高通量植物生物反应器及其在遗传资源挖掘中的应用

High⁃throughput phytobioreactors and their application in the exploration of genetic resources

摘要

生物反应器（bioreactor）是一种以表达目标产物或获得繁殖体为目的的设备系统，包括微生物、动物、植物生物反应器以及相关设备。植物生物反应器（phytobioreactor）是借鉴植物组织培养和微生物发酵原理制作的设备系统。其中，应用较广泛的是间歇浸没式植物生物反应器。与传统植物组织培养相比，该方法具备可换气、无需转接和大容量培养等特点。国内制作的BIOF系列新型植物生物反应器还可以利用串/并联方法，实现更高通量培养能力，其应用于植物种苗繁育、代谢产物的表达、耐盐等变异的定向筛选、植物生长发育的动态分析等方面均具备显著优势。现代植物生物技术在基础研究和产业方面的应用对植物生物反应器提出了新要求，新型生物反应器应用方法的持续改进和设备系统的不断完善，使其成为植物学领域的高效研究平台，并将促进植物育种和植物源化合物的发掘等方面研究效率的提高。

Abstract

Bioreactor is a kind of system or device designed for the purpose of efficiently expressing target products and/or propagules for microbes， animals and plants. A phytobioreactor is an equipment system based on the principles of plant tissue culture and microbial fermentation. Amongst the various types of plant bioreactors， the temporary immersion bioreactor system （TIBS） is the most widely used. Compared with traditional plant tissue culture， the method has the characteristics of air exchange， no transfer and mass culture. A novel BIOF TIBS system developed in China， that realizes high throughput capacities by using series or parallel connections of bioreactor tanks， is described herein. Its advantages are demonstrated in applications for seedling propagation， expressing of motabolism products， selection of salt⁃tolerant plant varieties， and dynamic analysis of plant growth and development. More attention has been raised to phytobioreactors as a new platform for plant tissue culturing by the requirements of modern biotechnology. The continual improvement of methods and equipments for new phytobioreactors will provide more efficient research support of plant science， not only for plant breeding， but also for the discovery of plant derived compounds， especially for plant⁃microbe interaction studies.

Graphical abstract

关键词

植物组织培养 / 生物反应器 / 高通量 / 药用资源

Key words

plant tissue culture / bioreactor / high⁃throughput / medicinal resource

0 引 言

生物反应器（bioreactor）是指利用动物、植物或微生物的细胞、组织、器官甚至生物个体，以及多个个体的生物系统进行物质转化、代谢和处理的研究与生产系统^［1］。主要包括三个方面：一是养分（C、N、P、O以及其他金属或非金属离子、有机养分和其他效应物质的供给）；二是反应器（转化生物大分子到小分子活性物质、精细化合物；或合成小分子到大分子）；三是目标产物（从无活性的无机物到有活性的产物，或从有机质降解到无害的小分子如CO₂、O₂等）。因此，生物反应器既可能是生长许多个单细胞生物的设备系统，如细菌发酵罐；也可能是没有设备系统的个体，如植物或动物的个体甚至器官。

以微生物发酵罐为典型代表的生物反应器系统，是生物资源从农业方式到工业化过程的工程化利用方式的体现，具备生产效率高、目标明确、条件可控等主要特点^［2］。生物反应器系统不仅在生产方面优势明显，在研究方面的应用也非常突出。

1 生物反应器的种类

1.1 微生物反应器

微生物发酵罐是最典型的生物反应器，其养分是培养基，反应器是发酵罐，目标产品是产物，目标产品包括日常生活中不可或缺的或价值极高的生物碱、维生素、抗生素、酒精、低聚物、氨基酸和小肽甚至目标蛋白等产物^［3］。微生物发酵罐种类繁多，其中液体型发酵罐，如机械搅拌式，被称为通用发酵罐，固体型发酵装置有固定床、旋转盘式发酵罐等^［4］。微生物发酵罐的使用，改变了人类日常生活模式和生活质量，尤其是与大健康相关的产业。这些产业的发展和创新，带动了动物和植物生物反应器的发展。

