添加剂对水稻秸秆实地混合厌氧发酵产甲烷系统的作用

Effects of additives on methane production system of mixed anaerobic fermentation with rice straw in field

摘要

为提高水稻秸秆利用效率，改进水稻秸秆实地混合厌氧发酵产甲烷技术，本研究开展了添加剂在混合厌氧发酵系统的应用研究。试验选取水稻秸秆和猪粪作为发酵原料，通过分别添加不同的浓度的吐温20和腐植酸，测定甲烷的产气量和浓度、秸秆的降解和土壤肥力的变化，以揭示添加剂类型及其浓度对水稻田实地甲烷生产系统的影响。结果表明：添加剂的掺入并未影响产气的动态变化趋势，但显著地促进产气和提高产气浓度，整体效果由高到低为腐植酸>吐温20>对照，其中经腐植酸处理的产气量和产气浓度对照相比分别提高了50.73%和24.55%。添加剂的掺入有利于水稻秸秆纤维素和半纤维素的降解，但对木质素没有显著影响；其中以0.15 g/L腐植酸和0.30 g/L吐温20的降解率最高，相较于对照其纤维素降解率均提高了22.11%，半纤维素降解率分别提高了107.13%和98.39%。添加剂的掺入能显著增加土壤肥力，以0.15 g/L腐植酸和0.30 g/L吐温20处理水平的效果最优，相较于对照，其土壤有机质分别增加了29.63%和23.72%，全氮分别增加了52.32%和42.38%，全磷分别增加了83.33%和57.14%。

Abstract

To improve the utilization efficiency of rice straw and improve the methane production technology of mixed anaerobic fermentation with rice straw， this study carried out the research on additives application in the mixed anaerobic fermentation system. The rice straw and pig manure were selected as fermentation raw materials. The Tween 20 and humic acid at different concentrations were added. The gas production and methane concentration， straw degradation and soil fertility variation were measured to reveal the effects of additive types and their concentrations on field methane production system. The results showed that addition of additives did not affect the dynamic change of gas production， but the addition of additives had significant promotion on gas production and gas concentration. The overall effect was humic acid>Tween 20>control. The gas production and gas concentration of the humic acid treatment were increased by 50.73% and 24.55%， compared with the control. The addition of additives was beneficial to the degradation of rice straw cellulose and hemicellulose， but no effect on lignin. 0.15 g/L humic acid and 0.30 g/L Tween 20 treatments had the highest degradation rate. The cellulose degradation rate increased by 22.11%， and the hemicellulose degradation rate increased by 107.13%， 98.39% compared with the control. The addition of additives can significantly increase soil fertility. The treatments with 0.15 g/L humic acid and 0.30 g/L Tween 20 had the best effect. The soil organic matter increased by 29.63%， 23.72%， the total nitrogen increased by 52.32%， 42.38%， and the total phosphorus increased by 83.33%， 57.14 %， compared with the control.

Graphical abstract

关键词

混合厌氧发酵 / 甲烷 / 添加剂 / 秸秆降解 / 土壤肥力

Key words

mixed anaerobic fermentation / methane / additive / straw degradation / soil fertility

0 引 言

水稻是我国主要的粮食作物，2016年种植面积达到4.53亿亩^［1］，每年因此而产生大量的水稻秸秆。水稻秸秆的主要利用方式为秸秆还田、畜禽饲料和生物质燃料，除此外还有大量秸秆未得到充分利用^［2］。秸秆的堆积和焚烧不仅浪费资源，还对生态环境造成一定的影响^［3］，秸秆的无害化处理因此而得到了人们的广泛关注^［4］。日本学者田村广人教授研发了水稻秸秆田间发酵产生物甲烷技术^［5］。该技术采用水稻秸秆作为单一基质，在田间进行直接厌氧发酵生产甲烷，做到了秸秆的无害化处理，改善了土壤肥力。但由于秸秆的碳氮比高，不利于微生物的生长繁殖，很大程度限制了厌氧发酵产甲烷的效率和对土壤肥力的提高效应^［6］。因此，耿启明等^［7］对此进行了改进，形成了秸秆与农家有机肥混合厌氧发酵产甲烷技术（简称BMF技术），取得了较好的效果。但上述与实践生产需要相比，仍有一定的差距。

