脱落酸和赤霉素调控种子休眠与萌发研究进展

Review of investigation progress of ABA and GA regulating seed dormancy and germination

摘要

种子的休眠与萌发是高等植物生长发育进程中非常重要的环节，是维系物种繁衍的重要过程。而激素在这一过程中扮演着非常重要的角色。而在这个过程中脱落酸（abscisic acid, ABA）和赤霉素（gibberellin GA）发挥着尤其重要的作用。本文综述了当前对复杂分子网络的理解，这些分子网络涉及脱落酸和赤霉素在调节种子休眠和萌发中的关键作用，其中含AP2结构域的转录因子起着关键作用。

Abstract

The dormancy and germination of seeds is a very important link in the growth and development of higher plants and an important process for maintaining species reproduction. Hormones play a very important role in this process. Abscisic acid (ABA) and gibberellin (GA) play a particularly important role. This review summarizes our current understanding of the sophisticated molecular networks involving the critical roles of phytohormones in regulating seed dormancy and germination, in which AP2⁃domain⁃containing transcription factors play key roles.

关键词

脱落酸 / 赤霉素 / 种子休眠 / 萌发

Key words

abscisic acid / gibberellin / seed dormancy / germination

0 引 言

在自然界长期的演化过程中，为了更好地适应环境并应对环境中物理因素的影响，大多数种子都具有休眠的特性^[1]。对于种子休眠，至今仍然没有一个完全被认同和接受的定义，普遍被接受的是Baskin等^[2]所提出的：种子休眠是指在一定时间内不能萌发的现象，在任何物理因素组合作用下，这种种子本身具有正常的活力。种子的休眠强弱在不同的植物种群中是存在差异的，种子休眠的这一特性在物种的繁衍、保存中发挥着极其重要的作用，但在农业生产、园林艺术等方面却有着不良的影响^[3]。种子由休眠状态转变为萌发状态的过程实际上是种子内部和外界环境因子的共同调节作用的结果，在这一过程中环境因子调控内源组分从而影响种子的萌发。激素通过调控相关基因的表达和细胞信号的转导以实现其生物学功能。在种子由休眠向萌发转变的过程中，在细胞信号转导作用下，一系列蛋白质、酶的代谢受到调控。赤霉素（gibberellin， GA）、脱落酸（abscisic acid， ABA）、细胞分裂素和乙烯与种子的休眠与萌发的调控过程息息相关，本文综述了ABA、GA两种激素调控种子休眠与萌发的研究进展。

1 种子休眠分类及影响因素

植物种子休眠通常可以分为由种皮引起的休眠和由胚引起的休眠两种。在由种皮影响的休眠中，种皮的作用方式是限制气体交换和种子对水分的吸收。某些种胚只有通过去除种皮后才能与氧气直接接触。通过去除种皮，不仅能够避免种子中CO₂的积累使植株代谢失调，从而导致种子无法萌发；同时也可以防止种皮对胚产生的CO₂的阻抑作用。种皮除了限制气体交换，过硬的种皮也会导致吸胀困难，有些植物种子的种皮结构致密，表皮有角质或蜡质沉积物，导致水分无法顺利的透过表皮而使得种子萌发非常困难。在Baskin关于种子休眠分类中，将植物种子休眠分为五个类型，即生理休眠（physiological dormancy, PD）、形态休眠（morphological dormancy， MD）、生理形态休眠（morpho⁃physiological， MPD）、物理休眠：（physical dormancy， PY）、综合休眠（combinational，PY+PD）。有研究者^[2,4]曾分析了5种休眠类型和植物系统进化树之间的关系，发现MD/MPD种子存在于原始的被子植物中，该类种子具有未发育的、需要较长时间生长的胚，种子散布后，在不同的时间分散萌发。这些被子植物的类群有:木兰科（Magnoliaceae）、五味子科（Schisandraceae）、毛茛科（Ranunculaceae）、罂粟科（Papaveraceae Juss.）、马兜铃科（Aristolochiaceae）、小檗科（Berberidaceae）、芍药科（Paeoniaceae）、伞形科（Umbelliferae）、五加科（Araliaceae）等双子叶植物科，以及百合科（Liliaceae）、天南星科（Araceae）等单子叶植物科；裸子植物中原始的科，如银杏科（Ginkgoaceae）、罗汉松科（Podocarpaceae）和红豆杉科（Taxaceae）等也常见具MPD型种子。此外，其他几种类型休眠种子在植物中的分布情况是: PD是植物系统发育树上分布最广的休眠类型，从裸子植物、被子植物中原始到高级的几乎所有的科都有分布；PY/（PY+PD）型的植物具有不透性的种皮(果皮)，这类休眠可能是植物对于专一生活策略和生境的一种适应，是一种衍生的、较为特化的休眠类型，也比较集中地出现在某些科中，如豆科（Leguminosae sp.）、牻牛儿苗科（Geraniaceae）、蔷薇科（Rosaceae）、漆树科（Anacardiaceae）等；非休眠种子广布于整个系统发育树上所有类群。因此根据上述规律，判断一种植物种子的休眠类型可先看其所属的类群，同属或同科植物的种子常具有类似的休眠特性，这有助于我们进行休眠类型的最初判断。而Harper分类系统——将种子休眠分为内生型、诱导型和强迫型的分类方法在已发表的关于种子休眠文献中的应用较多。这种分类方法的侧重点更多的是引起种子休眠萌发的环境学因素，而不过多考虑种子休眠本质的多样性。

