁃82.

[25] Pu J S. Determination of thiol sulfur content in crude oil by potentiometric titration methord [J]. Environmental Protection of Oil & Gas Fields, 2014, 24(3): 52⁃54, 81⁃82.

[26] 王连方, 李菁, 张玲. 生物样品活性巯基测定法[J]. 地方病通报, 1999, 14(4): 22⁃24, 26.

[27] Wang L F, Li J, Zhang L. A test method for active sulfhydryl group in biological sample [J]. Bulletin of Disease Control and Prevention (China), 1999, 14(4): 22⁃24, 26.

[28] Gergel D, Cederbaum A I. Interaction of nitric oxide with 2⁃thio⁃5⁃nitrobenzoic acid: implications for the determination of free sulfhydryl groups by ellman's reagent [J]. Arch of Biochem Biophys, 1997, 347(2): 282⁃288.

[29] 张淑红, 周宝利, 张磊, 等. 天然植物提取物对茄子黄萎病菌的抑制活性[J]. 应用生态学报, 2006, 17(6): 1137⁃1140.

[30] Zhang S H, Zhou B L, Zhang L, et al. Inhibitory effects of natural plant extracts on Verticillium albo⁃atrum [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2006, 17(6): 1137⁃1140.

[31] 龙绛雪, 曹福祥. 洋葱挥发油的抗真菌作用及其机理[J]. 中南林学院学报, 2006, 26(5): 89⁃92.

[32] Long J X, Cao F X. Antifungal effects and mechanism of essential oil extracts of Onions (Allium cepa L.) [J]. Journal of Central South University of Forestry and Technology, 2006, 26(5): 89⁃92.

[33] 张炎强, 李湘洲, 王贵武, 等. 细胞壁破碎技术对天然有效成分传质过程的强化[J]. 中成药, 2008, 30(4): 585⁃587.

[34] Zhang Y Q, Li X Z, Wang G W, et al. Cell wall fragmentation technology strengthens the mass transfer process of natural active components [J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2008, 30(4): 585⁃587.

[35] 蒋武生, 芦翠乔, 杨延明, 等. 盐对番茄植株生长和细胞膜透性的影响[J]. 河南农业科学, 1992, 21(6): 23⁃25.

[36] Jiang W S, Lu C Q, Yang Y M, et al. Effect of salt on growth and cell membrane permeability of tomato plants [J]. Henan Agricultural Science, 1992, 21(6): 23⁃25.

[37] 仉劲. 金银花生长发育和加工过程中的成分变化研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2014.

[38] Zhang J. Research of composition changes in the process of growth and proceeding of Lonicera japonica thumb [D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2014.

[39] 吴悠. 洋葱有效成分的提取及生物活性研究[D]. 武汉:武汉工程大学, 2017.

[40] Wu Y. Study on extraction and biological activity of onion active ingredients [D]. Wuhan: Wuhan Institute of Technology, 2017.

基金资助

脱水蔬菜加工过程中的色泽变化及其护色技术研究(H1408cc002)