Box⁃Benhnken响应面法优化白及愈伤组织的增殖培养基配方

Optimization of Bletilla striata proliferation medium formula by Box⁃Benhnken response surface methodology

摘要

为了提高白及组培过程中愈伤的增殖系数，以白及种子为外植体，利用响应面法对诱导愈伤的增殖培养基中的激素水平进行优化。在添加不同浓度的6⁃BA（6⁃苄氨基嘌呤）和2，4⁃D（2，4⁃二氯苯氧乙酸）的正交试验诱导愈伤基础上，根据Box⁃Benhnken（BBD）试验设计原理，采用三因素三水平的方法对3个激素的不同浓度水平进行组合实验。结果显示，通过回归模型分析获得增殖诱导的最佳培养基为MS+0.801 mg/L 6⁃BA（6⁃苄氨基嘌呤）+1.192 mg/L 2，4⁃D（2，4⁃二氯苯氧乙酸）+0.724 mg/L NAA（萘乙酸）。以优化后培养基进行愈伤组织继代发现其增殖系数为6.154 2，为理论预测值的99.74%。利用响应面法对愈伤组织增殖培养基进行优化，为以愈伤组织为研究材料的细胞悬浮培养、遗传转化、种苗快繁等研究奠定了基础。

Abstract

To improve the proliferation effeciency of callus during tissue culturing in Bletilla striata， the seeds were used as explants， and the hormone level in the proliferation medium for inducing callus was optimized by the response surface methodology. On the basis of callus induction by orthogonal experiments with 6⁃BA and 2，4⁃D at different concentrations， combined experiments were carried out with three factors and three levels according to the design principle of Box⁃Benhnken （BBD） experiment. The optimal medium for proliferation induction was MS+0.169 mg/L 6⁃BA+1.635 mg/L 2，4⁃D+0.631 mg/L NAA through regression analysis and the multiplication factor was 6.1542， which was 99.74% of the theoretical predicted value. The response surface methodology was used to optimize the callus proliferation medium， which laid a foundation for researches of cell suspension culture， genetic transformation and seedling rapid propagation based on callus.

Graphical abstract

关键词

白及 / 愈伤组织 / 增殖 / 培养基配方 / Box⁃Benhnken（BBD）响应面法

Key words

Bletilla striata / callus / proliferation / medium formula / Box⁃Benhnken response surface methodology

0 引 言

白及（Bletilla striata （Thunb.） Rchb.f.）为兰科（Orchidaceae）白及属（Bletilla）的多年生草本药用植物，其用途不断拓展但资源日益减少。白及在温带、亚热带和热带均有分布，在我国主产于长江流域、甘肃、陕西等地^［1］，其中贵州正安县出产的白及于2013年被国家质检总局认定为“国家地理标志保护产品”。白及是我国传统的名贵中药材，药用价值广泛。历代药典记录其具有收敛止血、消肿生肌的功效，可用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等疾病^［2］。现代药理学研究表明，白及具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗消化性溃疡、免疫调节等作用^［3~7］。除了在药用方面的应用，白及还被用作工业、园艺等的原材料，其用途还在不断拓展，人们对白及的需求量正在急速增加。然而，由于生态环境的破坏和过度采挖，野生白及的种群类型和数量急剧下降，濒临灭绝，目前已被国家列为重点保护的野生药用植物，亟需开展种质资源保护和拓展、新品种选育、种苗快繁等方面的研究，而愈伤组织的诱导和繁育是这些研究的良好基础。因此，建立和优化白及愈伤诱导和增殖培养的培养基配方和技术体系具有十分重要的基础研究和应用实践价值。

在植物组织培养的过程中植物生长调节剂占有重要的位置，即用很小的量就可以在植物组织培养的各个环节发挥作用^［8］。关于白及愈伤组织诱导和增殖培养已有很多报道，但是在愈伤组织培养的过程中，不同激素浓度配比对愈伤组织的诱导和增殖的影响不同。有研究发现，6⁃苄氨基嘌呤（6⁃BA）、2，4⁃二氯苯氧乙酸（2，4⁃D）和萘乙酸（NAA）三种激素在不同浓度配比的基础上可以促进白及愈伤组织的诱导和增殖。虽然目前的培养基类型可以诱导出白及愈伤组织，但是没有用科学的研究方法对培养基进行更加系统的优化。而在单因素试验的基础上进行响应面优化设计，不仅可以使得到的培养基类型更具科学性，还可以为今后在细胞和分子水平上研究白及提供技术支持和理论指导^［9，10］。

