脱氢弯孢霉菌素对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症研究

LPS⁃simulated inflammatory response by dehydrocurvularin in macrophages

摘要

研究脱氢弯孢酶菌素(Dehydrocurvularin, DCV)对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的小鼠腹腔（peritoneal macrophages, PMs）和骨髓来源的巨噬细胞（bone⁃marrow⁃derived macrophages, BMDMs）的影响。MTT方法筛选最佳药物浓度处理不同来源的巨噬细胞，采用Western blot方法检测诱导型一氧化氮合酶（induceble nitric oxide synthase, iNOS）、环氧化酶⁃2(cyclooxygenase⁃2, COX⁃2)及炎性信号通路NF⁃κB和MAPK的相关蛋白的表达。结果显示，脱氢弯孢酶菌素可显著抑制LPS诱导的iNOS、COX⁃2的表达，且呈剂量依赖性。NF⁃κB和MAPK信号通路相关的蛋白激活也受到了明显的抑制。结果表明，脱氢弯孢酶菌素可显著抑制LPS诱导的不同来源的免疫细胞的炎症。

Abstract

To study the effect of dehydrocurvularin (DCV) in lipopolysaccharide (LPS)⁃induced mouse peritoneal macrophages (PMs) and bone⁃derived macrophages (bone⁃marrow⁃derived macrophages, BMDMs). MTT was used to screen the optimal drug concentration to treat macrophages from different sources. Western⁃blot method was used to detect cyclooxygenase⁃2 (COX⁃2) and inflammatory signaling pathway NF⁃κB and MAPK related proteins. DCV significantly inhibited LPS⁃induced COX⁃2 expression in a dose⁃dependent manner. Protein activation associated with NF⁃κB and MAPK signaling pathways was also significantly inhibited. DCV inhibits LPS⁃induced inflammatory properties of immune cells from different sources.

Graphical abstract

关键词

脱氢弯孢霉菌素 / 炎症 / NF⁃κB通路 / MAPK通路

Key words

dehydrocurvularin / inflammation / NF⁃κB pathway / MAPK pathway

0 引 言

炎症是细胞核组织损伤的先天免疫反应，是感染、动脉硬化、代谢紊乱和癌症等许多疾病发病机制中的关键调节因子^[1]。炎症过程由几种不同的免疫细胞控制，如巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞^[2]。其中巨噬细胞作为重要的免疫细胞，在脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）等炎症刺激物诱导下激活，产生大量的炎症介质，最终产生诱导型一氧化氮合酶（Induceble Nitric Oxide Synthase，iNOs）和环氧化酶⁃2(cyclooxygenase⁃2, COX⁃2)的高表达^[3]。因此，巨噬细胞成为慢性炎症相关疾病的重要研究对象。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性细菌细胞膜的主要成分，是一种能够引起炎性反应的诱导剂^[4]。LPS与细胞膜上的TLR4受体结合，导致下游信号通路的启动，产生核因子（NF⁃κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs），并刺激炎症介质的分泌^[5]。因此，LPS诱导的巨噬细胞中的炎症反应是筛选天然小分子药物对炎症药理学作用的有效模型。

脱氢弯孢霉菌素（Dehydrocurvularin, DCV）是一种天然来源的DAL₁₂类苯二酚内酯（curvularin macrolides）化合物（如图1），具有广泛的抗菌、抑制肿瘤细胞增殖、自由基清除和抑制Hsp90等多种生理活性^[6,7,8,9]。脱氢弯孢霉菌素及其类似物的生理活性作用报道较多，但对LPS诱导的小鼠腹腔和骨髓来源的巨噬细胞影响报道较少。本文构建了LPS诱导的巨噬细胞炎症模型，从NF⁃κB和MAPK信号转导通路和COX⁃2介导的级联反应来研究其抗炎的分子作用机制，初步探讨脱氢弯孢霉菌素抗炎机制。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

脱氢弯孢酶菌素由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室从真菌曲霉属(Aspergillus sp.)代谢产物中分离获得，纯度>98%。

