甘草抗动脉粥样硬化机制的网络药理学研究

Exploration of the anti⁃atherosclerosis mechanism of Glycyrrhizae radix by network pharmacology

摘要

利用网络药理学方法探讨甘草在抗动脉粥样硬化中的分子机制。本研究利用中医药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP）分析甘草中的有效活性成分，并获得有效成分的作用靶点。通过Cytoscape软件构建可视化靶点互相作用网络，对网络中的关键靶点进行基因本体（GO）富集分析和KEGG通路富集分析。结果显示甘草中40种有效活性成分的预测靶点共97个，47个靶点与动脉粥样硬化（AS）相关，其中18个是血管保护药物和脂质修饰药物的作用靶点，表明甘草可作为调控AS发展的药物。基于97个预测靶点的GO富集分析，发现甘草可参与多种生物学过程，尤其是应对外源性刺激，以及参与细胞凋亡等过程。通过构建甘草靶点与AS疾病靶点相互作用网络（PPI），确定了AKT1、MAPK3、MAPK1、JUN和CASP3等关键靶点，并对关键靶点进行KEGG富集分析，结果表明甘草主要影响调控细胞增殖、生存以及凋亡的细胞信号转导相关通路，并激活先天免疫相关信号通路，调节炎性细胞因子释放，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。甘草具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，主要通过PI3K⁃AKT信号途径、MAPK信号途径、NOD样受体信号通路调控细胞增殖和凋亡，同时发挥免疫调控作用，从而影响动脉粥样硬化的发展，由此可见，甘草可作为动脉粥样硬化疾病治疗的候选中草药。

Abstract

To explore the mechanism of Glycyrrhizae radix in anti⁃atherosclerosis based on network pharmacology. The traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform (TCMSP) were used to analyze the effective and active compositions in Glycyrrhizae radix and to obtain the targets of the effective and active compositions. Cytoscape is used to build a heterogeneous network of targets. Gene ontology (GO) enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of the key targets in the network were performed by WebGestalt database. A total of 97 predicted targets of 40 effective active compositions in Glycyrrhizae radix were analyzed, and 47 targets were related to AS. Among them, 18 were targets for vasoprotective drugs and lipid⁃modifying drugs, indicating that Glycyrrhizae radix may regulate atherosclerosis development. Based on GO enrichment analysis of 97 predicted targets, we found that Glycyrrhizae radix participated in a variety of biological processes, especially in response to exogenous stimuli and in the process of apoptosis. Then, by analyzing the protein⁃protein interaction network (PPI) of Glycyrrhizae radix targets and atherosclerosis⁃related proteins, we identified the hubs, such as AKT1, MAPK3, MAPK1, JUN, CASP3 and so on. KEGG enrichment analysis of the key targets showed that Glycyrrhizae radix plays an anti⁃atherosclerotic role mainly by affecting the signal transduction pathways which regulate cell proliferation, survival and apoptosis, and activate the innate immune responses to regulate inflammation cytokines releasement. Those results show that Glycyrrhizae radix has characteristics of multi⁃components, multi⁃targets and multi⁃pathways. It mainly regulates cell proliferation and apoptosis through PI3K⁃AKT signal pathway and MAPK signal pathway. Meanwhile, it also regulates innate immune responses by NOD⁃like receptor signal pathway. Therefore, Glycyrrhizae radix could affect the development of atherosclerosis and can be used as a candidate Chinese herbal medicine for the treatment of atherosclerosis.

Graphical abstract

关键词

网络药理学 / 甘草 / 动脉粥样硬化 / 靶点 / 分子机制 / 信号通路

Key words

network pharmacology / Glycyrrhizae radix / atherosclerosis / target / molecular mechanism / signal pathway

0 引 言

动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是一种多因素导致的慢性血管疾病，可导致严重的心肌梗塞、中风和其他心血管疾病（cardiovascular diseases, CVD）。目前研究表明氧化应激、炎症反应、脂质代谢异常以及血管细胞凋亡等都可以影响AS的发生发展。氧化应激会破坏一氧化氮（NO）和活性氧之间的平衡，从而导致内皮功能障碍，这是AS的第一步，同时也会强烈影响炎症过程^[1,2]。内皮细胞凋亡可造成血管内膜损伤和局部血栓形成，加速动脉粥样硬化进程。血管平滑肌细胞凋亡，会破坏纤维帽结构，导致易损斑块的形成。巨噬细胞凋亡在斑块的不同阶段作用不同，早期巨噬细胞凋亡可清除受损的细胞，阻碍斑块的形成，但在进展期，凋亡可引起周围细胞继发性坏死，导致易损斑块的形成^[3,4]。高脂血症是AS的危险存在，降脂疗法的成功为脂质紊乱学说提供了最直接的证据^[5]。炎症反应与脂质异常的联合作用是形成动脉粥样硬化的关键因素。AS的机制涉及了多个基因功能障碍，导致调节网络失衡，单一靶点药物的治疗效果并不理想。同样，在临床上通过使用单一的某种抗氧化剂药物（维生素C、维生素E等），对预防AS也没有显著作用。

