家族性高胆固醇血症HDL⁃miRNAs调节血单核细胞功能机制

Mechanism of HDL⁃miRNAs modulating the function of the peripheral blood monocyte in patients with familial hypercholesterolemia

摘要

本研究通过生物信息学方法分析家族性高胆固醇血症患者外周血单核细胞差异表达基因、HDL载体差异表达miRNA及其生物学功能，研究差异HDL⁃miRNA与单核细胞差异基因的相关性，探讨HDL⁃miRNA调控外周血单核细胞功能机制，寻找动脉粥样硬化防治新靶点。运用R语言分析GEO数据库共享平台家族性高胆固醇血症外周血单核细胞基因及HDL⁃miRNA探针芯片得到差异基因及差异miRNA，利用miRwalk2.0预测miRNA靶基因，并利用STRING进行蛋白互作分析，构建差异miRNA与差异基因之间的调控网络。运用GO及KEGG分析研究基因功能。利用GEO数据（GSE6054）筛选出834个差异表达基因，利用GEO数据（GSE25108）筛选出HDL上差异miRNA28个。交叉匹配得到由19个差异miRNA和56个差异基因组配对的74对miRNA⁃靶基因。GO富集分析56个差异基因主要富集于肾上腺素受体信号等分子功能。KEGG分析56个差异基因主要富集于造血谱系通路上。家族性高胆固醇血症差异HDL⁃miRNA与外周血单核细胞差异mRNA具有相关性，HDL⁃miRNA有通过调控血单核细胞功能的可能性，可能参与高胆固醇血症导致动脉粥样硬化过程。

Abstract

To explore the effect of HDL⁃miRNA on peripheral blood monocytes in the process of atherosclerosis by bioinformatics， we analyzed the biological functions of the differential expression of genes （DGEs） in peripheral blood monocytes and the differential expression of HDL⁃miRNAs（DEMs） in patients with familial hypercholesterolemia. The data of gene and miRNA related familial hypercholesterolemia was obtained from GEO database. DGEs and DEMs were analyzed by R language. The miRwalk2.0 online tool was used to predict miRNA target genes and protein interaction analysis was performed by STRING to obtain the regulatory network between DGEs and DEMs. GO and KEGG analyzed the function of related genes. GEO data （GSE6054） was used to screen 834 DEGs and GEO data （GSE25108） was used to screen 28 DEMs on HDL in patients with hypercholesterolemia. Cross⁃matching was performed and obtain 74 pairs of miRNA gene pairs in 19 DEMs and 56 DGEs. GO analysis showed that the 56 DGEs were mainly concentrated in the molecular functions of adrenergic receptor signal. KEGG analysis showed that 56 differentially expressed genes mainly enriched in the hematopoietic cell lineage pathway. The analysis of the DGEs in peripheral blood monocytes and HDL⁃DEMs in patients with familial hypercholesterolemia based on bioinformatics provides a new perspective for the study of atherosclerosis， providing a new sight in screening diagnostic markers and drug therapeutic targets of atherosclerosis.

Graphical abstract

关键词

家族性高胆固醇血症 / HDL / miRNA / 外周血单核细胞 / 生物信息学分析 / 动脉粥样硬化

Key words

familial hypercholesterolemia / HDL / miRNA / peripheral blood monocyte / bioinformatics / atherosclerosis

0 引 言

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是导致心、脑、肾等多器官缺血性病变的常见疾病，特别是心肌梗死和脑卒中，严重危害人类健康^［1］。其基本病变是大中动脉内膜的脂质沉积、粥样斑块形成，以致动脉管壁变硬、官腔狭窄^［2］。围绕AS发病机制的研究，人们提出了脂质渗入学说、内皮损伤学说、平滑肌突变学说、炎症学说及单核⁃巨噬细胞作用学说等多种可能机制^［3］。虽然学说众多，但一致公认AS的发病过程涉及多种细胞以及多种具有生物活性的分子。

单核细胞⁃巨噬细胞参与了AS发生、发展的整个过程^［4］。其大致过程为：外周血单核细胞与动脉内皮细胞黏附、迁入内皮下间隙分化为巨噬细胞，吞噬内膜下氧化脂质形成泡沫细胞以及释放多种细胞因子。有研究报道家族性高胆固醇血症患者血液中高胆固醇的环境可以使外周血中单核细胞内胆固醇代谢发生改变^［5］。这种胆固醇代谢的改变导致外周血单核细胞处于脂质超载状态，更容易发生AS。

microRNAs （miRNAs）是一类在进化过程中高度保守，长度约为22⁃nt的非编码RNA，通过识别靶基因3’⁃非翻译区（3’⁃UTRs），降解或抑制mRNA翻译，调控靶基因表达。miRNA参与调控炎症反应、脂质代谢等细胞机制，影响AS发生发展^［6］。有研究报道家族性高胆固醇血症患者血液中的miRNA可以经由高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）运送至靶细胞调控细胞功能，并证实HDL⁃miRNAs在心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）中发生改变，包括高胆固醇血症和AS^［7］。