响应面分析法是分析几个独立变量的统计程序，是研究多因素对因变量影响及其互作关系的良好试验设计和统计分析方法^［11］。它在多元二次回归方程的基础上用多项式近似拟合多因子实验中因子指标的相互关系，通过分析等高线和函数响应面，对各因子与响应值之间的关系做到精确表达^［12］，最后能够以最经济的方式全面地研究和分析所选实验参数，因而在培养基优化、化学萃取方法优化等试验中被广泛应用^［13~15］。响应面法包括Box⁃Benhnken（BBD）试验设计法和中心组合试验设计法。相比于中心组合试验设计法，BBD试验设计法包含的设计点更少，对于相同数量因素的实验设计，后者具有更低的实施成本和更好的实验效果^［16］。

本文以白及种子为外植体，诱导愈伤组织并优化适宜愈伤细胞增殖的培养基。以愈伤组织增殖率为指标，设计6⁃BA、2，4⁃D和NAA 三因素三水平试验，应用BBD响应面法对愈伤组织继代培养配方进行优化，寻求最佳培养基，以期为基于愈伤诱导和培养的基础和应用研究奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

材料为采自贵州正安、安徽亳州、重庆南川、四川阿坝州、陕西汉中的紫花白及成熟蒴果，由遵义医科大学细胞生物教研室钱刚教授鉴定。

1.2 培养基与培养条件

试验所用基本培养基为MS+琼脂6.0 g/L+蔗糖30 g/L，附加不同浓度的6⁃BA、2，4⁃D和NAA。pH值5.8~6.0，培养温度为（25±2） ℃，暗培养。所用试剂为国产化学纯药品，所用设备为植物组培实验室常用仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 消毒蒴果

取饱满未开裂的白及成熟蒴果，流水下冲洗20 min，剥开白及蒴果，倒在已灭菌的10 mL EP管中，置超净工作台上打开用75%酒精浸泡30 s，并不断轻摇，用无菌水冲洗3次，再加入有两滴Tween⁃80的0.1%氯化汞中浸泡20 s，浸泡过程中不断轻摇，最后用无菌水冲洗5次，用吸水纸吸干表面的水分，备用。

1.3.2 愈伤组织诱导

先利用两因素三水平正交实验设计诱导愈伤组织，共设计出9种6⁃BA与2，4⁃D激素浓度组合类型，对应各水平分别为6⁃BA：1.0、1.5和2.0 mg/L；2，4⁃D：1.0、2.0和3.0 mg/L。将所得到的无菌白及种子转入这9种培养基中，每次接种每种处理10瓶，3次重复。培养过程中愈伤组织的生长情况需要定期观察，在培养50 d后计算愈伤组织的诱导率。

愈伤组织诱导率（%）＝诱导出愈伤组织种子数／接种种子的个数×100%

1.3.3 愈伤组织继代优化试验

响应面法试验设计采用响应面分析法，根据BBD试验设计原理，确定BBD试验因子为不同浓度的6⁃BA、2，4⁃D和NAA，响应值为愈伤组织增殖率，设计响应面试验。对应各水平分别为6⁃BA：0、0.5和1.0 mg/L；2，4⁃D：1.0、1.5和2.0 mg/L；NAA：0、0.5和1.0 mg/L，共设计出13种培养基类型。然后对6⁃BA浓度x₁，2，4⁃D浓度x₂和NAA浓度为x₃作变换，以愈伤组织增殖率为响应值y。

从1.3.2中优选培养基上挑选出疏松、嫩黄的愈伤组织，接种在这13种增殖培养基中，20 d后计算愈伤增殖率。

愈伤组织增殖率（%）＝增殖后愈伤组织重量／增殖前愈伤组织重量×100%

1.4 结果分析

采用spss13.0软件和Design⁃Expert10软件对试验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度6⁃BA，2，4⁃D对愈伤组织诱导的影响结果

愈伤组织诱导50 d之后，通过两因素三水平的正交实验结果，获得白及愈伤最佳诱导培养基为MS+1.0 mg/L 6⁃BA+2.0 mg/L 2，4⁃D+琼脂6.0 g/L+蔗糖30 g/L。该组合诱导出的愈伤组织率的平均值为84.06%（表1），而且不会产生丛生芽，诱导出的愈伤组织呈黄绿色，褐化率<10%，诱导愈伤率>80%。如图1，在MS+1.0 mg/L 6⁃BA+2.0 mg/L 2，4⁃D+琼脂6.0 g/L+蔗糖30 g/L浓度培养基下诱导的愈伤组织率明显大于MS+2.0 mg/L 6⁃BA+3.0 mg/L 2，4⁃D+琼脂6.0 g/L+蔗糖30 g/L浓度培养基下诱导的愈伤组织。

