正交设计优化微波辅助测定延胡索叶总生物碱含量

Optimization of microwave extraction of total alkaloids from leaves of Corydalis yanhusuo by orthogonal method

摘要

通过微波辅助提取的方式，以延胡索叶总生物碱含量为考察指标，通过单因素试验和正交试验对总生物碱提取方法进行优化。重点考察了微波提取温度、时间、料液比、提取缓冲液pH值等因素对延胡索叶总生物碱得率的影响。各因素对延胡索叶总生物碱提取量的影响大小依次为：提取缓冲液pH值>料液比>提取温度。其最佳的提取方法为：提取缓冲液pH值为1.0，料液比1∶100，提取温度60 ℃，提取时间20 min。在此条件下，叶总生物碱含量为25.910 mg/g。利用微波辅助提取延胡索叶中总生物碱，不仅耗时短，效率高，而且操作简单、稳定，为延胡索叶总生物碱含量测定提供一定的技术支持。

Abstract

The total alkaloids was extracted by microwave， and the extraction method was optimized by single factor experiment and orthogonal experiment， and the effect of microwave extraction temperature， time， solid⁃liquid ratio and pH value of buffer on the total alkaloid yield were investigated. The most important factor affecting the total alkaloid content was buffer pH， followed by the ratio of material to liquid， and extraction temperature. The optimal extraction process was buffer pH 1.0， material to liquid ratio 1∶100， microwave temperature 60℃. The total alkaloid yield under these conditions was 25.910 mg/g. The total alkaloids in the leaves extracted by microwave is short in time， high in extraction rate and stable in operation， providing certain technical support for the determination of total alkaloids from Corydalis yanhusuo.

Graphical abstract

关键词

延胡索叶 / 总生物碱 / 正交试验 / 含量测定

Key words

Corydalis yanhusuo leaf / total alkaloid / orthogonal test / content determination

0 引 言

中药延胡索为罂粟科（Papaveraceae）紫堇属（Corydalis）植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的块茎，具有活血、行气、止痛等功效^［1］，临床主要用于治疗胸胁脘腹疼痛^［2］，是著名的“浙八味”之一。目前，延胡索主产于浙江磐安、东阳，陕西汉中地区，栽培面积逐年扩大。药效成分主要是苄基异喹啉类生物碱^［3］。有研究表明，延胡索地上部茎叶与地下块茎药效成分差别较大，主要为阿朴啡型生物碱^［4］，如O⁃甲基南天竹碱（nantenine）、海罂粟碱（glaucine）、1⁃甲基乙基⁃3，4，6，7⁃四甲氧基菲（1⁃methyl aminoethyl⁃3，4，6，7⁃tetramethoxy⁃phenanthrene）、去甲海罂粟碱（norglaucine）和β⁃谷甾醇（β⁃sitosterole）。O⁃甲基南天竹碱具有抑制中枢神经^［5］、止咳平喘^［6］、麻痹^［7］等作用；海罂粟碱及脱氢海罂粟碱具有抗炎镇咳^［8~10］、扩张支气管^［11］、抗肾上腺素^［12］、阻断钙离子通道活性^［13］的作用；β⁃谷甾醇具有降低胆固醇^{［14，15］}、抑制肿瘤^［16~18］和修复胃粘膜^［19］的作用；1⁃甲基乙基⁃3，4，6，7⁃四甲氧基菲的具体药理作用研究较少。因此，开展延胡索叶中生物碱的分离鉴定研究具有较好的应用前景。

延胡索总生物碱在酸或一定浓度的乙醇中有较好的溶解性，其总生物碱的提取方法、条件参数的优化等已有较多报道^［20~23］，但延胡索地上部茎、叶等总生物碱的提取方法研究鲜有报道^［24］，而微波提取具有提取效率高、耗时短、操作简单稳定等特点，目前多采用正交试验进行测定方案优化^{［25，26］}，以期得到较合理的实验方案。随着对传统非药用部位资源性化学成分研究的不断深入，部分传统非药用部位潜在的资源价值逐渐显现并越来越引起人们的高度重视。本研究拟以经过杀青处理后的延胡索叶（60 ℃烘干，过60目筛）粉末为研究材料，以延胡索乙素为对照品，结合正交试验来优化延胡索叶片中总生物碱的微波提取条件，以期为延胡索叶作为新的中药资源综合利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

① 仪器：UV⁃Vis 2450型紫外⁃可见分光光度仪（日本岛津公司）；DFY⁃500高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；XS105 DualRange 型电子分析天平（梅特勒⁃托利多仪器上海有限公司）；JA2003N电子天平（上海精密仪器有限公司）；MAS⁃Ⅱ Plus型常压微波提取器（上海新仪微波化学科技有限公司）；FE20 pH计（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；Millipore Synergy超纯水系统（美国密理博公司）。

