红颜草莓叶盘再生及遗传转化体系的优化

Optimization of leaf disc regeneration and genetic transformation system in Benihope strawberry

摘要

草莓离体组织再生和遗传转化体系的研究对草莓分子育种至关重要。为了优化农杆菌介导草莓品种红颜( Fragaria×ananassa Duch．Benihoppe)的遗传转化体系，本研究以红颜草莓组培苗的离体叶盘作为试验材料，首先确定了其离体再生的最佳条件，对影响转化效率的因素进行优化，获得了稳定高效的再生及转化体系。结果表明，红颜草莓离体叶盘最佳暗培养时间为9 d，最佳愈伤诱导培养基为MS+TDZ（2.0 mg/L）+IBA（0.1 mg/L）+2，4⁃D（0.1 mg/L），最佳愈伤分化培养基为MS+6⁃BA（0.5 mg/L）+NAA（0.1 mg/L），转化体系的最佳组合为预培养2 d、添加300 μmol/L的AS、以OD_600nm=0.6的EHA105型的农杆菌浸染5 min、共培养5 d。经优化后的红颜草莓叶盘再生及遗传转化体系对该品种的进一步优化和选育有重要意义。

Abstract

The study of strawberry in vitro tissue regeneration and genetic transformation system is essential for strawberry variety improvement. In order to optimize the agrobacterium⁃mediated genetic transformation system of strawberry cultivar Benihope (Fragaria×ananassa Duch. Benihoppe), this research used the leaves as the experimental material. The optimal conditions for the leaf disc regeneration in vitro were determined, and then optimized the factors affecting the transformation efficiency, and obtained a stable and efficient transgene system. The results showed that the optimal dark culture time was 9 days for the leaves of strawberry cultivar Benihope, the best callus induction medium was MS+TDZ (2.0 mg/L)+IBA (0.1 mg/L)+2,4⁃D (0.1 mg/L). The best callus differentiation medium was MS+6⁃BA (0.5 mg/L)+NAA(0.1 mg/L). The optimal combination of the transformation system was pre⁃culture for 2 days, addition of 300 μmol/L of AS, agrobacterium from EHA105 with OD_600nm=0.6 for 5 min, and co⁃culture for 5 days. The optimized leaf disc regeneration and genetic transformation system in “Benihope” strawberry is of great significance for further optimization and breeding of this variety.

Graphical abstract

关键词

草莓 / 农杆菌 / 叶盘再生 / 遗传转化

Key words

strawberry / agrobacterium / leaf disc regeneration / genetic transformation

0 引 言

草莓(Fragaria×ananassa Duch．Benihoppe)是重要的经济作物，具有较高的营养价值，且口味极佳，深受广大消费者的喜爱，其种植面积也在逐年增加。以日本“章姬”和“幸香”杂交选育出来的品种红颜是我国主要的草莓栽培品种之一^[1]，该品种具有优质早熟的特点，且产量较高，味道也比一般的草莓更加鲜美，因此得到大面积推广，目前红颜草莓已经占据了我国草莓栽培品种的大部分市场。但该品种也存在抗寒性较差、货架期较短的问题，因此需要有针对性地选育出更加优良的品种。

草莓具有高度的杂合性和多倍性，野生的草莓通常为二倍体，选育出的新品种中有四倍体、五倍体、八倍体等^[2]。多年来，科研人员都是通过传统杂交育种方法对草莓进行品种改良和选育，虽然已经获得了一些成果^[3,4,5]，但由于草莓遗传背景的复杂性，使得利用传统杂交育种的方法对其进行选育存在很多弊端，通过种与种的杂交或者种内的选育都难以获得可以稳定遗传的优良品种；不仅如此，还存在着实验周期长、工作量大等弊端。伴随着分子生物学和细胞工程等学科的快速发展，基因工程在作物品种选育中的运用也越来越广泛，利用现代生物技术进行草莓的品种改良和种质创新，对草莓发展具有重要意义。然而，任何一个目的基因的导入都必须以能稳定遗传为前提，因此，稳定又高效的草莓再生及遗传转化体系的建立是对草莓进行基因工程育种的前提。

