新德里金属β⁃内酰胺酶⁃1及其突变体结构与功能研究进展

The structures and functions of New Delhi metallo β⁃lactamase⁃1 and its mutants: an updates

摘要

耐药菌株所分泌表达的新德里金属β⁃内酰胺酶⁃1(New Delhi Metallo β⁃lactamase⁃1, NDM⁃1)是金属⁃β⁃内酰胺酶家族的成员，能够催化几乎所有β⁃内酰胺类抗生素的水解，其迅速传播已成为人类健康的严重威胁。我国是产该酶病原菌分离率较高的国家之一，绝大部分为革兰氏阴性菌。到目前为止，全世界已报道了由16个突变位点和1个插入位点所形成的21种不同的NDM突变体，这些突变体的核酸序列通过单个或多个碱基取代或插入而改变。本文总结了NDM⁃1的结构及催化水解机理，对其结构中α⁃螺旋、β⁃折叠和环区结构进行了探讨，并基于此突变位点对该酶结构的影响进行了分析。这些区域所发生的突变，直接影响其水解底物的活性。深入了解这些突变对其结构和功能方面的影响，对于在分子水平上的进化研究具有十分重要的意义。

Abstract

New Delhi Metallo β⁃lactamase⁃1 (NDM⁃1) secreted by drug⁃resistant strains is a member of the metal⁃β⁃lactamase family, which is capable of catalyzing almost all β⁃lactams. The rapid spread of NDM⁃1 has become a serious threat to human health. China is one of the countries with high isolation rate of the pathogens producing this enzyme, and most of them are Gram⁃negative bacteria. To date, 21 different NDM mutants have been reported. These mutants are formed by sixteen mutation sites and one insertion site, and the nucleic acid sequences of these mutants are altered by single or multiple base substitutions or insertions. This paper summarizes the structure and catalytic hydrolysis mechanism of NDM⁃1 and discusses the structure of α⁃helix, β⁃sheet and loop region. Based on the structural analysis of the effect of the mutation site, the mutations in these regions directly affect the activity of the hydrolyzed substrate. An in⁃depth understanding of the effects of these mutations on their structure and function is of great importance for evolutionary studies at the molecular level.

Graphical abstract

关键词

新德里金属β⁃内酰胺酶⁃1 / 突变体 / 结构与功能

Key words

New Delhi metal β⁃lactamase⁃1 / mutant / structure and function

0 引 言

β⁃内酰胺类抗生素是全球临床使用最广泛的抗菌药物，其特征在于具有四元β⁃内酰胺环（含氮环状酰胺），该结构对其抗菌活性至关重要^[1]。β⁃内酰胺类抗生素通过竞争性抑制参与细胞壁肽聚糖生物合成的关键酶——转肽酶来抑制细菌生长。肠杆菌科细菌对抗生素耐药的主要机制与这些菌株能表达多功能的β⁃内酰胺酶有关，这类酶可催化β⁃内酰胺环的水解，导致β⁃内酰胺类抗生素（如青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类）的失活^[2]，如图1所示。

1 β⁃内酰胺酶的分类

Ambler分子分类方案基于序列同源性将β⁃内酰胺酶分类为A~D类酶^[3]。A、C和D类酶通过活性位点丝氨酸起水解底物的作用，丝氨酸作为亲核试剂攻击β⁃内酰胺羰基并使共价键断裂；B类酶是金属β⁃内酰胺酶(Metallo⁃β⁃lactamases, MBLs)，酶活性中心含有一个或两个金属锌离子参与催化^[4]。根据酶催化活性中心含有锌离子的数量，B类酶被进一步分类为B1、B2和B3亚类。β⁃内酰胺抗生素的广泛使用对细菌施加了强大的选择性压力，从而使能表达MBL酶的细菌成为优势菌株。B1亚类MBL酶的特征在于酶活性中心含有两个锌离子，现已成为临床上最相关的MBL^[5]。

2 NDM⁃1的发现及传播

NDM⁃1是一种新型MBL，于2009年首次从一位从印度返回瑞典的尿路感染患者中分离出的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中被发现^[6]。NDM⁃1酶是B1组MBL的新亚类。该酶为临床上重要的β⁃内酰胺类抗生素水解酶，其功能十分强大，具有广泛的水解活性，几乎能水解所有的β⁃内酰胺类抗生素。菌株产生能破坏抗生素的酶是导致菌株耐药的主要原因之一，这也是细菌选择进化的结果。在长期使用β⁃内酰胺类抗生素的选择压力下，耐该类抗生素的细菌被筛选出来并加快繁殖。目前普遍认为，产NDM酶的菌株对曾被视为救命稻草的碳青霉烯类抗生素(β⁃内酰胺类抗生素中的一类，临床使用的主要有亚胺培南、美罗培南、厄他培南、比阿培南等)具有广谱的水解活性。