② 试剂：延胡索叶于2018年3月至5月采自浙江中医药大学药学院“浙八味”研究所试验田，经石森林教授鉴定为罂粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo）的干燥叶片。延胡索乙素对照品（纯度：99.86%，批号MUST⁃18032720，成都曼斯特生物科技有限公司）；无水硫酸钠（批号2016092901）、无水乙酸钠（批号20160315），成都科龙化工试剂厂；溴甲酚绿（批号20160817，广东精细化学品工程技术研究开发中心）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；氯仿（分析纯，成都科龙化工试剂厂）；水为Millipore超纯水；其余试剂均为分析纯，天津市永大化学试剂开发中心。

1.2 溶液制备

① 对照品溶液：精密称取延胡索乙素对照品9.38 mg，用甲醇定容至50 mL容量瓶中，摇匀，即得187.60 μg/mL的对照溶液。

② 总生物碱样品溶液：精密称取0.5 g延胡索叶片粉末置于100 mL的微波提取器中，加入50 mL pH为3.0的缓冲液，在70 ℃，350 W的条件下微波提取20 min，流水冲冷后立刻进行抽滤，取适量续滤液，用浓氨水调节pH至8.0，精密移取等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于蒸发皿中，在80 ℃条件下蒸干，用甲醇溶解定容至10 mL，摇匀，即得总生物碱样品溶液。

1.3 方法学建立

1.3.1 显色方法及波长的选择

显色试验：依次在分液漏斗中加入12 mL pH为4.5的醋酸缓冲液，3 mL溴甲酚绿溶液，1 mL总生物碱供试品溶液及9 mL氯仿，充分振荡混匀，静置半小时分层，将下层溶液置于含有0.40 g无水硫酸钠的10 mL离心管中。

波长选择试验：取显色后的延胡索乙素对照品溶液与供试品溶液，以氯仿为空白参比溶液，在200~600 nm范围内波长扫描，结果显示，在411 nm处标准品与供试品均具有最大吸收峰，故选择测定波长为411 nm。

1.3.2 线性关系的考察

精密吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，进行显色试验，在411 nm处测定吸光度；以延胡索乙素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y = 0.005 2X-0.019 09（R² = 0.999 8，n=6）。结果表明：延胡索乙素在18.76~187.60 μg/mL范围内吸光度与浓度的线性良好。

1.3.3 精密度考察

取对照品溶液，进行显色试验后，在同一条件下连续测定6次，RSD= 0.10%（n = 6），结果表明仪器精密度良好。

1.3.4 重复性考察

按1.2的方法处理供试品，平行制备6份，进行显色试验后，在411 nm处测定吸光度，RSD= 1.90%（n = 6），结果表明实验重复性良好。

1.3.5 显色稳定性试验

取配制的对照品溶液，进行显色试验后，在411 nm波长处每隔20 min测定一次吸光度，连续测定6 h，RSD= 0.3 %（n = 18），表明显色后的延胡索乙素在6 h内稳定性良好。

1.3.6 加样回收试验

精密称定9份延胡索叶片粉末0.25 g分别置于100 mL的微波提取器中，其中3份分别加入0.80 mL配制的对照品溶液，另3份加入1.00 mL对照品溶液，最后3份加入1.20 mL对照品溶液，按1.2的方法后续处理，显色试验后在411 nm处测定吸光度，平均加样回收率为99.19%，RSD= 3.0%（n = 9），结果表明，加样回收率良好。

1.4 单因素试验

在一定微波提取功率（350 W）下，其他条件均保持一致，运用微波辅助提取法分别研究提取时间、提取缓冲液pH、液料比（叶片干重∶缓冲溶液体积）、微波提取温度四因素对延胡索叶总生物碱提取含量的影响。利用紫外分光光度法，测定各个因素不同水平下延胡索叶总碱的含量以此确定单因素试验的最优提取参数。

1.5 正交试验设计

根据单因素考察结果进行正交试验设计（表1），选取提取缓冲液pH（A）、料液比（B）、微波提取温度（C）为影响因素，以叶总生物碱提取量为评价指标，采用L₉（3⁴）表进行正交试验，对延胡索叶片总生物碱的提取方法进行优化。按照1.2的方法操作，记录吸光度，并对结果进行方差分析，得出最佳提取参数。

2 结果与分析

2.1 微波提取时间对叶总生物碱提取量的影响

选择同一批次的延胡索叶粉末（过60目筛）15份，均分为5组，每组3份，置于100 mL的微波提取器中，加入50 mL pH为3.0的缓冲液，在70 ℃，350 W的微波条件下分别提取10、15、20、25、30 min，考察微波提取时间对总生物碱提取量的影响，结果见图1，随着微波提取时间的增加，延胡索叶总生物碱提取量先增加后减少，提取20 min含量相对较高。可能是因为随着浸提时间的增长，脂溶性物质增加，溶液变粘稠，阻止了生物碱类物质的溶出，导致总生物碱提取量降低，因此最佳提取时间为20 min。