中医认为AS的发病原因在于本虚标实，本虚包括气虚、阳虚、阴虚等；标实包括血瘀、痰浊、气滞、寒凝等；在治疗上也以活血化瘀、健脾益气等方面入手。近年来临床研究发现使用具有补肾、益气、化积等功效的复方药剂对于防治AS效果较好^[6]，其药方中多含有甘草。

甘草（Glycyrrhizae radix）是多年生草本植物，隶属于豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionoideae）。甘草具有补脾益气，清热解毒，祛痰化湿，缓解止痛，调和诸药的功效。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，腹痛、四肢挛急疼痛，缓解药物毒性、烈性。有早期研究显示，甘草具有抗病毒，抗炎，调节免疫功能的作用^[7]。甘草中活性成分包括黄酮类化合物（如异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草查耳酮A、光甘草定、甘草醇等）、甘草多糖和甘草酸等。已有相关研究阐明，甘草单一活性成分的作用机制。甘草酸可通过降低甘油总胆固醇、三酰甘油等来调节血脂，还可提高肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶，通过降低肝脏中过氧化脂质的产生来减缓因氧化应激导致的氧化损伤^[8]；异甘草酸是甘草酸的水解产物，对生物体内羟自由基、二苯基苦酰肼基自由基、超氧阴离子具有清除作用，并对脂质过氧化具有抑制作用^[9]。甘草多糖是促进网状内皮系统吞噬功能和抗补体的活性成分，用甘草多糖处理过的小鼠巨噬细胞产生超氧阴离子的能力以及对佛波醇酯刺激后产生超氧阴离子能力都高于对照组小鼠^[10]。甘草作为中草药，其活性成分多，整体入药，涉及更多的调控机制，能更有效地调控AS的发生，但其机制复杂。因此，本研究利用网络药理学方法发掘甘草抗动脉粥样硬化作用的靶点和通路，进而从分子生物学角度科学分析甘草发挥抗动脉粥样硬化的分子作用机制。

1 材料和方法

1.1 数据的获取

甘草化学活性成分从中医药系统药理学数据库分析平台（TCMSP， http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）获取，药物动力学（absorption, distribution, metabolism and elimination， ADME）筛选标准为：口服生物学吸收性（oral bioavailability, OB）≥50%，类药性（drug⁃like, DL）≥0.14，Caco⁃2渗透性≥-0.4。综合TCMSP数据库和ECTM数据库获取甘草活性化学成分的作用靶点。以疾病名称为“动脉粥样硬化（C0004153）”从DisGeNET数据库中收集与AS相关的基因。心血管疾病相关药物靶点来自DrugBank数据库（http://www.drugbank.ca/），ATC代码分别为“C05”血管保护剂和“C10”脂质修饰剂。

1.2 甘草活性成分作用靶点的网络分析

利用Cytoscape 3.7.2软件构建甘草活性成分⁃活性成分预测靶点的可视化网络。韦恩分析甘草活性成分预测靶点、AS疾病靶点、药物靶点的交集。Cytoscape中的BiNGO工具对交集基因进行可视化GO富集分析。

1.3 甘草作用预测靶点与AS疾病靶点相互作用网络分析

利用String网站建立蛋白质相互作用网络（PPI），利用Cytoscape分析获取蛋白相互作用网络信息，以“节点连接度（degree）大于等于4倍中位数”，“紧密度（closeness）和介度（betweenness）均大于等于其中位数”为筛选条件^[11]，选取甘草靶点⁃疾病蛋白互作网络的节点（hubs），利用WebGestalt数据库对节点进行GO富集及KEGG通路分析，并构建节点⁃通路网络图，分析甘草参与调节的AS的关键通路。