产NDM酶的临床菌株在亚洲分离率最高，其中大约58.15%的NDM⁃1及突变体分布于中国和印度。欧洲约占16.8%，其中NDM⁃1的突变体在保加利亚、罗马尼亚、波兰、法国、意大利、土耳其、德国、希腊、塞尔维亚、伦敦、乌克兰、克罗地亚、阿塞拜疆和爱尔兰传播较广。NDM⁃1在自然环境中的广泛传播，主要原因在于其编码基因bla_NDM可通过质粒而水平传播^[7]，而且在持续传播中进行频繁地重组，产生更多的突变体。目前临床分离鉴定到的能表达该酶的菌株大都为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等。更加令人担忧的是，目前临床治疗的药物中尚缺乏针对该酶的有效抑制剂。

3 NDM⁃1酶及其突变体

到目前为止，已经报道了21种NDM⁃1的突变体，它们在不同位置的一个或多个氨基酸残基不同，或者多出了一段氨基酸序列^{[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26]}。从这些突变体中，已经在16个位置鉴定到了氨基酸残基的突变；其中NDM⁃18较为特殊，在48与49位之间多出了五个氨基酸残基(QRFGD)的突变，如表1中所列。

由于MBL能催化β⁃内酰胺类抗生素的水解，从而导致菌株的耐药，因此以其作为靶标设计特异性的抑制剂或竞争性底物是一种切实可行的方法，但需要对NDM⁃1及其突变体的结构进行详细地分析^[27]。

4 NDM⁃1酶概述

4.1 NDM⁃1的晶体结构

NDM⁃1可以水解包括碳青霉烯类在内的几乎所有β⁃内酰胺类抗生素，而碳青霉烯类抗生素是目前临床上用作治疗危重症感染最后可选择的重要药物之一。bla_NDM⁃1基因编码269个氨基酸的单体蛋白，与其他B1亚型MBL家族的序列相似性较低。野生型NDM⁃1全长蛋白的分子量约为27500，其N⁃端含有信号肽，信号肽序列的功能在于可使该酶穿梭进入周质空间，从而能有效地作用于β⁃内酰胺抗生素，使抗生素水解失活。在某些情况下，部分NDM⁃1可以二聚体形式存在，环嵌入序列（Thr162⁃Gly167）被认为有助于NDM⁃1的二聚化。

NDM⁃1具有紧密堆积球状结构(50 Å×40 Å×40 Å)，并且具有与其他MBL共同特征的折叠，即αβ/βα的四层三明治型结构，蛋白外侧是c螺旋，两组β折叠被包在内部。β⁃内酰胺酶催化底物的水解机制表明其折叠后的空间结构对β⁃内酰胺类抗生素具有高度的适应性。NDM⁃1分子的左侧亚结构域（N末端）由7个反平行β⁃链和2个α⁃螺旋组成，而右侧部分（C⁃末端）包含剩余的4个反平行β⁃链（β8⁃β11）和两个α⁃螺旋（α3和α4）^[28]。β⁃链通过疏水基团相互作用，且N⁃末端的β⁃链高度扭曲，扭曲角度>100°。β⁃折叠和α⁃螺旋通过柔性loop环连接^[5]。NDM⁃1酶活性中心区域具有疏水性，且带有部分正电荷，包括五个活性氨基酸残基的环状区域（active site loop， ASL）（ASL1~ASL5）。在其底部，β2和β3链之间的环（ASL1， 65~73位残基）和β5链和α2螺旋之间的环（ASL2， 118~124位残基），一起构成活性中心区域（图2）。β8和β9折叠（ASL3， 184~194位残基）、β10和α4（ASL4， 206~228位残基）以及β11和β12折叠（ASL5， 248~255位残基）之间的环区形成酶活性中心外围区域（图2）。NDM⁃1在其酶活性中心需有两个锌离子存在以发挥催化活性^[2]。锌离子位于大约600 Å深的活性中心腔内，ASL2，ASL3，ASL4和ASL5位于与锌离子配位的氨基酸残基所在区域。这些环区中关键的保守残基与金属锌离子相互作用并在酶催化底物水解的过程中起传递电子的作用。在NDM⁃1酶中，环区3（ASL1）和环区10（ASL4）这两个环区能够向远离锌离子所在的酶活性的外侧移动，因此该酶活性中心可以容纳具有不同分子构象的各种底物^[29]。