1.2 动物生物反应器

动物生物反应器包括哺乳动物、昆虫、原生动物等细胞和器官生物反应器^［5］。通过基因改造的哺乳动物细胞（如乳腺细胞或血细胞）在机械搅拌式或气升式反应器中的培养已经形成产业规模的平台；利用改造过的杆状病毒侵染家蚕蛹所获得的“家蚕生物反应器”并不需要类似发酵罐培养设备，蚕蛹本身就是一个生物反应器^［6］；人类培养的奶牛源源不断产奶的过程，也就是将奶牛本身作为一种生物反应器，其中饲料是养分，牛奶是产物。鉴于动物细胞和组织培养的特殊性，动物生物反应器的开发和应用远远落后于微生物发酵系统。

1.3 植物生物反应器

植物生物反应器也称为“植物发酵罐”，大多是借鉴微生物发酵罐系统原理制备的具有一定自动化能力、体积大、生产能力高、物理和化学条件可控的植物组织培养系统或设备^［7］。其培养对象为植物细胞（如胚状体）、组织（如愈伤组织）、器官（如毛状根）或整株植物（如种苗）；其培养容器往往借助于微生物发酵罐或改装器皿、增加光照条件；其产物是植物组织的代谢产物、植物细胞、组织或种苗^［8］。在植物细胞或组织中表达人源产物具有探索价值，但其产物活力往往不如动物细胞，在规模化生产方面不如微生物系统。因此，目前植物生物反应器的生产应用还主要集中在种苗快速扩繁等农业用途^［9，10］，但在基础研究方面也具备巨大潜力。

1.3.1 植物组织培养已经解决的科学和技术问题

作为植物生物反应器的技术基础，植物组织培养方法学建立始于20世纪中期^［11］，经过几十年的发展，当前国内外最主流的植物组织培养方法为组培瓶/琼脂固体培养。该技术成熟可靠，具有操作简单、适用植物种类广、培养效果好的优点^［12］。植物组织培养技术在植物基因功能验证、转基因、分子育种、细胞全能性、植物细胞分化和植物发育生理、植物突变体研究与杂合育种、植物品种脱毒复壮和种质资源纯化、种苗扩繁和工厂化农业等产业和研究方面都取得了广泛的应用^［13］。

1.3.2 植物组织培养技术的局限

组培瓶/琼脂固体培养技术采用琼脂、明胶等为固体支撑物，植物组织培养过程基本上是被动的，因而影响营养物质的快速传递、均衡分布与快速吸收，也限制了自动化控制技术在实验中的应用^［14］。当需要进行植物培养过程的养分消耗、植物激素代谢和产物积累分析时，往往需要中断培养，进行取样、提取和分析，这就大大限制了其作为植物组织发育和生理代谢等的研究工具的价值^［15］。同时，由于植物组织培养需要相对无菌和密封的环境，培养瓶方案就限制了气体交换和CO₂的及时补给，限制了植物的生产速率。

1.3.3 植物生物反应器的种类

现有常见的植物生物反应器主要包括：①用于植物细胞培养的机械搅拌式反应器、充气混匀式反应器和气泡混匀式反应器^［9］；②主要用于组织培养的球形起泡式反应器；③用于植物器官培养的喷雾式反应器；④促进植物块根块茎形成的波浪式反应器；⑤用于完整植株培养的间歇浸没式反应器^［10］、摇摆式间歇浸没反应器等。但是，鉴于目前基本上还没有商业化的系统，每一个实验室（工程化过程）采取的标准不一样，都具有根据实际需要再次开发的过程。

1.3.4 植物生物反应器应具备的特点

作为传统组培瓶/琼脂固体培养技术的升级手段，植物生物反应器应该有效避免现有技术的不足，便于利用植物组织培养技术解决植物生长发育研究和产业中的复杂问题。其基本要求应该包括：①提供连续培养和发育研究条件，如无需转接或减少转接次数；②高通量培养，如每个处理培养30株以上个体；③提供连续观测和试验干预的条件，如胁迫培养条件；④智能控制或数字化，便于试验管理和物联网接轨，显著提高研究和产业利用效率；⑤实现可控条件下1种以上组织或物种的共培养，有利于参照自然发生或工业生产过程。