2 结 果

2.1 甘草作用靶点的网络构建与生物学分析

利用ADME筛选条件从TCMSP数据库中获得甘草的40个有效活性化合物（表1）。甘草的主要活性成分有柚皮素（naringenin）、刺芒柄花素（formononetin）、粗毛甘草素B（Glyasperins M）、1⁃甲氧基菜豆素（1⁃Methoxyphaseollidin）、葡糖苷（Licoagrocarpin）、粗毛甘草素B（glyasperin B）、甘草宁A（Gancaonin A）以及黄羽扇豆魏特酮（Lupiwighteone）等。

同时获取40个活性成分的预测靶点共97个，利用Cytoscape 3.7.2软件构建甘草活性成分⁃预测靶点网络图（图1）。网络中处于中心的靶点受多个化合物影响，表明这些靶点为甘草发挥作用的关键靶点，包括一氧化氮合酶3（NOS3）、雌激素受体1（ESR1）、凝血因子X（F10）、Pim⁃1原癌基因（PIM1）、瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员1（TRP1）、雄激素受体（AR）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、细胞周期蛋白A2（CCNA2）、雌激素受体2（ESR2）以及钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（CAMKK2）等（表2）。从网络图中可以发现每个活性成分作用于多个靶点，关键靶点也与多个活性成分相关联，说明甘草在发挥药效时涉及到多种成分协同作用。

将甘草活性成分的预测靶点、AS疾病靶点和药物靶点三者进行韦恩分析。如图2A所示，三个数据交集共有18个基因，在甘草的预测靶点中有47个靶点与AS相关，有18个靶点与血管保护剂和脂质修饰剂药物靶点相同（ADRB2、ESR1、PTGS1、PTGS2、AR、DPP4、PPARG、PPARD、SELE、VCAM1、HMGCR、BCL2、CASP3、CES1、MTTP、MAPK1、SOAT1、SOD1），提示甘草参与AS的发生发展，并可作为抗动脉粥样硬化的潜在药物。GO富集分析可以展示基因的生物学功能，为了进一步了解甘草的生物学活性，我们利用Cytoscape中的BiNGO对47个与AS相关的交集靶点进行GO富集分析，并选取P值排在前18位的生物学过程进行可视化分析（图2B），发现这些交集靶点主要参与了细胞对内源性或外源性的刺激反应，通过影响细胞增殖迁移和凋亡过程参与调控AS的发生发展。

2.2 甘草预测靶点与AS疾病靶点相互作用网络构建与分析

将甘草预测靶点与AS疾病靶点输入string网站获得蛋白质相互作用网络图（PPI），获得1 112个节点和34 335个边。利用Cytoscape分析PPI网络，获取拓扑特征分析数据，根据“节点连接度≥160（中位数的四倍）”，“中心接近度≥0.448 7（中位值）”和“介度≥0.000 285（中位值）”三个主要参数选择中心靶点89个，为甘草调控动脉粥样硬化发生发展的关键靶点^[12]。其中22个为甘草预测靶点（钻石形节点），67个为AS疾病靶点(圆形节点)，见图3。节点的大小与节点连接度呈正相关，度值越大，节点越大。节点连接度表示该靶点在PPI网络中的位置，度值越高表示该靶点在网络中的作用越关键。从图中所示，网络中排名前九的靶点有INS、IL6、AKT1、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、MAPK3，其中AKT1和MAPK3是甘草预测靶点。除此之外，甘草预测靶点中AKT1、MAPK3、MAPK1、JUN、CASP3等也处于中心位置。这表明在调控AS发展中，这几个甘草预测靶点是其发挥作用的关键靶点。

2.3 关键靶点的基因功能和信号通路分析

利用WebGestalt网站对筛选到的89个关键靶点进行GO富集分析及KEGG分析。GO富集分析包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellularcomponent，CC）和分子功能（molecular function，MF）三个分支。如图4所示，这些靶点主要涉及生物调节（biological regulation）、多细胞生物过程（multicellular organismal process）、对刺激的反应（response to stimulus）、代谢过程（metabolic process）、细胞增殖（cell proliferation）等生物过程；组成细胞外空间（extracellular space）、内膜系统（endomembrane system）、囊泡（vesicle）、膜（membrane）等细胞成分；发挥蛋白质结合（protein binding）、离子结合（ion binding）、酶调节活性（enzyme regulator activity）、核酸结合（nucleic acid binding）、脂质结合（lipid binding）等分子功能。结果表明，甘草可能通过这些生物学过程影响了动脉粥样硬化过程的发生。