4.2 NDM⁃1酶活性中心和催化机理

NDM⁃1的活性中心位点含有两个金属锌离子。这两个锌离子分别与不同氨基酸残基作用，其中Zn1离子中心分别在距离2.16 Å、1.99 Å 和2.19 Å 处与三个组氨酸残基His120、His122和His189配位；Zn2离子中心分别在距离2.42 Å、2.52 Å和2.35 Å处与Asp124、Cys208和His250三个氨基酸残基配位（图3）。

Zn1离子与三个氨基酸残基配位，而Zn2离子除了氨基酸残基外还与三个水分子配位，其中一个水分子与Zn1和Zn2离子均存在相互作用，为催化水分子。两个金属锌离子之间共有的水分子很可能以氢氧根离子的形式存在，在两个锌离子之间形成桥梁，并在酶催化底物水解的过程中充当亲核试剂^[30]。该亲核试剂（氢氧化物）的位置在所有β⁃内酰胺类抗生素络合物中是相似的，位于两个金属锌离子的正下方，距离分别为（2.0±0.1） Å和（3.0±0.1） Å^[31]。底物的β⁃内酰胺环中的羰基氧原子朝向Zn1离子，而羧基的氧原子通过与Zn2离子相互作用定位，研究表明活性位点氢氧根离子攻击β⁃内酰胺羰基碳，形成由锌离子稳定的中间体离子^[32]。目前已提出的模型中，NDM⁃1酶结构中的Zn1与Zn2距离小于3.2 Å，因此Zn1⁃Zn2离子在底物与酶形成复合物期间紧密结合在一起，以促进Zn2与β⁃内酰胺环的酰胺基团的相互作用。同时，Zn1⁃Zn2距离在底物结构中的β⁃内酰胺环被水解后增加，从而削弱了这种相互作用，使得水解产物从NDM⁃1酶活性中心释放^[4,31,33]。

Zn1离子配位几何形状、散射行为和空间距离研究表明Zn1存在于该位置符合该离子的特征；然而，对Zn2离子的几何形状、散射行为和距离研究表明其特征更像是镉离子或钴离子而不是锌的特征（在Zn2位置处的金属配体距离类似于在镉离子或钴离子中观察到的特征）。因此有人提出，Zn2离子可以很容易地被其他金属离子如镉或钴取代^[30]。

5 NDM⁃1的突变体

抗生素高频率、大强度地使用所形成的选择性压力促进了NDM⁃1酶的定向进化，导致突变体的出现，全球报道了NDM⁃1的21种突变体。有研究表明，NDM⁃1的突变体中具有可影响酶稳定性和/或催化活性的氨基酸残基的取代。临床菌株在耐药性进化过程中为细菌提供选择性优势，在使用差示扫描荧光测定法和圆二色谱确定NDM⁃1突变体的二级结构时，Makena等^[34]观察到突变位点氨基酸的改变在检测限度内不影响蛋白质的总体折叠。然而，突变体的酶动力学和热稳定性较之于野生型的却存在差异。

表1总结了在NDM中发现的由16个突变位点和1个插入位点所形成21种突变体。NDM⁃2，⁃3，⁃4，⁃6，⁃9，⁃11，⁃14和⁃22通过单碱基突变，产生了单个氨基酸残基改变而与NDM⁃1不同，而其余的突变体则产生了多处氨基酸残基的变化（NDM⁃5,⁃7,⁃8,⁃10,⁃12,⁃13,⁃15,⁃16,⁃17,⁃19,⁃20,⁃21）或多出了一段氨基酸残基(NDM⁃18)。根据表1中总结的突变位点结合已报道的酶活性中心关键位点的氨基酸残基，不难发现已经观察到NDM⁃1变体中的大多数取代在非活性位点区域。仅有NDM⁃10和NDM⁃12两种变体存在活性位点处的关键氨基酸残基被取代。NDM⁃10具有G69D的取代，第69位的天冬氨酸存在于环3上，环3是有助于形成活性中心的环区之一；NDM⁃12在关键环区10内的第222位具有G222D的取代^[16,18]。

NDM⁃10是突变位点最多的突变体，有五个氨基酸残基位点被取代。大多数突变为疏水残基被取代为极性或带电残基（G36D，G69S，A74T和G200R）。虽然G69D存在于环内，但NDM⁃10的A74T紧邻环3（Met65⁃Val73）存在。对于能表达NDM⁃10的菌株，几乎所有β⁃内酰胺类抗生素抑菌的MIC值均显著高于能表达NDM⁃1的菌株^[16]。NDM⁃12（M154L和G222D）酶对于几乎所有的β⁃内酰胺类抗生素的k_cat/K_m值均低于或类似于NDM⁃1^[35]。Liu等^[23]研究发现活性位点G222D的取代可能导致灭活性降低，而M154L的取代则增加了水解活性。这些NDM⁃1环区中突变的综合作用可影响底物的定位或催化，导致突变体催化底物水解活性的变化^[18]。