2 间歇浸没式植物生物反应器

2.1 工作原理

间歇浸没生物反应器培养系统（temporary immersion bioreactor system，TIBS）是参照自然界植物生长条件设计，利用液体培养基间歇地与植物组织接触提供营养的培养方式。该方式为植物组织在液体培养的过程中提供了一个良好的环境，并很好地进行培养器中的气体交换，保证植物组织健康生长^［16］。培养基的循环利用也可有效防止营养沉积和有害物质的积累，从而使培养基的营养成分得到更有效地利用^［17］。间歇浸没式植物生物反应器的工作原理如图1所示。

间歇浸没式植物生物反应器的工作循环分成四个阶段：第一阶段，间歇阶段培养体不与培养液接触；第二阶段，在外力作用下，培养液开始进入植物组织培养室；第三阶段，培养基完全与植物组织接触进入浸没培养阶段，并保持浸没状态；第四阶段，浸没培养结束，在重力及外力作用下，培养液与植物组织分离，又进入到间歇阶段，完成一次循环。然而，该系统主要是针对提高组织培养效率设计，尚不具备科研用实验仪器的诸多功能，比如无法实现营养成分消耗的实时检测和添加、无法做到气体变化情况的监测和控制、无法直接采集数据和进行监控等。

2.2 应用的优势

尽管现有间歇浸没式植物生物反应器还不完善，使用范围也受到一定限制，但其在种苗扩繁、突变体筛选等方面具备明显优势。主要体现在以下方面：①在同一反应器罐体中可培养数十株甚至数百株种苗，相对于组培瓶培养数量显著提高^［18］；②通过控制原始培养基的质量和数量，能在同一反应器罐体中无需多次转接实现整个生活史的培养或较长时间培养，而并不影响组织发育或植株生长^［19］；③通过培养基的及时交换和气体交换，保证养分和CO₂供应，提高生长效率^［20］；④通过液体培养基的调配或生物胁迫，实现突变体的高通量筛选^［21］。

因此，作为传统植物组织培养的一种升级手段，间歇浸没式植物生物反应器在基础研究和产业应用中均具备明显优势。

3 植物生物反应器的高通量特征

通过将小容积的固体/半固体提升为大容积的液体培养罐模式，形成了生物反应器的高通量模式。然而，间歇浸没式植物生物反应器的高通量特征还可以通过培养罐体的串/并联进一步提高。图2为生物反应器罐体的串/并联方式示意图（南京，博方生物）。反应器罐体的规格和串/并联方式可以多种多样，随着物联网技术和AI技术的应用，其原理和功能将实现不断变化和提升。

以植物种苗为例，通过培养基质量控制和生物反应器罐体的串/并联，同一组试验能够培养数十个生物反应器罐体，每个罐体培养300株以上种苗，控制浸没频率和光照等参数，一个实验中可以同步进行3×10组以上处理，共9 000株以上试验个体。以上方法，在植物发育和养分消耗模型中使用，能够显著提高研究效率。

4 高通量植物生物反应器的应用

尽管植物生物反应器的方法最早形成于欧美，但是，其探索和应用主要在实验室研究和小型化装置方面，主要是采用现有容器进行改装。我国台湾地区也有一些设备组装的研究。近10多年来，我国企业和科研人员在植物生物反应器的设计开发和应用中，已经处于国际领先地位。其特点主要包括两方面，一是通过模具制作使得反应器罐体标准化和质量可控；二是利用控制组件实现系统的量化控制，提升数据开发能力。以BIOF植物生物反应器（南京，博方生物）为代表的系统，已经在遗传资源发掘中开始发挥越来越重要的作用。高通量植物生物反应器不仅被应用于植物种苗的高通量繁育，也在植物原生质体培养、器官培养以及植物与微生物共培养模式中被广泛应用。

由于高通量植物生物反应器罐体的体积增加和参数可调控，有利于实现多组甚是数十个处理的生物学重复试验。具备高通量和换气特征的植物生物反应器，在组织培养过程中的养分消耗和发育模型研究方面已经有了成功应用^{［22，23］}。在类似应用中，培养基和效应物的添加以及代谢产物的实时监测成为关键。图3显示了一种补液型植物生物反应器的结构和工作流程。通过生物反应器的补液功能不仅可以直观显示效应物干预生长的作用，还能探索植物生长发育的关键营养需求和器官形成的机制。