图5展示了关键靶点KEGG富集分析，排名靠前的信号通路，主要涉及细胞信号转导相关信号通路（PI3K⁃AKT pathway, MAPK pathway, Rap1 signaling pathway, TNF signaling pathway）、免疫系统相关信号通路（NOD⁃like receptor signaling pathway, Th17 cell differentiation, Toll⁃like receptor signaling pathway, C⁃type lectin receptor signaling pathway）、心血管疾病相关信号通路（fluid shear stress and atherosclerosis）、癌症相关信号通路（pathways in cancer, proteoglycans in cancer）、感染相关信号通路（human cytomegalovirus infection, kaposi sarcoma⁃associated herpesvirus infection, tuberculosis, influenza A, measles, toxoplasmosis, hepatitis B）、内分泌系统相关信号通路（relaxin signaling pathway）、组织器官发展分化相关信号通路（osteoclast differentiation）。其中PI3K⁃AKT信号通路、MAPK信号通路和NOD样受体信号通路处于中心位置，结果提示甘草主要通过细胞信号传导途径及调节免疫信号通路发挥抗动脉粥样硬化作用。

3 讨论与结论

3.1 甘草可作为脂质修饰剂或血管保护剂治疗AS

AS是一种复杂的心血管疾病。内皮功能障碍与AS的发病机制密切相关，内皮受损可促进白细胞黏附迁移、脂质沉积、平滑肌细胞增殖、粥样斑块脆性增加与破裂，导致血栓形成，是诱发多种心血管疾病的共同病理生理基础，导致AS形成的始动环节。因此，对内皮功能紊乱进行干预治疗，已成为防治AS的重要环节。通过韦恩分析，本研究发现了18个靶点是甘草预测靶点、AS疾病靶点和药物靶点的交集，表明了甘草对AS的干预作用，以及将甘草作为临床用药的潜力。这些交集靶点同时也是血管保护剂和脂质修饰剂的作用靶点。不同的AS药物可分别作用于不同的AS靶点，与甘草的活性成分靶点多方面重合。例如ADRB2过甲基化将会激活PI3K⁃AKT途径，导致心肌细胞凋亡和心脏功能障碍, 而酚苄明可抑制ADRB2过甲基化，该药物用于治疗周围血管疾病^[13]。抑制PTGS2可激活MAPK途径，从而减少炎症反应，心肌损伤，纤维化区域和降低心肌细胞凋亡，而阿司匹林可抑制PTGS2表达，临床上用于预防短暂脑缺血发作、心肌梗死 ^[14]。PPARG是过氧化物酶体增殖物激活受体γ，苯扎贝特可提高PPARG表达水平，通过激活AKT⁃MTOR信号通路以及诱导细胞自噬来维持细胞活力^[15]。VACM⁃1是Cullin蛋白质家族的成员，VACM⁃1/CUL5抑制细胞生长，而卡维地洛可提高VCAM1表达，防止平滑肌细胞的异常增殖而引起血管腔狭窄和痉挛，有较强的心脏和神经保护作用 ^[16]。瑞舒伐他汀和阿伐他汀可提高HMG⁃CoA还原酶（HMGCR）的表达，伴随着肝脏胆固醇合成速率的增加，通过调节AKT/SREBP⁃2/HMGCR途径促进了肝胆固醇的生物合成^[17]。洛美他派是一种强效的微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)抑制剂，可用于家族性高胆固醇血症的治疗。MAPK1/MAPK3（丝裂原活化蛋白激酶1/3）激活可改善lepr缺陷小鼠（肝脏脂肪变性的经典动物模型）中的肝脏脂肪变性，异丙肾上腺素可激活MAPK1，该药物可使心血管收缩压升高、舒张压降低，脉压变大^[18]。这些都提示甘草可以作为脂质修饰剂或血管保护剂用来治疗AS。