2 脱落酸（ABA）对种子休眠的调控机制

2.1 种子休眠的建立

在过去的研究中，人们普遍认为ABA和GA是拮抗调节种子休眠和萌发的主要激素^[5,6,7,8,9]。在种子的成熟和发育期间，随着内源ABA的不断积累，种子呈现出休眠状态，并且这种状态将被维持，从而防止胎生。而种子在萌发过程开始之前，内源ABA的水平会下调^[10]，GA含量会发生上调。

种子能够在适当的时间发芽离不开种子休眠。种子在成熟的过程中，胚胎是处于静止状态的，种子中贮存的营养物质均不会被利用，并且在这个过程中细胞不进行分裂或伸长。因此当种子处在这种静止的状态下时，也并不会主动表达促进萌发的基因，导致胚根不会穿透种皮和胚乳。现在广泛认识到染色质结构决定了基因表达，从而调节了众多的发育过程。近年来有研究报道，许多与染色质重塑相关的基因调节种子休眠和萌发^[11,12,13]。新出现的证据表明，ABA也参与染色质重塑^[14]。例如，组蛋白甲基转移酶基因KYP/SUVH4被ABA抑制^[13]，而组蛋白乙酰转移酶HvGNAT/MYST由ABA诱导^[15]，表观遗传调节因子HUB1和RDO2是在诱导种子休眠期间显著上调^[16]。这些研究表明，表观遗传调控相关基因在种子成熟过程中具有关键作用，此后影响种子休眠建立过程。

2.2 ABA对种子休眠的维持

ABA是种子休眠的主要诱导物和保护物^[17]。种子中ABA含量的多少，取决于其合成与代谢途径的动态平衡。典型的ABA缺陷型突变体的种子比野生型更快地发芽^[18]，组成型表达ABA生物合成基因的转基因植物种子保持深休眠特性^[19,20]。而ABA分解代谢突变体中ABA的高水平积累，导致种子高度休眠^[21]。种子休眠不仅受到ABA的生物合成的影响，也受到ABA的信号传导依赖性途径的影响。在种子萌发过程中，ABA信号必须脱敏，在此过程中，膜相关转录因子肽酶S1P（位点⁃1蛋白酶）和S2P（位点⁃2蛋白酶），将bZIP17蛋白从内质网（ER）加工后运输至高尔基体，然后至细胞核^[10]；经过活化之后的bZIP17蛋白调节ABA信号传导负调节因子的下游转录^[22]。ABA通过PYR/PYL/RCAR⁃PP2C⁃SnRKs信号级联反应起作用^[23,24]。PP2C蛋白ABI1和ABI2与ABA受体结合以抑制信号传导^[25]。这两者的显性失活突变体abi1⁃1和abi2⁃1由于突变蛋白与受体之间相互作用的失败，导致种子休眠被减弱。另一种PP2C蛋白HONSU，在抑制ABA的信号传导和激活的同时，也抑制GA信号的传导，因此作为种子休眠的负调节因子^[26]，这表明了HONSU是种子休眠与萌发调节因素——ABA和GA串扰的关键因子。出乎意料的是，新发现的PP2C基因RDO5（简化休眠5）显示出强烈减少的种子休眠表型，但其ABA敏感性和含量保持不变^[27]。进一步的遗传和生物信息学分析表明，RDO5通过介导RNA结合基因，APUM9（拟南芥PUMILIO 9）和APUM11的PUF家族的转录来调节种子休眠。该证据表明RDO5介导的调节途径不同于ABA信号传导途径，需要进一步详细研究。