目前，国内外对草莓组织离体再生体系、遗传转化体系的研究已经取得了一些进展^[6,7,8,9]。最早是1990年由Nehra等^[10]选取愈伤组织和叶盘为外植体，首次对草莓进行遗传转化的研究，经过对转化植株的检测，结果显示其获得的转化植株中确实含有相应的外源基因，并且他们的结果也证明了叶盘的转化率高于愈伤组织的转化率，从而为叶盘转化法的广泛使用奠定了基础。2001年，我国的张志宏等^[11]以草莓品种“弗吉尼亚”的幼叶为材料进行了转化和再生的研究，也成功获得了转化植株，从此打开了我国利用现代生物技术对草莓进行品种选育的大门。随着相关研究的不断深入，通过建立稳定高效的再生及遗传转化体系来进行基因功能研究及性状改良的研究成果越来越多，但普遍存在转化率低的问题^[12]。不仅不同基因型的草莓转化效率差异很大，选取不同的转化受体，转化率也大不相同。草莓的叶片和叶柄最容易再生出完整植株，较花粉和原生质体的转化率要高很多，但叶片和叶柄的转化体可能是嵌合体，不能稳定遗传^[13]。因此，如何建立高效、稳定的转化系统是值得研究的重要课题。根据已有的研究成果，草莓组织离体再生系统一般选择以叶盘为培养材料，但叶盘的离体再生体系影响因素众多，且品种间差异较大。

本文在相关报道研究的基础上，以“红颜”草莓品种为材料，筛选了其再生体系中的诸多条件，如暗培养时间、激素种类及浓度等，建立了高效率的叶盘再生体系，并优化了草莓中农杆菌介导的遗传转化体系，得到了稳定高效的转化方法。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 草莓品种

再生体系及稳定转化体系的建立实验均选取红颜无菌试管苗为试材。

1.1.2 供试菌株类型

本实验采用的农杆菌菌株为LBA4404、EHA105、GV3101三种类型，均携带质粒pU1301，该质粒中同时含有GUS报告基因及潮霉素抗性基因。

1.1.3 主要培养基

草莓无菌苗继代培养基MS+6⁃BA(0.7 mg/L)+NAA(0.1 mg/L)；农杆菌重悬浮培养基：MS+AS(200 mg/L)；叶盘再生及转化培养基均以MS为基本培养基附加不同种类及浓度的激素，详细配方见表1。所有培养基中均附加琼脂7 g/L、蔗糖30 g/L，pH 5.8，培养条件为光⁃暗周期16 h⁃8 h（特殊暗处理除外），光照强度2 000~3 000 lx，温度23~25 ℃。

1.2 实验方法

1.2.1 叶盘再生体系的建立与优化

①愈伤诱导条件的筛选。在无菌操作台上，选取叶龄在25天左右，长势基本一致的无菌组培苗幼叶，剪切成0.5 mm×0.5 mm大小的块状，以背面接触培养基，置于5种不同激素配比的愈伤诱导培养基上，分别为S₁、S₂、S₃、S₄、S₅型培养基,如表1所示。设置暗培养6、9、12、15天四种处理，共20组实验，每组10个皿，待暗培养结束后转入正常光照条件下，统一于接种35天后统计出愈率，设置3次重复实验。

出愈率（%）=（产生愈伤叶片数/接种叶片总数）×100%

②分化培养基的筛选。选取大量幼嫩叶盘置于愈伤诱导培养基中培养40 d左右得到愈伤组织，挑选其中长势基本一致的愈伤，接种于3种不同激素配比的分化培养基上，分别为R₁、R₂、R₃型培养基，如表1所示。每种培养基接种10个皿，每个皿接种10块愈伤组织，统一于接种30 d后统计愈伤组织的出芽率，设置3次重复实验。

出芽率（%）=（出芽愈伤个数/接种愈伤总个数）×100%

1.2.2 农杆菌介导的叶盘转化体系的建立与优化

①菌液的制备。将目的质粒pU1301分别转入农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404中，通过菌落PCR检测验证后，挑取菌液划线，28 ℃培养两天后挑取单菌落于含有利福平和卡那霉素的液体LB培养基中培养，待菌液OD_600nm达到实验设计的浓度时，6 000 r/min离心5 min，将菌体重悬于含有相应浓度AS的液体MS培养基中重悬浮备用。

②草莓叶片对抗生素敏感性实验。分别在含0、2、3、4、5 mg/L潮霉素（Hyg）的再生培养基上，接种叶龄及长势一致的幼嫩叶片进行离体培养，统一于接种20 d后观察叶片存活情况，确定红颜草莓叶盘合适的抗生素筛选压。