2.2 响应面分析方案及结果

2.2.1 结果分析

采用spss13.0软件对试验结果进行分析。当6⁃BA、2，4⁃D和NAA都在0水平的时候测得的愈伤组织增殖率最大，为6.71%（表2）。

2.2.2 显著性检验

所得数据经Design⁃Expert10进行回归分析，以愈伤增殖率为响应值，经回归拟合后，最终得到的回归预测方程：

y=6.17+0.14x₁-0.67x₂-0.13x₃+0.40x₁x₂+0.18x₁x₃-0.17x₂x₃-0.31x₁²-1.23x₂²-0.59x₃²

式中：y为愈伤组织增殖率（%）；x₁为6⁃BA浓度（mg/L）；x₂为2，4⁃D浓度（mg/L）；x₃为NAA浓度（mg/L）；回归方程的失拟检验P=0.005<0.05，差异显著。方程一次项的影响中x₁的P=0.2836>0.05，不显著；x₂的P=0.001<0.05，显著；x₃的P=0.3203>0.05，不显著；二次项x₁²的P=0.1095>0.05，不显著；x₂²的P=0.0002<0.01，极显著；x₃²的P=0.01<0.05，显著；R²=0.9418表明94.18%的试验数据可用此模型解释。由此可以看出，该回归方程对试验拟合情况好，可以很好地描述各因素与响应值之间的真实关系。比较三种激素发现，2，4⁃D对白及愈伤组织增殖的影响最大（表3）。

2.2.3 响应曲面分析与最佳培养条件预测

响应曲面分析（RSM）的图形是特定的响应值y对应自变量构成的三维空间图，从响应面图上可以直观地反映出6⁃BA、2，4⁃D和NAA三个因素对白及愈伤组织增殖的影响。由图2可以看出2，4⁃D对白及愈伤组织的增殖率影响最大，曲线面最陡；其次是NAA，曲面线较陡；三个激素中对愈伤组织增殖率影响最小的是6⁃BA，曲面线趋于平缓。因为三张响应面分析图均为山丘形曲面，所以在曲面的顶点处都有极大值。

2.2.3 最佳培养条件的实验验证

实验得到最佳培养基配方：6⁃BA浓度为0.801 mg/L，2，4⁃D浓度为1.192 mg/L，NAA浓度为0.724 mg/L，进行愈伤组织增殖的验证，每次10瓶，3次重复试验。通过20 d的继代培养计算愈伤组织增殖率，实际的增殖率为6.154 2，是理想预测值的99.74%。因此，通过BBD试验得到的最佳愈伤增殖配方准确可靠，具有实际参考价值。

3 结 论

在现有的愈伤组织诱导和增殖基础上，已经筛选出的对白及愈伤组织诱导及增殖培养基条件具有显著影响的三个因素，即6⁃BA的浓度、2，4⁃D的浓度、NAA的浓度，对白及的种子诱导培养基进行正交试验设计，对白及愈伤组织继代进行响应面试验设计，最后得出白及愈伤组织增殖的最佳培养基。

计算愈伤组织继代增殖的效果，除了增殖率和生长状况外，还需要综合考虑其他方面的因素，例如是否出现硬化、褐化、出芽、生根等问题。在进行响应面法设计时，选用了生长情况良好，鲜黄绿色，质地疏松的愈伤组织来计算增殖率，并作为响应值^［9］。在继代培养过程中，利用BBD组合试验，并进行响应面分析，得到最佳配方为：MS+0.801 mg/L 6⁃BA+1.192 mg/L 2，4⁃D+0.724 mg/L NAA+琼脂6.0 g/L+蔗糖30 g/L。经验证试验获得的愈伤组织生长旺盛，嫩黄色，颗粒状，质地疏松，褐化率明显减小。

通过正交试验和响应面试验设计，使对白及进行组织培养的培养基种类更加的丰富，覆盖的培养基范围更加广泛，试验结果更具科学性。前人的试验对培养基种类是一种广泛初筛，而本试验是对培养基更加系统的筛选，从而使获得的优化培养基的激素浓度更加精确。试验得到最佳培养基配方，可以为白及愈伤组织其他相关研究提供材料基础，也可以为白及组织培养的进一步研究提供参考。同时，对白及愈伤组织响应面优化设计的实验方法也能为以后其他材料的研究提供新的思路。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31560079)

国家自然科学基金项目(31560087)

贵州省科学技术基金项目(黔科合LH字［2014］7549号)

贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(黔科合ZY字【2013】3002号)

遵义市2014年度“15851”人才工程项目(201424)

遵义医科大学2018年研究生社会实践项目(zy⁃yjs2018001)