2.2 微波提取温度对叶总生物碱提取量的影响

选择同一批次的延胡索叶粉末18份，均分为6组，每组3份，依据1.2的方法进行操作，分别在30、40、50、60、70、80 ℃温度下进行微波提取，考察微波提取温度对叶总生物碱提取量的影响，结果见图2。微波提取温度对延胡索叶总生物碱的影响是先上升后趋于稳定，在70 ℃时总生物碱的含量相对较高，若温度继续升高，总生物碱含量变化略有降低。可能是因为当提取温度较高时，糖类、蛋白质类杂质溶出量增大，造成生物碱提取量下降。

2.3 料液比对叶片总生物碱提取量的影响

选择同一批次的延胡索叶粉末18份，分为6组，每组3份，依据1.2的方法操作，分别用料液比1∶70、1∶80、1∶90、1∶100、1∶110、1∶150进行提取，考察料液比对延胡索叶总生物碱提取量的影响，结果见图3。料液比对总生物碱的影响总体是先上升后下降的趋势，在1∶110时延胡索叶总生物碱的含量相对较高，料液比过低或过高总生物碱含量均下降。

2.4 缓冲液pH值对叶片总生物碱提取量的影响

选择同一批次的延胡索叶粉末18份，均分为6组，每组3份，依据1.2的方法进行操作，分别采用pH为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的缓冲液进行提取，考察提取缓冲液pH值高低对延胡索叶总生物碱提取量的影响相对显著，结果见图4，随着提取缓冲液pH值升高，延胡索叶总生物碱提取量逐渐降低，在pH为1.0时延胡索叶中总生物碱的含量最高。可能是生物碱在较酸的提取环境下更容易溶解、析出，结构更加稳定。

2.5 正交试验

微波提取延胡索叶中总生物碱的正交试验，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。直观分析可知，微波提取延胡索叶片中总生物碱各因素对总生物碱得率的影响大小为A>B>C。方差分析表明，提取缓冲液pH值对总碱的提取量具有极显著影响，料液比对总碱的提取量具有显著影响，提取温度影响不显著。由此得出微波提取延胡索叶片中总生物碱的最佳提取方法为A₁B₁C₁，即提取缓冲液pH为1.0，料液比为1∶100，微波提取温度为60 ℃。

2.6 提取方法验证试验

为进一步验证优化的提取条件，并进行重复试验，精密称定同一批次延胡索叶粉末3份，按照优化提取条件进行提取，平行三份，测定总生物碱含量，结果表明见表4，在优选的参数条件下，总碱提取量较高，平均总生物碱含量为25.910 mg/g，说明优选的提取方法稳定可行。

3 讨 论

随着对传统非药用部位资源性化学成分研究的不断深入，部分传统非药用部位的潜在资源价值逐渐显现并越来越引起人们的重视，如银杏叶、杜仲叶等逐渐演化为药用，成为中药体系中的新增品种；例如，人参茎叶、花、果序等均含有与人参相似的资源性化学成分，具有较高的药用及保健价值，据此人参各组织部位的资源价值得到了充分释放，人参资源经济产业链得到了有效延伸；黄芩茎叶、地黄茎叶均已开发形成成药并实现产业化^{［24，25］}。延胡索地上部茎叶生物碱主要为阿朴啡型生物碱，具有一定药用潜力。本研究以提取缓冲液pH、提取温度、料液比、提取时间四个因素为单因素，并通过正交分析方法考察并优化了延胡索叶片中总生物碱的微波辅助提取、测定方案，其中影响微波提取延胡索叶总生物碱含量的主要因素依次为：提取缓冲液pH>料液比>提取温度。其最佳的提取方案为：缓冲液pH为1.0，料液比1∶100，提取温度60 ℃，提取时间为20 min。在此条件下，总生物碱平均提取量为25.910 mg/g。该方法总生物碱提取量较高，但是其纯度高低仍有待进一步考察研究。

目前，延胡索总生物碱的研究集中于块茎总生物碱提取方面。关于地上部分茎叶的提取工艺研究只有零星的报道^［26］。以往研究证实，地上部分主要生物碱种类与块茎中主要生物碱种类差别较大^［4］。延胡索叶中生物碱含量较高，尤其是海罂粟碱、脱氢海罂粟碱、O⁃甲基南天竹碱等含量较为丰富，具有较广普的药理活性，在应用于治疗上呼吸道感染等疾病方面有开发前景。随着延胡索种植面积的不断扩大，目前延胡索叶片以田间废弃物处理，造成了大量资源的浪费，同时也对环境造成了一定的压力。因此，对延胡索叶片中所含总生物碱进行深入研究，为后续开展延胡索生长发育规律、药效成分形成及其与环境条件的关联性提供技术支持，有利于更加充分合理地利用延胡索资源，使延胡索各组织部位的资源价值得到充分释放，产业链得到有效延伸。

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基金资助

浙江省自然科学基金(LY18H280009)

浙江省“十三五”中药材新品种选育重大科技专项(2016C02058)

国家自然科学基金(31571735)