外周血单核细胞和HDL⁃miRNA都与AS密切相关。那么，HDL⁃miRNA是否能通过调控外周血单核细胞功能来影响AS过程？特别是差异表达的HDL⁃miRNA引起单核细胞差异基因表达，但尚未有相关的报道。家族性高胆固醇血症是一种常染色体显性遗传病，患者血液中持续存在数值异常超高的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）胆固醇，是人类AS发生的常见病因^［8］。因此，本文利用GEO数据平台，通过分析家族性高胆固醇血症患者外周血单核细胞差异表达基因和血浆中差异表达HDL⁃miRNAs，研究HDL⁃miRNAs与单核细胞差异基因的相关性，探寻高胆固醇血症条件下HDL⁃miRNAs调控外周血单核细胞功能影响AS的机制。

1 数据来源与方法

1.1 数据来源

GSE6054 mRNA表达芯片以及GSE25108 miRNA表达芯片的矩阵文件和芯片探针注释文件来源于美国国立生物技术信息中心（NCBI）平台下的基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）。GSE6054芯片检测外周血单核细胞mRNA表达谱，包括10个家族性高胆固醇血症组样品和13个正常对照组样品。GSE25108芯片检测HDL中miRNA表达谱，包括5个家族性高胆固醇血症样品和6个正常对照组样品。利用Perl软件将两个芯片的矩阵文件中探针名转化为标准基因名。利用R语言读取芯片矩阵数据并进行缺失值的补充、数据均一化处理等。

1.2 差异表达基因及miRNA筛选

利用R语言Limma程序包分别对两个数据集家族性胆固醇血症组和正常组进行差异分析：读取两组间各样本检测基因荧光值，荧光值的比值为差异倍数（FC），并通过t检验计算P值。筛选阈值：∣FC （fold change）∣≥1.5，P<0.05。再利用ggplot2程序包绘制差异基因及miRNA火山图。

1.3 miRNA的靶基因预测

利用在线miRNA靶基因预测工具miRWalk2.0（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）进行miRNA⁃Gene结合信息预测。将miRWalk2.0miRNA预测的结合位点与另2个miRNA靶标预测程序（mirBridge， Targetscan6.2）的预测结合信息集合进行结合关联分析。

1.4 miRNA与基因调控网络构建

差异基因与差异miRNA预测的靶基因做交集。将交集基因与差异miRNA进行交叉匹配，并利用STRING（http：//www.string-db.org）构建miRNA调控的基因编码蛋白的相互作用网络。利用Cytocape软件绘制调控网络图。

1.5 GO富集分析及KEGG通路分析

通过R软件ClusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2程序包对差异表达基因进行GO分析以及KEGG通路富集分析。分析结果P<0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 差异表达基因及miRNA

芯片GSE6054中筛选得到家族性高胆固醇血症患者外周血单核细胞的834个差异表达基因，其中397个差异基因表达下调，437个差异基因表达上调（图1A）；芯片GSE25108中筛选得到家族性高胆固醇血症患者HDL差异miRNA28个，其中16个miRNA表达下调，12个miRNA表达上调（图1B），具有显著差异的基因和miRNA见表1。这些结果显示差异表达基因和差异表达HDL⁃miRNA与家族性高胆固醇血症具有相关性。

2.2 差异表达miRNA与差异表达基因调控网络

差异基因与差异miRNA预测的靶基因做交集，得到99个交集基因。99个交集基因与miRNA进行交叉匹配（原则：交集基因为低表达，则调控该基因的miRNA为高表达；反之，交集基因为高表达，则调控该基因的miRNA为低表达），共得到74对miRNA⁃基因对，包括19个差异miRNA和56个差异基因（表2）。利用STRING蛋白互作数据库对56个差异基因进行互作分析。最后将19个差异miRNA与56个差异基因的调控关系，以及56个差异基因之间的相互作用关系用Cytoscape进行可视化（图2）。14个miRNA及46个差异基因可以形成较集中的互相关联的调控网络。网络中，miR⁃186、miR⁃30a、miR⁃223、IL7、TGFBR3处于网络的中心位置，表明这些关键靶点在单核细胞功能调控中起着重要作用。