添加剂作为提高厌氧发酵效率一种重要手段备受人们的关注^［8，9］。研究表明，添加剂应用在混合厌氧发酵体系中，能不同程度地促进厌氧发酵产气。Lin等^［10］和Gao等^［11］在厌氧发酵体系中掺入碳酸氢钠，维持发酵体系pH值在适宜的范围6.0~8.0内，使其甲烷产量增加30%~50%^{［10，11］}。甘荣等^［12］在中温和高温条件下，向玉米秸秆厌氧发酵系统中添加活性炭，发现累积甲烷产量分别提高了63%和96%。为了进一步改善BMF技术，提高甲烷产率和改善土壤肥力，本研究在BMF技术上，进一步开展了添加吐温20和腐植酸等添加剂的实验研究，通过测定添加了不同浓度的吐温20和腐植酸等处理的甲烷产气量、甲烷浓度，发酵前后纤维素，半纤维素和木质素含量的变化，以及发酵前后土壤有机质、土壤全氮和土壤全磷含量的变化，揭示了不同类型添加剂对水稻秸秆混合厌氧发酵甲烷产量、秸秆分解和土壤养分的影响，为水稻田秸秆厌氧发酵产生物甲烷技术的改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用样地选取自宜昌市农科院枝江试验站（试验站）内长期耕种水稻田，水稻秸秆取自试验站大田收割水稻后在岸边堆积的秸秆，猪粪取自于试验站内养猪场内堆积的猪粪。土壤为接种物，猪粪和秸秆称为发酵基质，其主要特性见表1。

1.2 试验设计

在试验前根据李培良等^{［13，14］}研究选取吐温20和腐植酸作为添加剂，分别标记为T和F，并根据其研究设置添加浓度。吐温20（Biofroxx德国）的主要成分为C₅₈H₁₁₄O₂₆，含量为1277.12 g/mol，纯度为96%。腐植酸（煜伶one&ten）主要成分为腐植酸，浓度为60 g/L，另含40 mL/L的微生物制剂和100 mL/L的木醋液以及其他一些营养元素。

吐温20的添加浓度0.10、0.30、0.50 g/L，标记为T1、T2、T3；腐植酸的添加浓度0.05、0.15、0.25 g/L，标记为F1、F2、F3。按照浓度设计分别配置各处理水平的添加剂溶液，每个处理重复三次，每一试验组添加50 L添加剂。同时设置不添加外源添加剂，只添加清水的对照，标记为CK，重复3次。整个试验共21个试验组。分别称取150 kg的水稻秸秆和猪粪，将已配好的各处理水平的添加剂均匀喷洒在其上，分层填入已挖好的2 m×7 m×0.2 m的长方体坑中。然后覆集气膜，四周用土埋实，防止漏气。最后连接集气装置，水淹，进行为期210天的混合厌氧发酵试验。

1.3 指标测定

① 发酵基质物理特性的测定：水稻秸秆和猪粪总固体质量分数以及含水率的测定采用烘箱105 ℃ ± 5 ℃下干燥恒重法；水稻秸秆和猪粪的挥发性固体质量分数的测定采用马沸炉（550±20） ℃下灼烧恒重法。

② 甲烷产量和浓度的测定：每隔15天，用气体流量计测定各处理的产气量，同时采集少量气体样品带回实验室，用气相色谱仪法^［15］测定样品气体甲烷含量。

③ 温度的测定：每天定时到试验地用温度计测定田间温度，每15天取其平均值。

④ 秸秆降解和土壤肥力的测定：水稻秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的定量分析分别采用了72%浓硫酸水解法、2 mol/L盐酸水解法和浓硫酸法^［16］；水稻秸秆和猪粪的总碳的测定采用重铬酸钾容量法；土壤有机质的测定采用重铬酸钾容量法，土壤的总氮和总磷用连续流动分析仪测定^［17］。

1.4 数据处理

用Excel 2010分别统计每种添加剂各处理水平每次甲烷的产气量和田间温度，用Origin9.1绘制曲线图，分析各类型添加剂产气的动态变化。以不同类型添加剂和添加量为变量，以各添加剂每种处理水平的累积产气量和平均产气浓度为因变量，采用SPSS 20.0进行多因子方差分析，分析不同类型添加剂和添加量对厌氧发酵产气效率的影响的差异显著性。当单因子影响达到显著水平时，再进行单因素方差分析和S⁃N⁃K法多重比较，分析同一添加剂不同添加量对累积产气量和平均甲烷浓度的影响。