③农杆菌介导转化体系影响因子的正交实验。对于转化体系的重要影响因子预培养时间、菌株类型、菌液浓度、AS浓度、浸染时间、共培养时间设计L18（3⁷）的正交实验，具体各因素水平如表2所示。

选取叶龄在25 d左右，长势基本一致的无菌组培苗幼叶，剪切成0.5 mm×0.5 mm大小的块状，置于愈伤诱导培养基上，进行预培养；浸染时，在无菌操作台上将叶片从预培养培基上取出，根据实验编号将取出的叶片置于不同条件下的菌液中浸泡，并上下颠倒使叶片充分接触菌液；浸染结束后用吸水纸吸干叶片表面菌液，转至愈伤诱导培养基上共培养，经过不同时间的共培养后进行除菌培养，除菌培养基是在愈伤诱导培养基的配方基础上添加了350 mg/L羧苄青霉素（Cb）；除菌结束后进行筛选培养，筛选培养基在愈伤诱导培养基配方基础上添加相应的抗生素即可；筛选培养结束后，待长出愈伤组织时转至分化培养基上进行分化培养，最终得到转化植株。正交实验每组处理10个皿，每个皿上接种10片叶片，经3次重复。

④转化子检测。切取每组中经两轮筛选培养后的植物组织进行GUS染色，观察并统计染色率。剩余部分继续进行愈伤诱导及分化培养，待其长成完整植株后切取叶片抽提其基因组DNA，并以此为模板进行PCR检测。

2 结果与分析

2.1 不同激素组合及暗培养天数对愈伤诱导的影响

将叶片剪切并接种于含不同生长素与分裂素浓度配比的愈伤诱导培养基上，约7 d左右叶片开始膨大卷曲，25 d左右叶片周边开始出现颗粒状愈伤，35 d左右块状愈伤基本形成，过程如图1所示。

不同激素诱导下的出愈率结果记录如表3所示，经数据分析得到图2所示的结果。由图2可知，对比暗培养天数，6 d与9 d、12 d相比对出愈率的影响差异显著，而暗培养15天的出愈率分别与另三组比较差异不显著，且9 d与12 d比较也无明显差异，但由三组数据平均值可以看出暗培养9 d的出愈率略高于12 d，因此视暗培养9 d为最佳。对比培养基种类，除S₂型和S₃型培养基相比对出愈率的影响无明显差异外，其他类型两两相比对出愈率的影响都有显著甚至极显著差异，其中以S₅型培养基出愈率最高，因此在本实验中诱导愈伤生成的最佳激素及配比为MS+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA。

2.2 不同激素组合对愈伤分化的影响

将叶片诱导40 d左右的块状愈伤转接于不同激素组合的3种分化培养基上，15 d左右出现明显分化芽，分化过程如图1所示，不同激素组合的分化情况差异明显。其中，R₁型培养基中愈伤出芽率高达92.3%，R₂型63.1%，R₃型75.2%。R₁型培养基较R₃型培养基对出芽率的影响有显著差异，较R₂型培养基有极显著差异，因此本实验中以R₁型分化培养基最佳，其配方为MS+0.5 mg/L 6⁃BA+0.1 mg/L NAA。

2.3 草莓叶片对抗生素敏感性实验

为了确定转化后潮霉素筛选所需的合适浓度，我们设计了潮霉素浓度梯度实验来比较不同浓度下草莓叶片离体培养状况，统一于20 d后观察统计叶片存活情况，结果如图3所示，通过观察我们发现在不添加潮霉素的对照培养基中，离体叶片仍能正常存活，叶片保持嫩绿色，并且有形成愈伤组织的趋势；在含有2 mg/L潮霉素的培养基中，叶片颜色较不含抗生素的培养基明显暗沉，有褐化趋势，但可以看出其仍保持生长迹象；而在含有3 mg/L潮霉素的培养基中，叶片褐化趋势更加明显，但仍有存活的叶片，随着潮霉素浓度的不断增大，直至5 mg/L时，培养基中的叶片完全褐化，无生长迹象。因此，我们选择5 mg/L的潮霉素作为抗生素的筛选浓度。

