三种食用植物酵素中酵母菌的分离鉴定及耐受性试验

Isolatation， indentfication and tolerance of yeasts from three kinds of edible plant Jiaosu

摘要

从自然发酵的火龙果酵素、青梅酵素和葡萄酵素中筛选酵母菌，对筛选到的菌株进行鉴定及耐受性试验。从两种火龙果酵素中筛选到3株菌：P₁、P₂和P₃，从青梅酵素中筛选到2株菌：PM₁和PM₂，从葡萄酵素中筛选到2株菌：G₁和G₂；分子生物学鉴定结果显示：P₃、PM₁、PM₂和G₂为鲁氏接合酵母，P₁为酿酒酵母，P₂和G₁为丘陵假丝酵母。耐受性试验结果表明：筛选出的菌株在起始pH为2.5、3.0、3.5以及初始葡萄糖含量为300、400、600、750 g/L的培养基上均可生长，其中P₂、PM₁和G₁在培养基起始pH为2.0时可生长；P₂在培养基起始pH为1.5时可生长；筛选出的菌株均具有耐低pH和耐高糖的特性。

Abstract

In this study， the screening， identification and tolerance of yeasts from pitaya Jiaosu （PJS） ， Prunus mume Jiaosu （PMJS） and grape Jiaosu （GJS） were carried out. Three strains were isolated from two kind of PJS， P1， P2 and P3， and two strains from PMJS， PM1 and PM2. In addition， G1 and G2 from GJS were isolated. Gene sequence analysis identified that P3， PM1， PM2 and G2 were Zygosaccharomyces rouxii， P1 was Saccharomyces cerevisiae， and P2 and G1 were Candida apicola. Sugar resistance and low pH tolerance test showed that these isolates were able to grow with the initial pH 2.5~3.5 and initial glucose concentration 300~750 g/L. Growth occurred at pH 2.0 for P2， PM1 and G1. Specifically， growth was observed at pH 1.5 for P2.These isolates were low pH tolerance and sugar⁃tolerant yeasts.

Graphical abstract

关键词

酵素 / 酵母菌 / 鉴定 / 耐受性

Key words

Jiaosu / yeast / identification / tolerance

0 引 言

食用植物酵素（edible plant Jiaosu）是以一种或多种新鲜蔬菜、水果和谷豆类、海藻类、药食两用本草类、菌菇类等食材为原料，加（或不加）糖类物质，经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性微生物发酵产品，其次生代谢产物、植物本身营养成分和益生菌等含量丰富，研究表明该类产品具有抗衰老、抗菌消炎、净化血液、增强机体免疫能力及解毒抗癌等多种保健功能^［1~5］。

2019年，工信部颁布的《酵素产品分类导则》^［6］行业标准中，按照发酵工艺的不同，将酵素产品分为：纯种发酵酵素（artificial fermentation Jiaosu）、群种发酵酵素（natural fermentation Jiaosu）和复合发酵酵素（mixed fermentation Jiaosu），其中规定纯种发酵酵素是由人工培养的有明确分类名称的微生物发酵制得的；群种发酵酵素是由特定自然环境中的微生物发酵制得的；复合发酵酵素是由纯种发酵和群种发酵两种工艺共同制得的。已报道的用于纯种发酵酵素菌种有酵母菌^［7］、乳酸菌^［7］、醋酸菌^［8］等。目前，对自然发酵过程中优势菌种的研究较少。王珍珍等^［9］从树莓酵素中筛选到1株酵母菌，从葡萄酵素中筛选到3株酵母菌；凌空等^［10］从果蔬酵素中筛选到2种酵母菌和3种乳酸菌。分离纯化、分析食用植物酵素中的菌种，对于了解食用植物酵素的发酵机理、代谢、食用植物酵素产品的工业化生产等方面的研究具有指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火龙果酵素原液1（发酵1年，pH 4.0）、火龙果酵素原液2（发酵1年，pH 3.5）、青梅酵素原液（发酵5个月，pH 3.0）和葡萄酵素原液（发酵1年，pH 3.9），采用自然发酵工艺制备，均由浙江省农业生物资源生化制造协同创心中心提供。

实验中所用到的常规化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）、上海阿拉丁生化科技股份有限公司，培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器设备

超净工作台（SW⁃CJ型），购自无锡易纯净化设备有限公司；恒温培养箱（MB⁃150CL），购自青岛明博环保科技有限公司；小型立式恒温摇床（TS⁃2102C），购自上海天呈实验仪器制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ⁃LS⁃75SII型），购自上海博讯实业有限公司；冷冻离心机（Allegra X⁃12R），购自美国贝克曼库尔特有限公司；显微镜（SMART型），购自重庆奥特光学仪器有限公司。