2 结果与分析

2.1 添加剂对混合厌氧发酵产甲烷进程的作用

各处理产甲烷的进程呈相同的变化趋势，产气量均呈下降⁃上升⁃下降的变化（图1），但T和F处理产气量的低峰值和高峰值均高于CK。其中在75~105 d，各处理的产气量有最小值，并有小幅度波动与上升。45 d后T和F处理的产气量均比对CK高，180 d时产气量有最高峰，后期产气量维持在较高水平，直到试验结束。其中，F处理最高峰达到1 761 L，比CK的最高峰（1 200 L）高46.75%，T处理最高峰（1 662 L）比CK高38.50%。

田间温度与产气量的变化趋势基本一致。对田间温度和产气量进行person相关分析，结果显示，相关系数为0.862，P<0.05，即田间温度和产气量具有显著的正相关关系，表明田间温度是影响厌氧发酵产气的重要因子。田间温度在0~25 ℃范围内，产气量随着田间温度的升高而升高。

2.2 添加剂对混合厌氧发酵产甲烷量及其浓度的作用

多因子方差分析表明，不同添加剂类型之间的产气量和产气浓度存在显著性差异（P<0.05）（图2a）。F和T处理均促进厌氧发酵产气和提高产气浓度，促进效果依次为F处理>T处理>CK。F和T处理的累积产气量分别为12 572 L和11 597 L，相较于CK（8 341 L）分别增加了50.73%和39.04%，F和T处理的甲烷浓度分别为60.06%和52.64%，相较于CK（48.22%）分别增加24.55%和9.17%。

各类型添加剂的不同浓度对发酵产甲烷的存在显著性差异（P<0.05）（图2b和图2c）。T和F处理的各处理水平的累积产气量和平均甲烷浓度均高于CK。T处理以T2处理的累积产气量和平均甲烷浓度最高，分别为12 368 L和56.04%，与CK及T1和T3各处理相比，累积产气量分别增加了48.28%，9.73%和10.90%，平均甲烷浓度分别提高了16.22%，13.05%和7.13%。F处理以F2处理的累积产气量和平均甲烷浓度最高为13 063 L和61.77%，与CK及F1和F3各处理相比，累积产气量分别增加了56.61%，5.79%和6.16%，平均甲烷浓度分别提高了28.10%，1.31%和7.56%。综合考虑产气量和甲烷浓度，以T2和F2处理的甲烷产量最高，相较于CK分别增加70.70%和95.83%。

2.3 添加剂对混合厌氧发酵产甲烷系统秸秆降解的作用

多因子方差分析表明，不同添加剂类型之间的秸秆降解存在显著性差异（P<0.05）（表2）。F和T处理均促进秸秆降解，促进效果依次为F处理>T处理>CK，但对木质素的变化率没有显著的影响。试验结束时（210 d），T和F处理的纤维素含量分别为16.61%和16.37%，其降解率分别为53.07%和53.74%，相较于CK（48.57%）纤维素降解率分别提高了9.26%和10.64%。T和F处理的半纤维素含量分别为14.71%和13.89%，其降解率分别为39.11%和42.51%，相较于CK（23.72%）半纤维素降解率分别提高了64.88%和79.22%。T和F处理及CK的木质素含量和变化率并没有显著差异。

各类型添加剂的不同浓度对秸秆降解的存在显著性差异（P<0.05）。T和F处理的各处理水平的纤维素降解率和半纤维素降解率以T2和F2处理最高。其中T2处理纤维素和半纤维素含量为14.40%和12.80%，其降解率分别为59.31%和47.02%，与CK及T1和T3各处理相比，纤维素降解率分别提高了22.11%，23.33%和14.56%，半纤维素降解率分别提高了98.23%，30.72%和37.04%；F2处理纤维素和半纤维素含量为14.40%和12.80%，其降解率分别为59.31%和49.09%，与CK及F1和F3各处理相比，纤维素降解率分别提高了22.11%，16.68%和16.02%，半纤维素降解率分别提高了106.96%，29.05%和21.51%。