通过补充培养液和延伸培养，配合改变光照温度等物理培养条件，可以促进药用植物种苗发展成为新的块茎、球茎和假鳞茎等繁殖体，或实现开花结果等整个生物学过程，而无需对培养体进行转接，也不需要终止实验过程。新型植物生物反应器的这一特点，可以大大节省研究和种质资源培育的时间，实现在可控条件下的实验研究。

在植物生物反应器中培养兰科和天南星科等块根块茎和鳞茎类植物，通过延长培养时间和控制浸没条件，可以促进假鳞茎等繁殖体发育，实现多种形态的无性繁殖阶段（图4）。在植物生物反应器中培养石斛属植物（如金钗石斛、铁皮石斛等）的原球茎，能够实现液体培养基养分和气体的充分供给，获得发育均一、高产的原球茎材料；同时，按照实验设计在培养基中加入不同诱导因子，可以有效提高目标产物的表达量。通过设置前处理和培养参数，在植物生物反应器中能够成功培养植物愈伤组织，并在连续培养过程中，分析和测定愈伤组织（细胞团）中生物活性组分的产生条件，拓展植物组织培养的研究深度和广度，甚至扩大为具备产业规模的系统。利用植物生物反应器培养愈伤组织，便于开展高通量诱变和变异体筛选。

5 总结与展望

通过仪器设备的研制提升研究和产业开发的效率，是科学工作者的长期追求。作为实验研究仪器和产业应用设备的植物生物反应器在性能等要求方面的发展是不一样的。首先，作为实验室研究仪器，新型植物生物反应器除了具备高通量的特点外，还需要建立和强化其检测功能、培养基组分的精准控制（补充和干预）、数据传输和分析功能等，使之具备智控性特征^［24］。同时，作为产业应用的设备系统，新型植物生物反应器还需在以下方面进一步提升：①高通量培养，显著提高生产水平；②环节和污染控制，如提供简便的O₃分子除菌等手段，控制微生物生长，提供更有利于植物生长的条件^［25］；③通过设备组件的补充，实现培养过程中的营养成分补充、效应物添加和产物监控；④与AI和物联网技术结合，降低组培产业对人工和现场逐一样本观测的依赖，提高智能化程度。

“工欲善其事，必先利其器”。以药用植物中植物源天然产物的发掘为例，国际上开展此类研究和发表论文数量最多的实验室分别在中国、美国和印度，而从植物源天然产物中首次发现有效抗癌药物的实验室分别是在美国、欧洲、印度和中国^［26］。造成研究效率差别的根本原因是我国科研团队主要通过植株和传统植物组织培养来寻找药物，而美欧实验室主要通过生物反应器，尤其是植物与内生菌共培养的方法，实现高水平表达和高通量筛选。在系统中药理论的带动下，新型植物生物反应器的发展和使用有可能弥补这一不足。但是，值得强调的是，第一，新型植物生物反应器作为植物组织培养的方法之一，不可能完全取代传统植物组织培养技术，相反前者往往需要后者准备的材料为基础，并以此提高后者的资源利用效率；第二，新型植物生物反应器不仅可以提供纯无菌条件下的植物组织、器官和种苗生长条件，也可以提供相对开放甚至有菌的生长条件。利用植物生物反应器进行开放式培养，或控制植物生长条件，有利于对植物和微生物互作关系的研究，如针对植物产代谢产物过程中的内生菌功能研究平台，也可能为植物促生长微生物的研究开发提供高效率的条件。

以间歇浸没为原理的新型植物生物反应器进行多种形态的植物细胞、组织和器官培养，通过控制培养条件，实现植物组织（器官）与植物内生菌等微生物共培养，不仅有利于建立植物代谢产物的持续高通量表达条件，有利于提高发掘植物源抗肿瘤药物等有价值的化合物，而且可能在高通量培养基础上开展植物与微生物互作关系研究，如内生菌等微生物对植物的促生长作用、拮抗菌（通过与病原菌及其寄主共培养）对病原菌的抑制作用等基础研究，从而拓展植物组织培养作为现代生物技术手段在理论研究和应用方面的新功能。

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