1.3 培养基配制

PDA培养基、YEPD培养基的配制参照沈萍等^［11］的微生物学实验（第四版）；碳源基础培养基、碳源基础培养基、无维生素培养基参照周德庆^［12］的《微生物学实验手册》。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的分离纯化及形态特征鉴定

采用梯度稀释法，将植物酵素样品涂布于PDA培养基平板上进行酵母菌的分离纯化，直至在显微镜下观察到纯菌株为止。纯化好的菌株转接于斜面保存待用。菌株的形态特征按文献［9］的方法进行。

1.4.2 生理生化特征鉴定

菌株生理生化特征鉴定依据《酵母菌的特征及鉴定手册》^［13］和《微生物学实验手册》^［12］设计，包括：糖发酵鉴定、碳源同化试验、氮源同化试验、无维生素培养基上的生长试验、耐高渗透压的测试、产生类淀粉化合物测定等。

1.4.3 分子生物学鉴定

将分离纯化好的菌株送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行分子生物学实验。

1.4.4 耐受性试验

自然发酵工艺生产的食用植物酵素一般是在低pH和高糖的环境中进行发酵的，外接菌种发酵工艺一般是在低pH环境下进行发酵的，需要菌种具有一定的耐低pH和耐高糖特性。将菌株活化培养，制成1×10⁷ cfu/mL的菌悬液，按3%的接种量，接种于高糖YEPD培养基（起始葡萄糖含量为300、450、600、750、900 g/L，pH 5.0）和低pH的YEPD培养基（起始pH值为3.5、3.0、2.5、2.0、1.5，起始葡萄糖含量为20 g/L），28 ℃，150 r/min条件下恒温培养5~14 d，观察并记录菌株是否生长；培养前5 d，每隔12 h取一次样，测定OD_{600 nm}，以培养时间为横坐标，OD_{600 nm}为纵坐标，绘制菌株的生长曲线^［9］。

1.4.5 数据处理

对实验数据采用origin8.6进行分析，均表示成（平均值±标准偏差）（n=3）。

2 结果与分析

2.1 分离纯化、形态及培养特征观察

从火龙果酵素原液1中筛选到2株菌，分别标记为P₁，P₂；从火龙果酵素原液2中筛选到1株菌，标记为P₃；从青梅酵素原液中筛选到2株菌，分别标记为PM₁，PM₂；从葡萄酵素原液中筛选到2株菌，分别标记为G₁，G₂。通过固体培养、液体培养和显微镜观察，结果显示，筛选出的菌株菌落形态均为光滑，圆形，不透明，边缘整齐；菌落颜色为白色；微凸；易挑取，且粘稠。液体培养时，均有沉淀；无菌醭；浑浊。通过显微镜观察其细胞形态学时，细胞形态均为椭圆形；细胞长度为3.2~7.9 µm，宽2.4~6.7 µm；繁殖方式为芽殖。

2.2 生理生化特征试验结果

7株菌的生理生化试验结果见表1。

2.3 分子生物学鉴定

在GenBank数据库中，对7株菌的测序结果进行比对，同源菌株基因用MEGA7软件处理，得到系统进化树，如图1所示。结果显示，P₃、PM₁、PM₂和G₂与鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）的同源相似性均达到99%以上，P₁与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同源相似性均达到99%以上，P₂、G₁与丘陵假丝酵母（Candida apicola）同源相似性均达到99%以上；确定P₃、PM₁、PM₂和G₂是鲁氏接合酵母，P₁是酿酒酵母，P₂和G₁是丘陵假丝酵母。

2.4 耐受性试验结果

从青梅酵素中选取PM₁与其它5株菌一起进行耐受性实验。

2.4.1 低pH耐受性试验结果

pH能够影响微生物的生物活性、营养吸收、代谢产物及其稳定性。6株菌的低pH耐受性实验结果见表2，从表2中可以看出在培养基起始pH为3.5、3.0、2.5时，6株菌均可生长；当培养基的起始pH降到2.0时，只有P₂、PM₁、G₁可以生长；当pH降到1.5时，只有P₂可生长。6株菌株中P₂的耐低pH性最好，其次是PM₁和G₁，而P₁、P₃和G₂的耐低pH性稍差。