2.4 添加剂对混合厌氧发酵产甲烷系统土壤肥力的作用

通过多因子方差分析表明，不同添加剂类型之间的土壤肥力存在显著性差异（P<0.05）（表3）。F和T处理均提高土壤肥力，促进效果依次为F处理>T处理>CK。试验结束（210 d）时，T和F处理的土壤有机质分别为33.45和34.20 g/kg，相较于CK（28.08 g/kg）分别提高了19.12%和21.79%。T和F处理的全氮含量分别为1.91和2.04 g/kg，相较于CK（1.51 g/kg）分别提高了26.49%和35.10%。T和F处理的全磷含量分别为1.22和1.35 g/kg，相较于CK（0.84 g/kg）分别提高了45.24%和60.71%。

各类型添加剂的不同浓度对土壤肥力的存在显著性差异（P<0.05）。T和F处理的各处理水平的土壤有机质、全氮和全磷分别以T2和F2处理最高。其中T2处理土壤有机质、全氮和全磷分别34.74、2.15和1.32 g/kg，与CK及T1和T3各处理相比，土壤有机质分别提高了23.72%，9.38%和2.60%，全氮分别提高了42.38%，23.56%和16.22%，全磷分别提高了57.14%，10.00%和15.79%；其中F2处理土壤有机质、全氮和全磷分别36.40、2.30和1.54 g/kg，与CK及F1和F3各处理相比，土壤有机质分别提高了29.63%，11.42%和8.56%，全氮分别提高了52.32%，17.95%和22.99%，全磷分别提高了83.33%，21.26%和23.20%。

3 讨 论

3.1 添加剂对厌氧发酵的影响

添加剂是提高厌氧发酵的产气效率的一种重要手段^［18~20］。秦向东等研究发现，在单一厌氧发酵系统中添加吐温20等一类表面活性剂能够促进厌氧发酵进程，提高产气效率，使甲烷产量较对照提高了15.97%^{［21，22］}。李培良等^［13］研究发现在苯酚厌氧发酵中添加腐植酸，明显提高底物的降解率。不同添加剂对发酵进程和甲烷产量的作用机制存在差异。吐温20等表面活性剂有助于改善细胞的通透性，改变发酵细胞对金属离子利用的有效性。猪粪中含有丰富的微量金属元素，在吐温20作用下，细胞对微量金属元素的快速吸收与利用促进了微生物生长代谢，提高厌氧发酵产沼气的效率^［14］。腐植酸作为一种重要的氧化还原介质，具有复杂的结构，因而具有吸附、络合和氧化还原等特性，能够促进有机物质的降解，加快厌氧生物转化，促进厌氧发酵进程^［13］。但不同添加剂浓度对厌氧发酵的效应有着较大差异。吐温20等一类表面活性剂在低浓度时（0.125%~1.25%）能促进甲烷的产生，但随着添加量增加到1.25%，甲烷的产生受到抑制，这是因为过量的表面活性剂对微生物产生了一定的毒性，从而抑制产气^［14］。高浓度的腐植酸对有机物的降解作用减小，减缓产气效率的促进作用^［13］，其原因是在微生物厌氧转化过程中，腐植酸达到一定浓度时，能够提供足够电子用于厌氧转化，再继续增加其添加量，对厌氧发酵的促进作用呈减缓的趋势^［23］。

本研究吐温20和腐植酸对水稻秸秆实地混合厌氧发酵产甲烷系统的影响，发现吐温20和腐植酸都能显著提高厌氧发酵产气效率，提高甲烷产量。添加剂的掺入提高了整个反应产气的水平和峰值，使得掺有添加剂处理的产气量和产气浓度均高于对照。但两种添加中，掺有腐植酸的处理组的产气量和产气浓度又高于吐温20处理组，其原因在于吐温20仅仅是促进了细胞的生长，而腐植酸则参与调控了整个厌氧发酵产甲烷进行^［14］。其具体作用机理的差异仍值得进一步研究。在腐植酸和吐温20的实验添加浓度范围内，厌氧发酵的产气效率均随两种添加剂浓度的升高呈先升高后降低的变化趋势，表明两种添加剂都有一个最适作用范围，腐植酸的添加浓度以0.15 g/L左右为宜，而吐温20的添加浓度以0.30 g/L左右为宜。