2.4 农杆菌介导的转化体系正交试验

2.4.1 正交试验结果

本研究按照表2 L₁₈（3⁷）正交实验方案，经3次重复取均值所得的实验结果如表4所示，第13组GUS染色率最高，达78%，因此该组合的转化条件预培养2 d、菌株类型EHA105、菌液OD_600nm值0.6、AS浓度300 mg/L、浸染时间5min、共培养时间5 d为最佳转化条件组合。

2.4.2 正交试验结果的直观分析

对正交试验结果进行直观分析，结果如表5所示，K₁、K₂、K₃ 表示的分别是不同因素下的3个水平各自的GUS染色率之和，极差R表示K₁、K₂、K₃中最大值与最小值之间的差值。由表5中可知，本研究所涉及的6个因素的极差R由大到小依次为1.37>0.88>0.62>0.58>0.53>0.27，由此可得各因素对GUS瞬时表达率的影响大小依次为AS浓度>预培养时间>菌株>共培养时间>侵染时间>菌液浓度。

2.4.3 各因素对GUS染色率的影响

①预培养时间对GUS染色率的影响。本研究中对叶盘组织离体预培养时间设置了3个梯度，分别为1 d、2 d、3 d。实验结果表明预培养2 d的GUS染色率最高，单因素方差分析的差异显著性表明预培养时间2 d与3 d的结果相比有差异，而预培养时间为1 d时与2 d、3 d相比无明显差异。

②农杆菌菌株类型对GUS染色率的影响。由于不同的农杆菌菌株浸染能力不同，并且叶片与不同的菌株类型可能表现出不同的亲和性，因此本研究中分别采用了三种不同的农杆菌菌株：EHA105，GV3101和LBA4404，对离体叶盘组织进行侵染，期望得到有利于叶盘组织转化的最佳菌株类型。用SPSS进行分析得出的差异显著性表明，GV3101与EHA105相比染色率显著提高，LBA4404与GV3101、EHA105相比对染色率的影响差异不显著，由单因素分析可知最利于转化的农杆菌菌株类型为GV3101。

③菌液浓度对GUS染色率的影响。转化过程中的菌液浓度过低则菌株数量太少，转化效率将会很低；相反，若菌液浓度过高，菌株数量过多则会使外植体受到过度的伤害，浸染后会使外植体极易褐化坏死。设置了3个菌液浓度梯度分别为OD_600nm=0.4、 OD_600nm=0.6、 OD_600nm=0.8。本实验结果显示，菌液浓度为OD_600nm=0.6时，所得GUS染色率略高于其他梯度。经单因素方差分析发现，菌液OD_600nm=0.6时的GUS染色率与OD_600nm=0.4、0.8时相比对GUS染色率的影响差异并不明显。

④AS浓度对GUS染色率的影响。一定的AS有助于农杆菌株进入组织细胞内部进行浸染，本研究设置了100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L的AS浓度梯度，期望得到有助于提高转化效率的AS浓度。结果表明，当AS浓度为300 μmol/L时转化效率最佳。经单因素方差分析得到的差异显著性P值远小于0.05，差异极显著，表明不同AS浓度对染色率的影响非常明显。

⑤浸染时间对GUS染色率的影响。本次实验设置了不同的浸染时间梯度，分别为5 min、15 min、25 min，结果表明浸染时间为5 min时的GUS染色率最高。分析发现浸染时间为5 min时的染色率与25 min时对比差异显著，15 min时对染色率的影响与另两组相比差异并不显著。

⑥共培养时间对GUS染色率的影响。共培养时间对GUS染色率的影响结果分析如图4所示。共培养时间的长短能直接影响到目的基因整合以及获得转化细胞的数量，本次研究中对共培养时间设置的3 d、4 d、5 d三个梯度结果表明，共培养时间为5 d时的GUS染色率最高。分析显示共培养3 d与共培养4 d、5 d时相比对GUS染色率影响差异显著，而共培养时间4 d与5 d相比无明显差异。

2.4.4 抗性植株的PCR检测

选取GUS染色呈阳性的转化组织，进一步再生培养得到相应转化植株，18组实验中，实验编号为1、7、16、18的四个实验组在持续筛选过程中逐渐褐化死亡，未成功获得相应的完整植株，剩余14组均再生成功，提取其叶片基因组DNA，以这14组样品为模板进行PCR扩增潮霉素抗性基因，结果如图5所示，除第11、14组外，均得到了845 bp的扩增条带。