其余的突变位点存在于活性位点凹槽附近或远离活性位点凹槽。然而，这些取代对酶的催化活性的影响，可能是因为氨基酸残基的变化使活性中心区域的空间构象变化，从而导致酶的催化活性随之发生改变^[36]。

对已发现的这些突变位点在NDM⁃1晶体结构中的分布进行分析，可以看出超过一半的突变位点位于NDM⁃1结构的环区内，其次是α⁃螺旋，β⁃折叠中最少。而催化活性增加的突变体所发生突变的位点大多集中在环区。NDM⁃10环区中五个氨基酸残基有四个发生突变，这使得其显著增加了水解碳青霉烯类抗生素的活性。因此，环区最容易发生突变的原因可能在于这种突变能够赋予该酶更强的水解底物的活性，从而增强抗药性，并为细菌提供进化上的优势。

M154L是NDM突变体中突变频率最高的位点，存在于连接α3和β8的环区中^[33,37]。从表1中可以看出，NDM⁃4为单个M154L取代的突变体；NDM⁃5为88位和154为双取代的突变体（V88L和M154L）；NDM⁃16为三个位点被取代的突变体（V88L，M154L和A233V）。M154L取代是NDM⁃4酶增加其水解碳青霉烯类抗生素能力的重要原因。NDM⁃5与NDM⁃4具有共同的M154L突变位点，并同时具有V88L突变位点。NDM⁃5酶水解底物亚胺培南和美罗培南的k_cat/K_m值低于NDM⁃4，表明V88L突变可能导致催化活性降低^[10,11]。

2017年报道的NDM⁃17具有三个氨基酸突变（V88L、M154L和E170K）。与NDM⁃1相比，碳青霉烯类抗生素抑制表达NDM⁃17菌株的MIC值更高。NDM⁃17与NDM⁃5（V88L和M154L）具有两个共同的突变位点，而NDM⁃17具有一个新的E170K取代。实验研究表明：较之于NDM⁃5，NDM⁃17对所有β⁃内酰胺类抗生素具有更高的亲和力。因此，增加的催化活性可归因于170位的Glu被Lys取代^[23]。

有研究表明，与NDM⁃1相比，NDM⁃7（D130N和M154L）具有更强的水解碳青霉烯类抗生素的活性。然而，NDM⁃8（D130G和M154L）在第130位为Gly而不是在NDM⁃7中的Asn，且NDM⁃7具有与NDM⁃1相似的对碳青霉烯类的催化活性^[13,14]。这表明用不同的氨基酸残基取代，由于氨基酸的性质或结构不同，从而对酶的催化活性产生不同的影响。已经发现到不同的突变组合对NDM⁃1的水解活性具有不同的影响。在具有单个取代的突变体中，该单个位点的突变与酶催化活性的增加或降低密切相关。然而，在具有多个取代的变体中，难以准确地判断出每个突变位点对酶活性影响的综合效应。通过对具有相同的一个或多个氨基酸突变位点的突变体之间差异突变体的酶促反应动力学参数的比较研究能够促进对非共有突变位点所产生影响的进一步了解。

此外，酶与不同抗生素的相互作用涉及不同的残基。例如，美罗培南作为底物时与酶活性中心的His189、Lys211、Gly219和Asn220残基相互作用，而硝基呋喃作为底物时则与酶活性中心的Lys211、Lys216、Gly219和Asn220残基相互作用。因此，各突变体的水解活性也会因为以不同抗生素作为底物而异^[38]。酶水解活性的变化不是单个位点突变效应所累积的总和，而是突变位点彼此相互作用以及它们共同影响酶活性中心的空间结构的结果^[39]。

6 小结与展望

菌株对抗生素耐药从而产生的迅速传播是一个重要的公共卫生问题，促使科研工作者开发遏制抗生素耐药的新方法。NDM⁃1酶及其突变体由于具有广谱的水解β⁃内酰胺类抗生素的活性而能够使大量的抗菌药物失活而成为关注的焦点，因此设计新型抗生素和/或该酶的抑制剂是解决上述问题的可行的方法。对NDM⁃1晶体结构的解析为研究NDM⁃1的广泛底物特异性提供了线索，并为设计新型抗生素或酶抑制剂提供了分子基础。最近的研究集中于各种NDM⁃1突变体的结构表征，以确定突变的氨基酸残基在酶的结构和/或催化活性中的贡献。然而，需要更加深入的生物化学和生物物理学研究才能完全理解这些氨基酸残基在结构、功能和NDM酶的进化中的重要性以及所起的作用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31700086)