2.3 GO富集分析及KEGG通路分析

对56个家族性高胆固醇血症患者差异表达的miRNA调控的差异基因进行GO分析，按照统计学差异，主要富集在以下功能：肾上腺素能受体的活动（adrenergic receptor activity）、跨膜受体蛋白酪氨酸磷酸酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine phosphatase activity）、跨膜受体蛋白磷酸酶活性（transmembrane receptor protein phosphatase activity）、蛋白酪氨酸磷酸酶活性（protein tyrosine phosphatase activity）、蛋白激酶C结合（protein kinase C binding）、G蛋白偶联受体活性（G protein⁃coupled amine receptor activity）、磷蛋白质磷酸酶活性（phosphoprotein phosphatase activity）、前列腺素受体的活动（prostaglandin receptor activity）、转化生长因子受体（transforming growth factor beta receptor）、胞质介质活性（cytoplasmic mediator activity）、DNA结合转录抑制活性（DNA⁃binding transcription repressor activity）、 RNA聚合酶Ⅱ特异性（RNA polymerase Ⅱ⁃specific）、白细胞间黏附调节（regulation of leukocyte cell⁃cell adhesion）等（图3）。

对56个家族性高胆固醇血症患者差异表达的miRNA调控的差异基因进行KEGG通路分析，56个基因主要富集在7个通路上：神经活性的受体⁃配体相互作用（neuroactive ligand⁃receptor interaction）、造血细胞谱系（hematopoietic cell lineage）、细胞因子与受体相互作用（cytokine⁃cytokine receptor interaction）、血管平滑肌收缩（vascular smooth muscle contraction）、蛋白质的转运（protein export）、脂肪酸延长（fatty acid elongation）、不饱和脂肪酸的生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）（图4）。

GO及KEGG富集分析发现8个基因（IL7、ADRA1D、ADRA2C、PTGDR、ELOVL4、TGFBR3、CLEC5A、TBX21）涉及细胞因子IL17、肾上腺素能受体、前列腺素受体，超长链不饱和脂肪酸合成基因等与AS相关的生物功能，从生物信息学角度预测了HDL⁃miRNAs调控外周血单核细胞功能影响AS的可能性。

3 讨 论

AS是一种血管病变，其基本特征是LDL、免疫细胞和血管壁细胞以及细胞外基质集聚在血管内皮下，是多种细胞及多种分子参与并相互作用的病理过程。AS发展过程中，损伤的内皮通过分泌细胞因子趋化外周血中单核细胞黏附内皮细胞、迁入内皮下并分化成巨噬细胞促进斑块的发生^［9］。有研究表明，小鼠模型中，交感神经系统紧张性和高胆固醇血症可以使骨髓释放造血干细胞及祖细胞，这些造血干细胞及祖细胞定植在脾脏中，使造血功能明显增加并且向外周血中释放更多的单核细胞^［4］。miRNA是可调控多种基因的非编码RNA，与靶基因结合后经由两种途径负向调控靶基因：其一，miRNA 可与靶基因3’⁃UTR 不完全互补结合，抑制靶基因mRNA 翻译，但不影响其稳定性；其二，miRNA 可与靶基因3’⁃UTR 完全互补结合，引起靶基因mRNA 的切割降解。有研究证实miRNA不仅可以调控自身细胞内的生物功能，还可以通过载体的运输实现细胞间的调控。HDL可以作为载体运输miRNA至靶细胞调控靶细胞功能，而且也证实这些HDL⁃miRNA可能参与AS过程^［7］。本文分析得到19个差异HDL⁃miRNA可能能够调控单核细胞56个差异基因，并进一步分析了差异基因的生物功能，提示HDL⁃miRNA调控单核细胞基因影响其功能的可能性。

许多研究已经证明IL7在AS中的作用。有研究报道了急性冠脉综合征患者血浆IL7水平升高，并且升高的IL7增强了单核细胞以及外周血单个核细胞的炎症细胞因子的表达^［10］；IL7还可以使细胞间的黏附分子和单核细胞趋化因子表达上调，以促进单核细胞的黏附以及迁移^［11］；在apoE基因敲除（apoE⁃/⁃）老鼠模型上沉默IL7的表达，可以降低心肌梗死后AS斑块炎症反应^［12］；IL7的多态性也是冠心病的危险因素^［13］。因此，家族性高胆固醇血症患者HDL⁃miR30⁃IL7调控单核细胞可能影响AS的多个过程。