2.3 ABA信号传导的主要下游组分

ABI3是ABA信号传导的主要下游组分，因此是种子休眠和萌发的主要调节剂^[28]。ABI3表达受DEP（DESPIERTO）调节，其在种子发育期间参与ABA敏感性的调控，并且dep种子显示完全休眠丧失^[29]。WRKY41还通过在种子成熟和萌发期间直接控制ABI3转录来调节拟南芥种子休眠^[30]。ABA信号传导途径中的另一个关键组分ABI4也被描述为初级种子休眠的正调节因子。另外的研究表明MYB96，即ABA反应性R2R3型MYB转录因子，通过介导ABI4和ABA生物合成基因（包括NCED2和NCED6）的表达，正调节种子休眠并负调节萌发^[31,32]。此外，一项研究表明，钙还通过影响控制ABA信号传导的ABI4转录来调节种子萌发^[33]。这些研究证明了从种子休眠到萌发过渡期间ABA信号传导中正调节因子的关键调节作用。

尽管ABI5对种子休眠没有影响并且不影响休眠水平，但该转录因子负面调节种子萌发^[34,35]，这说明了ABA具有一种独特的信号传导路径。最近的一项研究表明，MAP3K（丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶）基因RAF10和RAF11通过影响ABI3和ABI5转录来调节种子休眠^[36]。在转录后水平，PKS5（SOS2样蛋白激酶5，也称为CIPK11或SnRK3.22）磷酸化ABI5中的特殊残基（Ser42）并控制ABA响应基因的转录，从而精确调节ABA信号传导和发芽过程。总之，内源ABA水平和ABA信号正调节种子休眠，负调节种子萌发，同时一些相关基因参与该生理过程。

3 GA对种子萌发的调控机制

在促进种子萌发和种子休眠释放加强的过程中，另一种关键的植物激素GA起着不可忽视的作用^[37]。GA主要通过拮抗抑制由ABA触发的种子休眠来打破休眠并刺激发芽^[5,7]。赤霉素的生物合成是破除种子休眠的必要条件之一。种子发育初期主要进行胚的扩张以及物质的储存，赤霉素可以加速这两个进程的完成。此外，赤霉素在种子从胚转变成植物的过程中起着不可忽视的作用^[38]。当种子处于萌发后期时，赤霉素对胚乳等屏障组织的软化作用促进水解酶的表达，这种变化可以从一定程度上降低种子胚根尖的机械阻力，进而促进胚根对种皮的突破。GA水平升高或GA信号的传导能够显著地促进种子萌发，这可能是由于水解酶的分泌增加，从而使种子种皮结构被削弱^[39]。但在拟南芥中，该过程的详细机制很大程度上是未知的。GA缺陷型突变体，例如ga1和ga2，显示出强烈的种子休眠，并且在没有外源GA处理的情况下不能发芽^[40]。相反，具有生物活性的GA在GA2⁃氧化酶（GA2ox）缺陷的突变体的作用下发生失活，种子的休眠程度却被降低^[26]。类似地，DELLA基因突变，包括RGL2（RGA⁃LIKE2）和SPY（SPINDLY），GA信号通路的负调节因子，可以拯救ga1的非萌发表型。有研究发现^[41]，在拟南芥种子休眠与萌发过程中存在一种新型特定调节剂AtSdr4L，AtSdr4L编码一种生化功能未知的蛋白质，该蛋白质位于细胞核中并在种子中特异性表达。AtSdr4L的功能丧失导致种子休眠增加。atsdr4l为AtSdr4L的隐性突变株，atsdr4l种子的萌发对GA不敏感。熟化后的atsdr4l种子对多效唑（paclobutrazol）高度敏感，但对ABA的敏感性不变。atsdr4l种子在休眠和后熟中，一些GA生物合成基因和GA调控的细胞壁重塑基因均被下调。这些结果表明，atsdr4l突变引起GA生物合成和应答降低。遗传分析表明，AtSdr4L对休眠的萌发延迟1（DOG1）具有上位性，在GA途径中作用于RGA⁃LIKE 2（RGL2）上游。因此，AtSdr4L可能通过介导DOG1和GA途径调节种子的休眠和萌发。

4 含有AP2结构域的转录因子在ABA/GA动态平衡调节中的作用

毫无疑问，高内源ABA和低GA水平导致种子深休眠，相反，低内源ABA和高GA水平诱导发芽。调节ABA/GA两者动态平衡的形式主要有两个方面：激素水平高低的平衡和两者在信号级联上的平衡。那么ABA和GA的水平高低调节中，谁是因？谁是果？据报道，ABA在GA的生物合成过程中有抑制作用^[42]；另一方面，在种子的萌发期间，GA也能够负调节ABA的生物合成^[43]。因此，ABA和GA可能在种子休眠与萌发过程中互为因果从而产生相互作用^[44]。到目前为止，关于ABA/GA平衡所涉及的分子机制是如何被精确控制，在很大程度上仍然是未知的。但是相关的研究表明，含有AP2结构域的转录因子在二者的调节过程中具有关键作用。