3.2 添加剂对秸秆降解和土壤肥力的影响

水稻秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素和木质素等成分^［24］。纤维素和半纤维素等成分容易被厌氧微生物利用，降解转化产生大量营养物质^［25］，而木质素因其自身特性，在厌氧发酵过程中很难被厌氧微生物降解，一定程度上限制了厌氧发酵产气^{［25，26］}。在发酵系统中添加一定量的添加剂能够促进发酵底物的降解和底物的利用率。连战等^［27］在秸秆厌氧发酵系统中添加吐温20和吐温80，发现秸秆降解率比对照分别增加了5.46%和3.68%。李培良等^［13］在厌氧发酵系统中添加腐植酸，发现底物的降解率提高了18.5%。添加剂对秸秆降解的作用主要是影响纤维素和半纤维素，对木质素的降解没有显著性的影响^［28］。本研究各试验组的秸秆降解率为纤维素>半纤维素>木质素。表明添加剂对秸秆的降解作用也是主要作用于纤维素和半纤维素，这与赵玲^［24］的研究结果一致。试验中腐植酸的处理效应略高于吐温20，但两者均显著高于对照。各处理水平也是以F2和T2的处理效应最好。F2水平对纤维素和半纤维素的降解率较对照分别高22.11%和106.96%，T2分别较对照高22.11%和98.23%。

水稻秸秆实地混合厌氧发酵产甲烷系统的应用，不仅可以获得沼气这一清洁能源，同时还可以有效提升水稻田土壤肥力^［7］。发酵后土壤有机质，全氮和全磷含量的增加，主要是依靠秸秆和猪粪等厌氧发酵底物分解所释放的营养物质^［29］。董明哲等^［30］研究表明秸秆发酵过程中纤维素和半纤维素的降解对土壤肥力有显著影响。耿启明等^［7］研究表明，水稻田在秸秆和猪粪厌氧发酵后，随着秸秆的降解，土壤的有机质、全氮、全磷的含量分别比对照提高了171.76%，30.08%和49.11%。本研究发现添加剂也能提高了土壤的肥力，整体效果为腐植酸>吐温20>对照。表明添加剂在促进秸秆降解的同时，也提高了土壤肥力。其中腐植酸处理的土壤的有机质、全氮、全磷的含量分别较对照提高了21.79%，35.10%和60.71%。在其添加浓度范围内，土壤有机质、全氮和全磷的变化趋势与秸秆木质纤维素和半纤维素的降解趋势基本一致，均呈现先升高后降低。其最适的处理水平也均为F2和T2。整个实验结果表明，水稻秸秆实地混合厌氧发酵产甲烷系统中选用腐植酸和吐温20作为添加剂，不仅能够提高厌氧发酵的产气效率，提高甲烷产量，且促进水稻秸秆的降解，增加土壤肥力。

4 结 论

① 秸秆实地厌氧发酵产甲烷进程主要受气温的影响，吐温20和腐植酸等添加剂的掺入对其并没有显著影响，其产气量均呈现下降⁃上升⁃下降的变化趋势。添加剂对产气量和产气浓度具有显著的促进作用，其整体效果依次为腐植酸>吐温20>对照，腐植酸和吐温20的最优处理为0.15 g/L腐植酸和0.30 g/L吐温20，相较于对照，其累积产气量分别增加56.61%和48.28%，甲烷浓度分别提高28.10%和16.22%。

② 吐温20和腐植酸的掺入有利于水稻秸秆纤维素和半纤维素的降解，但对木质素没有显著影响，整体效果为腐植酸>吐温20>对照。以0.15 g/L腐植酸和0.30 g/L吐温20的降解率最高，相较于对照，其纤维素降解率均提高了22.11%，半纤维素降解率分别提高了107.13%和98.39%。

③ 吐温20和腐植酸的掺入均能显著增加土壤肥力，其整体效果依次为腐植酸>吐温20>对照。各处理分别以0.15 g/L腐植酸和0.30 g/L吐温20的促进效果最好，相较于对照，其土壤有机质分别增加了29.63%和23.72%，全氮分别增加了52.32%和42.38%，全磷分别增加了83.33%和57.14%。

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基金资助

湖北省科技创新专项重点项目(2016AHB014)