ADRA1D和ADRA2C是肾上腺去α受体，是属于交感肾上腺素轴。研究表明交感神经系统可以影响单核细胞亚型分化参与加重心肌梗死后AS^［14］。外周血细胞中ADRA2家族的表达被证实与无症状性脑梗密切相关。因此，HDL⁃miR30⁃ADRA可能调控单核细胞参与交感神经系统致AS的过程，也为证明AS是一种心身疾病提供了分子理论依据。

PTGDR在家族性高胆固醇血症外周单核细胞内为低表达，本文通过生物信息学方法预测HDL⁃miR186可以抑制它的表达。PTGDR是前列腺素D2受体，前列腺素是常见的参与炎症过程的细胞因子。研究表明敲除小鼠体内前列腺素D2基因的小鼠主动脉斑块厚度相比于正常值小鼠明显增厚，提示前列腺素D2是抗AS的因子^［15］。研究报道人主动脉斑块内PTGDR基因低表达，说明AS过程中细胞内前列腺素D2信号通路是缺失的^［16］。因此，HDL⁃miR186⁃PTGDR可能调控单核细胞起抗AS作用。

TGFBR3在家族性高胆固醇血症外周单核细胞内是低表达，预测HDL⁃miR186可以抑制它的表达。TGFBR3是TGFβⅢ受体，结合TGFβ调控细胞功能。在AS过程中TGFβ可以调控细胞增殖、迁移和免疫反应等多种功能。研究报道TGFβ可以抑制单核细胞分化为巨噬细胞^［17］。因此，HDL⁃miR186⁃TGFBR3可能调控单核细胞分化功能影响AS。

TBX21是一个转录因子，一方面可以调控细胞发育相关的基因；另一方面可以调控细胞因子的表达。有研究表明在TBX21-/-老鼠体内的深静脉血栓更容易被清除，而且与对照组比较栓子中有促炎作用的Ly6C^hi单核细胞和IL12的表达明显减少。将TBX21-/-老鼠的骨髓移植到TBX+/+老鼠体内后深静脉内血栓溶解速度也加快。抑制TBX21可以减少单核细胞表达IL12，加快深静脉内血栓形成^［18］。AS中急性的血栓形成可以是组织器官急性缺血。因此HDL⁃miR223⁃TBX21可能调控单核细胞参与血栓形成而影响AS斑块的稳定性。

ELOVL4是参与超长链不饱和脂肪酸生物合成的基因，主要在肝脏、脂肪组织以甘油三酯丰富的腺体内（比如皮脂腺和眼睑腺）表达。本文的生物信息学分析发现，ELOVL4在外周血单核细胞内是高表达的。文献报道敲除小鼠体内编码超长链不饱和脂肪酸的ELOVL4可以导致脂质贮积和肥胖^［19］。因此，HDL⁃miR188⁃5p⁃ELOVL4可能调控单核细胞脂质代谢参与AS过程。

CLEC5A，又称MDL⁃1，是一个接受促炎因子的信号受体^［20］。CLEC5A在小鼠的中性粒细胞、单核⁃巨噬细胞、外周血单核细胞以及骨髓祖细胞上表达，特别是在成熟的单核⁃巨噬细胞上明显表达。研究报道CLEC5A主要在AS斑块的巨噬细胞中高表达，与AS斑块早期阶段相关并能促进巨噬细胞的存活^［21］。因此，HDL⁃miR138⁃1^*⁃CLEC5A可能通过调控单核巨噬细胞功能影响AS斑块形成早期阶段。

综上所述，本文通过生物信息学方法，分析GEO芯片数据获得家族性高胆固醇血症患者外周血单核细胞差异基因和HDL差异miRNA，构建差异基因和差异miRNA调控网络，得到19个miRNA和56个基因。通过56个基因的GO和KEGG分析，发现可能与血HDL⁃miRNA改变相关的8个基因有差异表达，这涉及单核细胞的炎症、趋化迁移、分化、及脂质代谢功能的变化，亦可能参与血栓形成过程，揭示了HDL⁃miRNA调控外周血单核细胞基因影响AS的可能机制。因此，通过生物信息学分析，对HDL⁃miRNA通过调控靶细胞参与AS过程有了新的认识，为下一步实验研究AS过程提供了新的方向。

参考文献

[1] Wang H, Naghavi M, Allen C, et al. Global, regional, and national life expectancy, all⁃cause mortality, and cause⁃specific mortality for 249 causes of death, 1980⁃2015: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015 [J]. Lancet, 2016, 388(10053): 1459⁃1544.