动物：SPF级，C57BL/6J小鼠，雄性，体质量25~30 g，由湖北医药学院提供。动物合格证:SCXK(鄂)2016⁃0008。

LPS，Poly I：C和抗GAPDH抗体购自Sigma公司，一抗包括诱导型NOS（induceble nitric oxide synthase,iNOS）、抗环氧合酶2（COX⁃2）、磷酸化p65（p⁃p65）、p65、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（p⁃ERK1/2）、磷酸化JNK（p⁃JNK）、JNK、磷酸化p38（p⁃p38）、p38均购自Cell Signaling Technology（美国贝弗利）。兔抗诱导型一氧化氮合酶（iNOS）单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；GAPDH：Cell Signaling Technology公司；MTT：中国武汉国奥联信生物科技有限公司；ECL显影液：美国Thermo Pierce公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒：中国碧云天生物技术有限公司；改良布氏硫代羟乙酸盐培养基：上海创赛科技有限公司。

1.2 实验仪器与设备

二氧化碳培养箱、垂直层流超净工作台：美国Thermo公司；低温高速离心机：Eppendorf公司；电泳仪、凝胶成像系统：美国Bio⁃Rad公司；涡旋混匀器：中国海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子天平：国豪斯国际贸易有限公司；多功能酶标仪：中国上海仪涛生物仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

① 腹腔内巨噬细胞(PMs)培养。提前配置肉汤，称取改良布氏（Brewer）硫代羟乙酸盐培养基粉末38.5 g,加入去离子水充分混匀，调节pH至7.2，去离子水定容至1L，高压灭菌锅121 °C灭菌30 min,分装至高温灭菌后的玻璃瓶中，封口膜封口，4°C避光保存备用。取3 mL的肉汤，腹腔注射小鼠体内，4天后，将小鼠颈椎脱臼处死，在75%酒精中完全浸泡3 min后，无菌条件下将小鼠腹腔外表真皮层剪开，用注射器将事先备好的4 mL无血清1640培养基注射入小鼠腹腔内,然后用注射器将培养基抽回置于灭菌的15 mL管内；800 r/min离心3 min, 用1640完全培养基悬起细胞沉淀，接种于培养皿中，置于37 ℃，5%CO₂的环境中培养2~3 d，待细胞贴壁。

② 骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)培养。小鼠颈椎脱臼处死，75%的酒精浸泡3 min，取小鼠双侧完整后肢，胫骨和腓骨去除肌肉组织，转移到PBS中清洗一下，浸泡在75%酒精中，2 min后用无菌注射器吸取5 mL DMEM完全培养基，无菌条件将骨髓吹出，800 r/min离心3 min；红细胞裂解液裂解红细胞，1 min左右，加入新鲜1640完全培养基终止裂解；800 r/min离心3 min，用1640完全培养基悬起细胞沉淀，接种于培养皿中，置于37 ℃，5%CO₂的环境中培养2~3 d，待细胞贴壁。

1.3.2 MTT实验

PMs、BMDMs细胞分别以每孔1×10⁵细胞的密度接种在96孔板中，加入1640完全培养基，待细胞单层长满后，用不同浓度的DCV（0、 0.25、 0.5、1.0、 2.0、 3.0和4.0 µmol/L）预处理2 h，然后用LPS（1 μg/mL）刺激16 h。每孔加入10 μL MTT（称取0.5 g MTT粉末，充分溶解于100 mL PBS溶液后使用0.22 μm孔径微孔滤膜过滤分装到2 mL高压灭菌过的EP管中，-20 ℃冰箱避光保存），培养4 h后，弃掉培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜并低速震荡5 min，待紫色结晶溶解完全后用酶标仪在490 nm 波长处测定吸光度。

1.3.3 Western⁃blot实验

PMs、BMDMs细胞分别接种在6孔板中，并用DCV（0、0.5、1.0和2.0 µmol/L）预处理2 h，然后用LPS（1μg/mL）根据实验所需分别刺激16 h和30 min。收集细胞并用PBS洗涤。将细胞沉淀重悬于含有50 mmol/L Tris⁃HCl（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1%Triton X⁃100、1%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），1 mmol/L Na₃VO₄、的裂解缓冲液中，含有1 mmol/L蛋白酶抑制剂的混合物在冰上放置30 min。将裂解物以12 000(×g)离心10 min，4 °C下获得全细胞裂解物。收集上清液蛋白并使用BCA分析定量。将样品在100 °C下煮沸7 min，然后在冰上冷却10 s。将等量的蛋白质进行10%SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭后，将膜与特定的一抗在4 °C孵育过夜。将膜在结合HRP的二抗与脱脂牛奶（1∶5 000, V∶V）中一起孵育1 h，含吐温的PBS缓冲液（PBST）洗涤3次后，用ECL显影液进行检测。