3.2 甘草可通过PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路影响AS过程

活性成分与预测靶点网络显示了甘草AS多靶点的特点，构成复杂网络，多效发挥作用。为分析甘草发挥药物活性的具体分子生物学机制，通过信号通路相互作用网络的系统生物学分析，我们确定了五个中心靶点：AKT1、MAPK3、MAPK1、JUN和CASP3。同时这五个靶点也是多条信号通路上的中心分子。AKT1是PI3K⁃AKT信号传导途径的中心，AKT1能通过PDK2对Thr473位的磷酸化而被激活，活化的AKT1通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF⁃κB、GSK⁃3、FKHR、p21Cip1和p27 Kip1等,进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移^[19]。Luo等^[20]发现异鼠李素（Isorhamnetin）可激活PI3K⁃AKT途径，增加HO⁃1的产生，并减弱ox⁃LDL处理的巨噬细胞中的ROS水平和因巨噬细胞凋亡导致的脂质沉积。这说明甘草可以通过激活PI3K⁃AKT通路影响细胞凋亡从而缓解AS进程。JUN是核转录激活蛋白1（AP⁃1）家族的组成成员，通过调节靶基因转录参与增殖、分化和细胞凋亡等多种生理过程。Caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。其中caspase3是凋亡的关键蛋白酶，一旦被激活，即发生下游的级联反应，使凋亡不可避免^[21]。在我们的PPI网络中，caspase3作为甘草活性成分的作用靶点，推测甘草可通过调节内皮细胞、巨噬细胞等细胞凋亡调控AS的发展。MAPK激酶又称细胞外信号调节激酶（ERK），是多种生化信号的整合点，参与多种细胞过程。ERK1和p38 MAPK通路的下游激酶MNKl能磷酸化ARE结合蛋白，增强巨噬细胞和T细胞中促炎细胞因子(TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6、MCP⁃1)的生物合成。Gong等^[22]发现牛痘素通过抑制ROS/p38 MAPK信号通路抑制ox⁃LDL诱导的内皮细胞炎症和细胞凋亡，抑制MAPK信号通路的蛋白表达，可预防和缓解AS的发生和发展。甘草调控AS的关键靶点主要涉及PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路，而这些信号通路与细胞活化和蛋白质合成的调节密切相关，主要参与细胞的增殖和凋亡。甘草的活性成分可通过调控网络发挥多重调控水平，调节内皮细胞功能紊乱、平滑肌细胞的增殖失衡与迁移异常、巨噬细胞凋亡、血管结构的改变及粥样斑块的不稳定性，缓解AS进展。所以甘草可通过PI3K/AKT信号通路和MAPK信号通路的调节直接影响AS的病理过程。

3.3 甘草可通过NOD样受体信号通路影响AS的病理过程

在本研究中，结合网络药理学分析，我们还发现甘草可能通过炎症性免疫应答信号传导途径影响AS。炎症反应贯穿于动脉粥样硬化发生和发展的整个过程，核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体是一类位于细胞质的模式识别受体，在先天性免疫应答中起着十分重要的作用。NOD1和NOD2是NLR家族中最典型的成员，是NOD样受体信号通路中心分子。作为致炎物质的配体首先激活相应受体，NOD1和NOD2受体被激活后，刺激激酶RIP2的活化，活化的RIP2一方面募集下游的转化生长因子β激活激酶1（TAK1）、TAK1结合蛋白1（TAB1）、TAB2/3复合体并使其活化；另一方面募集下游的NF⁃κB必需调节蛋白（NEMO）/IKKα/IKKβ复合体，TAK1、TAB1、TAB2/3复合体将会活化IKKα/IKKβ，从而激活NF⁃κB的转录，促进促炎因子的释放。NOD1和NOD2的活化会促进IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃18、ICAM1等促炎因子的产生。同时，NF⁃κB的活化又可上调NOD2的表达。已有研究显示TLR4可依赖MAPK/NF⁃κB途径导致TNF⁃α、IL⁃1和IL⁃6等炎症因子的活化。NOD1或NOD2与TLR4协同作用，可加剧机体免疫刺激的反应^[23]。甘草的活性成分可抑制MAPK1/3的表达，阻断NOD样受体信号通路，进而抑制IL⁃1β、IL⁃2、IL⁃6、TNF⁃α等致炎分子同时促进IL⁃4、IL⁃10等抑炎分子的表达^[24]，缓解因炎性反应所致AS的发展。甘草可通过NOD样受体信号通路影响AS的病理过程。

综上所述，本研究通过数据库初步确定甘草活性成分的作用靶点，对甘草抗AS作用网络中的关键靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，显示了甘草抗AS的多靶点以及涉及多种过程、分子和通路的特点。甘草主要通过PI3K⁃AKT、MAPK信号途径、NOD样受体信号通路调控细胞增殖和凋亡，同时发挥免疫调控作用，从而影响AS的发展。甘草可作为AS疾病治疗的候选中草药。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81670412)