6株菌在低pH条件下，120 h内的生长曲线见图2，从图2中可以看出随着培养基起始pH的降低，菌株的生长受到抑制；对比P₃、PM₁和G₂，3株鲁氏接合酵母在起始pH为3.5、3.0、2.5时均可生长，P₃在起始pH为3.5、3.0、2.5时，延滞期分别为24、24、48 h；PM₁和G₂在起始pH为3.5、3.0、2.5时，菌株的延滞期一致，分别为24、24、72 h。P₃可在起始pH为2.0时生长，可能与其长期生长在较低的pH环境下有关。对比P₂和G₁，2株丘陵假丝酵母在初始pH为3.5，2.5和2.0时，菌株的延滞期一致；当初始pH为3.0时，P₂的延滞期较小。酿酒酵母P₁在起始pH为3.5、3.0、2.5时，菌株的延滞期分别为24、48、48 h。

2.4.2 高糖耐受性试验结果

6株菌株高糖耐受性实验结果见表3，从表3中可以看出：当初始葡萄糖含量的范围为300~750 g/L时，6株菌均可生长。

6株菌株在高糖耐受性实验中120 h内的生长曲线见图3，从图3中可以看出随着初始葡萄糖浓度的增加，菌株的生长受到不同程度的抑制，延滞期逐渐增长；在初始葡萄糖含量为750 g/L时，除G₁在5 d内进入对数生长期外，其它5株菌均未进入对数生长期，但随着时间的增长，5株菌在750 g/L的初始糖浓度下可生长；6株菌株G₁的耐糖性较好，其次是P₂、P₃和PM₁的耐糖性较好，P₁和G₂的耐糖性略差。

对比P₃、PM₁和G₂，发现P₃和PM₁在初始葡萄糖含量为300、450、600 g/L时，菌株的延滞期一致，分别为24、24、36 h，G₂在初始葡萄糖含量为300、450、600 g/L时，菌株的延滞期分别为12、36、84 h，耐糖性较P₃和PM₁略差。对比P₂和G₁，可以看出在初始糖浓度为750 g/L时，G₁先进入对数生长期，耐糖性较P₂略好。

3 结 论

本研究从火龙果酵素原液1中筛选到2株菌：P₁和P₂，从火龙果酵素原液2中筛选到1株菌：P₃；在青梅酵素原液中，筛选到了2株菌：PM₁和PM₂；从葡萄酵素原液中筛选到2株菌：G₁和G₂；通过生理生化实验、分子生物学实验，鉴定出P₃、PM₁、PM₂和G₂为鲁氏接合酵母，P₁为酿酒酵母，P₂和G₁为丘陵假丝酵母。

从青梅中选取PM₁，与其他5株菌株一起进行低pH耐受性和高糖耐受性试验。耐低pH试验结果表明：6株菌在培养基起始pH为2.5、3.0、3.5时均可生长，其中P₂、PM₁和G₁在培养基起始pH为2.0时可生长；P₂在培养基起始pH为1.5时可生长。王珍珍等^［9］研究表明，鲁氏接合酵母在起始培养基pH为3.5、3.0和2.5时可以生长；Wang等^［14］的研究表明，当pH低于2.0时，鲁氏接合酵母的生长受到明显抑制；Carmelo等^［15］的研究表明，当酿酒酵母在pH为2.5的条件下培养时，PMA2和HSP26两个基因转录水平增高，酿酒酵母在pH为2.5~5.0之间可以生长；与本实验结果基本一致。高糖耐受性试验结果表明：6株菌均可在葡萄糖初始含量300~750 g/L的条件下生长。韩晓江等^［16］研究表明：在糖质量分数为80%的培养基中，鲁氏接合酵母会产生糖类、醇类和氨基酸等物质，来促进其在高糖环境中生长；鲁氏接合酵母上的蛋白ZrFfz1和ZrFfz1，具有低亲和力，高容量的特性，在高糖条件下，可以同时运输葡萄糖和果糖^［17］；徐伟等^［18］研究表明，酿酒酵母可以在高糖环境下生长，高糖环境下，酿酒酵母细胞质与细胞膜之间出现锯齿状，细胞质浓度变大，液泡变大。薛梅等^［19］研究表明酿酒酵母可以在蔗糖浓度为700 g/L的培养基中生长，当蔗糖浓度为800 g/L时，酿酒酵母不能生长。Tofalo等^［20］研究表明丘陵假丝酵母是一株耐高渗的菌株，可以在葡萄糖含量为60%的条件下生长。综上可知，6株菌株均具有耐低pH和耐高糖的特性。

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基金资助

国家自然科学基金项目(30870553)

浙江省自然科学基金项目(LQY18B060002)

中国博士后科学基金项目(2018M632475)

浙江省重点研发计划项目(2017C02009)

省属高校基本科研业务费专项资金项目(2019JL10)

浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心开放基金项目(2016KF0040)

浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心开放基金项目(2016KF0114)