1.3.4 统计学方法

文章中的所有数据均用平均值±标准误差来表示,采用SPSS 25.0进行单因素方差分析。＃表示空白组与对照组相比差异极显著（P<0.001)，*和**分别表示脱氢弯孢霉菌素对照组和处理组相比差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）。

2 结果与分析

2.1 脱氢弯孢霉菌素对PM和BMDM细胞活力的影响

为了评估脱氢弯孢霉菌素的细胞毒性作用，在有或没有LPS（1 μg/mL）的情况下，将不同来源的小鼠巨噬细胞用各种浓度的药物（0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 μmol/L）预处理2 h，LPS（1 μg/mL）刺激16 h，MTT法分别检测PMs和BMDMs细胞生存活率范围为(96.3±3.5)%和(97.1±2.3)%，表明DCV浓度基本不会影响PMs和BMDMs细胞生存能力，选择合适的给药浓度区间（0、 0.5、 1.0、 2.0 μmol/L）用于后续实验。

2.2 脱氢弯孢霉菌素对LPS诱导的iNOS和COX⁃2蛋白表达的影响

蛋白质印迹分析表明，在静止的PMs和BMDMs细胞中几乎检测不到iNOS和COX⁃2蛋白表达，这些蛋白的表达水平在LPS刺激下显著诱导，而脱氢弯孢霉菌素在浓度依赖性下强烈抑制了这些蛋白的表达（图2）。

2.3 脱氢弯孢霉菌素对NF⁃κB信号通路的影响

众所周知，NF⁃κB在炎症和先天免疫中起着重要作用。因此，检测相关蛋白p⁃p65和p65的表达对脱氢弯孢霉菌素通过NF⁃κB途径发挥抗炎反应有重要意义。蛋白免疫印迹分析，如图3所示，与对照组相比，LPS处理显著增加了p⁃p65的表达。然而，在PMs和BMDMs细胞中，脱氢弯孢霉菌素预处理以剂量依赖性方式显著抑制p⁃p65的表达。

2.4 脱氢弯孢霉菌素对MAPK信号通路的影响

MAPK在促炎基因的启动中起关键作用。蛋白免疫印迹分析表明（图4和图5所示），LPS刺激显著触发了包括p38，ERK和JNK在内的MAPKs激酶的激活。与单独使用LPS治疗的空白组相比，在PMs和BMDMs细胞中p⁃Erk水平显著受到抑制。

3 讨 论

巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，在清除病原体和维持组织的稳态方面有着重要的作用^[10,11,12]。在炎症反应中，促炎和抗炎细胞因子的过量产生在各种炎性反应中起关键作用^[13]。越来越多的证据表明，NO和PGE2是炎症的重要介质，例如自身免疫性疾病和神经退行性疾病^[14]。响应各种炎症刺激而生成过量的NO和PGE2有助于慢性炎症疾病的发展^[15]。由于这些原因，抑制NO的产生可能是对抗炎症性疾病的一种有前途的策略。iNOs为一个260×10³的同源二聚体，无活性的单体常需聚合成二聚体才具有合成一氧化氮的能力^[16]。在正常生理情况下，各组织细胞的iNOs活性几乎不表达，病理状态下受刺激后会被激活。iNOs在分子水平上调控着重要介质一氧化氮（NO）的合成^[17]，本文中，我们通过减少LPS诱导的巨噬细胞中iNOs的产生来评估脱氢弯孢霉菌素的抗炎作用。与单独使用LPS刺激相比，脱氢弯孢霉菌素明显降低iNOS和COX⁃2蛋白水平（图2A、2C）。因此，脱氢弯孢霉菌素可以通过降低iNOS和COX⁃2的表达来抑制炎症，非细胞毒性所致。NF⁃κB是主要的转录因子，在细胞对多种刺激的反应中起着至关重要的调节作用。同时，研究表明NF⁃κB通路的变化与抗炎反应有关^[18]。本文实验结果表明脱氢弯孢霉菌素显著抑制NF⁃κB信号通路相关蛋白p65的磷酸化（图3A、3C）。在PMs和BMDMs细胞中，脱氢弯孢霉菌素对LPS刺激Erk磷酸化有显著的抑制作用（图4、图5）。本文为脱氢弯孢霉菌素抗炎机制提供了初步的分子基础。

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基金资助

湖北省教育厅科研计划项目(D20182101)