[2] Borén J, Williams K J. The central role of arterial retention of cholesterol⁃rich apolipoprotein⁃B⁃containing lipoproteins in the pathogenesis of atherosclerosis: A triumph of simplicity [J]. Curr Opin Lipidol, 2016, 27(5): 473⁃483.

[3] Wolf M P, Hunziker P. Atherosclerosis: Insights into vascular pathobiology and outlook to novel treatments [J]. J Cardiovasc Transl Res, 2020.

[4] Tabas I, Lichtman A H. Monocyte⁃macrophages and T cells in atherosclerosis [J]. Immunity, 2017, 47(4): 621⁃634.

[5] Mosig S, Rennert K, Büttner P, et al. Monocytes of patients with familial hypercholesterolemia show alterations in cholesterol metabolism [J]. BMC Med Genomics, 2008, 1: 60.

[6] Feinberg M W, Moore K J. MicroRNA regulation of atherosclerosis [J]. Circ Res, 2016, 118(4): 703⁃720.

[7] Vickers K C, Palmisano B T, Shoucri B M, et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high⁃density lipoproteins [J]. Nat Cell Biol, 2011, 13(4): 423⁃433.

[8] Raal F J, Hovingh G K, Catapano A L. Familial hypercholesterolemia treatments: Guidelines and new therapies [J]. Atherosclerosis, 2018, 277: 483⁃492.

[9] Chistiakov D A, Melnichenko A A, Myasoedova V A, et al. Mechanisms of foam cell formation in atherosclerosis [J]. J Mol Med, 2017, 95(11): 1153⁃1165.

[10] Damås J K, Wæhre T, Yndestad A, et al. Interleukin⁃7–mediated inflammation in unstable angina [J]. Circulation, 2003, 107(21): 2670⁃2676.

[11] Li R, Antoni P, Ko K W S, et al. Interleukin⁃7 induces recruitment of monocytes/macrophages to endothelium [J]. Eur Heart J, 2012, 33(24): 3114⁃3123.

[12] Mihailovic P M, Lio W M, Yano J, et al. IL⁃7R blockade reduces post⁃myocardial infarction⁃induced atherosclerotic plaque inflammation in ApoE^-/- mice [J]. BB Reports, 2019, 19(19): 100647.

[13] Sun Y X, Yan J F, Zhang J L, et al. Contribution of IL⁃7/7R genetic polymorphisms in coronary heart disease in Chinese Han population [J]. Int Immunopharmacol, 2020, 79: 106084.

[14] Dutta P, Courties G, Wei Y, et al. Myocardial infarction accelerates atherosclerosis [J]. Nature, 2012, 487(7407): 325⁃329.

[15] Tanaka R, Miwa Y, Mou K, et al. Knockout of the l⁃pgds gene aggravates obesity and atherosclerosis in mice [J]. Biochem Bioph Res Co, 2009, 378(4): 851⁃856.

[16] Di Taranto M D, Morgante A, Bracale U M, et al. Altered expression of inflammation⁃related genes in human carotid atherosclerotic plaques [J]. Atherosclerosis, 2012, 220(1): 93⁃101.

[17] Kim J S, Kim J G, Moon M Y, et al. Transforming growth factor⁃beta1 regulates macrophage migration via RhoA [J]. Blood, 2006, 108(6): 1821⁃1829.

[18] Schönfelder T, Brandt M, Kossmann S, et al. Lack of T⁃bet reduces monocytic interleukin⁃12 formation and accelerates thrombus resolution in deep vein thrombosis [J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 3013.

[19] Zadravec D, Brolinson A, Fisher R M, et al. Ablation of the very‐long‐chain fatty acid elongase ELOVL3 in mice leads to constrained lipid storage and resistance to diet‐induced obesity [J]. Faseb J, 2010, 24(11): 4366⁃4377.

[20] Cheng Y L, Lin Y S, Chen C L, et al. Activation of Nrf2 by the dengue virus causes an increase in CLEC5A, which enhances TNF⁃α production by mononuclear phagocytes [J]. Sci Rep, 2016, 6(1): 32000.

[21] Xiong W X, Wang H B, Lu L, et al. The macrophage C⁃type lectin receptor CLEC5A (MDL⁃1) expression is associated with early plaque progression and promotes macrophage survival [J]. J Transl Med, 2017, 15(1): 234.

基金资助

国家自然科学基金面上项目(81670423)