有文献报道，ABI4在许多信号通路的调节过程中作为重要的通用因子，其中包含对ABA、葡萄糖、蔗糖、乙烯（ETH）和盐胁迫的反应^[45]。ABA的分解代谢基因可以被ABI4正向调节^[26]，而对GA的生物合成基因具有负调节作用；所以，当ABI4的功能丧失之后，GA生物合成基因的表达将被增加，GA失活基因的表达被降低，因此在abi4原始种子中，种子休眠减少。ABI4作为ABA的一种转录因子，同时也含有AP2结构域，可以通过直接结合CYP707A1和CYP707A2的启动子，在ABA的分解代谢过程中发挥着不可忽视的作用，促进ABA积累。然而，迄今为止尚未发现ABI4可以直接靶向结合GA代谢基因，这表明了ABI4在相关过程中可能不直接与GA生物合成基因的启动子结合，但有可能通过募集或激活另外的种子特异性转录因子从而抑制GA生物合成基因的转录。然而，在高粱中，SbABI4和SbABI5却可以直接结合SbGA2ox3的启动子，可能在激活其表达并影响种子休眠的过程中发挥一定的作用^[46]。通过这些发现可以启发我们，通过进一步对ABI4抑制GA信号传导的研究，可以鉴定出ABI4⁃GA信号传导串扰中的缺失链接。ABI4的转录受到转录因子SPT（SPATULA）调节，SPT也是种子休眠调节途径中的关键因子，它的作用取决于生态型背景^[16]；此外，在种子的成熟过程中SPT的表达量被增加^[47]，这表明了在种子休眠的建立和维持过程中，SPT⁃ABI4模块有关键性的作用。类似地，另一种含有AP2结构域的转录因子CHO1（CHOTTO1）正调节种子休眠，并且该转录因子在遗传上在ABI4的上游发挥作用。在水稻中，含有AP2结构域的转录因子OsAP2⁃39的单子叶植物模型能够直接促进ABA生物合成基因OsNCED1的转录和GA失活基因OsEUI（细长的上层间节点）的表达，从而增强ABA生物合成同时使GA的积累量减少^[47]，因此，OsAP2⁃39的转基因过表达导致种子休眠增加^[48]。这些表型已在GA缺陷型突变体中记录，表明OsAP2⁃39在调节ABA/GA生物合成平衡中起关键作用。DDF1（DELAYED FLOWERING 1），另一种参与者和另一种AP2类转录因子，直接促进GA失活基因GA2ox7的转录，从而显著降低内源GA含量^[49]。下一个参与者，EBE（ERF BUD ENHANCER），也是含有AP2结构域的转录因子，已被证明可以正向调节种子休眠。总之，这些含有AP2的转录因子负向调节GA生物合成，同时正调节ABA生物合成。

因此，具有AP2结构域的转录因子在微调种子休眠和萌发中对ABA和GA生物合成的双重调节中起着关键但神秘的作用^[50]。据推测，DNA基序可能属于这些调节因子，并且可能具有关于种子休眠调节的未发现的功能，尤其是关于生物合成和/或信号传导水平的ABA/GA平衡。此外，由于这些基因正向调节内源ABA并降低GA水平，因此转基因过表达株系显示出深度休眠水平和其他不良农艺性状，因为最佳内源激素水平对正常植物发育至关重要。因此，这些转录因子（ABI4，DDF1，OsAP2⁃39和CHO1）的负调节对于正常种子休眠是重要的，并且这些因子必须通过这些未知的负调节因子在mRNA和蛋白质水平上严格调节。最后，进一步筛选这些突变体的抑制子（例如abi4，ddf1，osap2⁃39和cho1）可提供关于种子休眠和萌发中AP2家族的遗传网络的重要信息。

5 总结与展望

产生后代并维持物种的繁衍是植物种子的最终作用。因此，植物通过数万年的进化，已经形成了很多种策略以确保该遗传传递媒介即种子的成功发芽。种子在正确的时间和空间萌发对于种子植物的生存和繁衍至关重要，因此植物种子进化出了休眠状态^[51]，并可能成为种子的普遍机制，而该过程的调节机制是物种的特定变异。在模式植物拟南芥和水稻中，关于赤霉素和脱落酸在种子休眠和萌发调节过程中，一些关键的影响因素的研究已经取得了很大的进展，但是仍然有一些问题是未知的，比如二者是如何与其他的影响因素形成一个调控网络、各个因子之间如何互相影响以调节种子休眠与萌发状态的转变等等。未来关于这些调节机制的突破将提供更完整的激素介导的种子休眠和发芽网络。

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基金资助

国家重点研发计划项目(2016YFC050310501)