3 讨 论

目前,人们已经研究出一系列用于植物遗传转化的方法^[14]，例如以根癌农杆菌介导的转化法、电激法、基因枪法等等。其中，利用根癌农杆菌介导的转化系统能使外源基因快速而高效地整合到目的基因组中，并能够获得大量高效表达，与此同时，整个操作过程相比于其他方法更是具有操作简单、耗时较短等优点，因而被很多研究者采纳并获得了广泛的应用^[15]。利用农杆菌对植物的叶片、茎进行浸染的叶盘转化法是研究草莓遗传转化的主要方法，该方法与植物组织体外再生技术使用结合使用，获得稳定遗传的转化植株，能够加速栽培品种的育种过程。

草莓遗传转化的研究多种多样，但普遍存在转化率低的问题。研究表明草莓的叶片和叶柄最容易再生出完整植株，较花粉和原生质体的转化率要高很多^[13]。但以往的研究中基于红颜品种的相关研究并不多见，该品种为我国草莓主要栽培品种之一，其优化和选育工作尤为重要。因此本文选择以红颜草莓叶片为材料，优化了其叶片离体再生体系，并筛选了影响其转化的众多影响因素，为红颜草莓的品种优化奠定了坚实基础。

在叶盘离体再生体系中，一定时间的暗培养能有效控制离体叶片的褐化情况^[16]，而诱导愈伤形成及分化的激素种类和配比是影响再生效率的另一关键，本文设置了不同的暗培养时间，并选取了不同的激素及浓度组合，最终确定了再生过程中以暗培养9天，愈伤诱导培养基选取MS+2.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L IBA+2，4⁃D 0.1 mg/L，愈伤分化培养基选取MS+0.5 mg/L 6⁃BA+0.1 mg/LNAA时，再生效率最高。

农杆菌转化法中，对于诸多影响因素本实验采用了L₁₈（3⁷）的正交试验方案，得出最佳组合为预培养2 d、添加300 μmol/L的AS、以OD_600nm=0.6的EHA105型的农杆菌浸染5 min、共培养5天时转化效率最高，而各因素中AS浓度对转化效率影响极为显著，这与众多已报道的实验结果相符合^[17,18]。AS的作用主要是激活农杆菌的vir基因并使之高效表达，有研究表明，AS的浓度越高越好，但实际上浓度过高会致使T⁃DNA以多拷贝的形式整合进植物基因组中，给实验造成困难^[19]，对于本文设置的AS浓度，结果表明300 μmol/L时效果最佳。本实验结果同时也表明了预培养时间对转化效率的影响大于菌株类型、浸染时间等因素，预培养时间会影响受体材料的生长状况，当植物组织处于大量增殖和旺盛代谢的状态时，更有利于农杆菌对植物组织的侵染^[20]。本实验中预培养2 d的条件下，农杆菌转化效率最高，且具有显著性差异。说明草莓叶盘经过2 d预培养时，可以达到一个旺盛的代谢状态，这对于本研究中的转化效率有较大影响。诸多研究中提到的菌液浓度对叶盘转化的影响^[19,21,22]在本文设置的诸多因素中最不明显，其原因可能是未能设置合适的浓度梯度，导致了实验中各水平之间差异不显著，也可能是各梯度受其他因素影响较大从而未表现出显著差异。

另外，本实验中筛选成活率总是高于GUS染色率的。其原因可能是前者统计的是将植物组织置于含有相应抗生素的筛选培养基上培养两周后仍然存活的个体数，而GUS染色率的统计是在总培养时间达5~6周以后，离体叶片出现正常状态的愈伤组织，切取部分愈伤组织进行染色统计的结果，两者的统计有一定的时间差。筛选成活的个体在含抗生素的培养基上持续培养的过程中有部分长势极差，并逐渐褐化死亡，并且即使仍然成活的个体也可能对筛选培养基的抗性表现出假阳性，因而导致GUS染色率低于筛选成活率。抗性植株的PCR检测中，第11组、14组没有明显条带，其原因可能是该组得到的植株为含嵌合体的假阳性植株。

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基金资助

三峡大学高层次人才启动基金(2016GCRC02)

三峡大学-勤劳农夫横向合作基金(2017421216000024)