健脾益肺膏主要活性成分的分离鉴定及其含量测定

Separation， identification and determination of main components in Jianpiyifei ointment

摘要

健脾益肺膏是基于中医“五脏相关学说”，结合几十年治疗各种慢性肺病的临床经验总结制作而成的中药制剂。其主要功效药材为黄芪，其他的药材为辅药，起到增强黄芪药效的作用。本文使用各种柱色谱将该药配方中主要成分进行了系统的分离，确定了主要成分的结构。从中分离得到5个主要化合物，通过NMR数据比对，确定了其结构分别为为黄芪甲苷（化合物1）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（化合物2）、β⁃谷甾醇（化合物3）、果糖（化合物4）和葡萄糖（化合物5）；首次测定了其中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，分别为0.014%和0.008 3%。为后续健脾益肺膏的配方改进及剂型优化提供参考依据。

Abstract

The Jianpiyifei ointment is based on the clinical experience of treating various chronic lung diseases in several decades， which is based on the “five viscera related theory” of traditional Chinese medicine. In the formula of Jianpiyifei ointment， Astragalus membranaceus is the monarch medicine and other herbs are the auxiliary medicine， which can enhance the effect of Astragalus membranaceus. In this paper， the main components in the formula were separated systematically by various column chromatography，and the structure of the main components was determined by compared with their NMR. The structures of the five main compounds were determined to be astragaloside Ⅳ （compound 1），calycosin glucoside （compound 2）， β⁃sitosterol （compound 3）， fructose （compound 4） and glucose （compound 5）.And the content of astragaloside Ⅳ and calycosin glucoside in Jianpiyifei ointment were determined for the first time with ultraviolet spectrophotometry. The quality percentage content of two effective components （1） （2） in Jianpiyifei ointment were 0.014% and 0.008 3% respectively， which provides reference for the following formula improvement and dosage form optimization of Jianpiyifei ointment.

Graphical abstract

关键词

健脾益肺膏 / 黄芪甲苷 / 毛蕊异黄酮葡萄糖苷

Key words

Jianpiyifei ointment / astragaloside Ⅳ / calycosin glucoside

0 引 言

古往今来，既能健脾祛湿，又能益气保肺是一种很特殊的治疗方法，中医称之为“培土生金”^［1］。培土生金即补脾益肺，借五行相生的理论，用补脾益气的方药补益肺气。在这种理论指导下，涌现了一些经典良方，历代医家以参苓白术散、麦门冬汤为培土生金法之代表方。后世施其法而不泥其方并有所拓展，将黄芪建中汤、沙参麦冬汤、六君子汤、炙甘草汤、补中益气汤等也列入其中^［2，3］。

健脾益肺膏是基于中医“五脏相关学说”^［4］，结合几十余年治疗各种慢性肺病的临床经验总结制作而成，多为中西医医院研发配置的中药膏剂。健脾益肺膏是由黄芪、甘草、人参、陈皮、白术、茯苓、山药、桑白皮等多味中药组成。其中黄芪味甘微温，补肺脾之气，为君药；白术益气健脾，升提阳气，助脾运化，为臣药。近年来，传统中药膏剂治疗各类疾病的研究受到越来越多的重视。用健脾益肺膏剂治疗哮喘^［5］、肺部疾病^［6，7］、呼吸道疾病^［8，9］、糖尿病^［10］等疾病取得了一定的成效。由于其延缓病症的效果好、副作用小，我国很多中医/中西医医院、甚至西医均有使用健脾益肺法来治疗疾病的现象，有的制成膏剂^［11］，有的为汤剂^{［12，13］}，还有健脾益肺颗粒^［14］和口服液^［5，15］等。2019年底新冠肺炎疫情在世界范围内扩散，我国在此次疫情中取得的成功离不开传统中医的贡献，中医药作为一项重要的治疗方案在全国抗疫一线使用。新型冠状病毒感染的肺炎属风寒湿疫，在病患恢复期时邪去正虚，应以健脾益肺法为主进行治疗，使用相关药物可帮助病人痊愈^［16］。

药理研究表明，益肺健脾中药具有增强机体免疫功能、抗变态反应、抗菌、抗病毒、抗菌、抗纤维化、增强肾上腺皮质功能等功效。如治疗哮喘等呼吸道疾病时，多使用黄芪、党参、甘草等中药材^{［5，8，17］}，能增强组织的修复，提高免疫功能，从而达到减少呼吸道感染次数，降低哮喘患者气道高反应性，减轻发病程度及缩短病程的目的 ^{［18，19］}；治疗糖尿病时，多用黄芪、白术、太子参等药材，通过补脾益肺气可以促进胰岛素分泌或增加机体组织对胰岛素的敏感性^［20］；治疗肺癌时，多用黄芪、太子参、白花蛇舌草等中药材，可以显著提高患者生存质量，黄芪等药物具有减轻化疗引起的造血功能损害，具有增效减毒的作用^［21］。

黄芪为豆科（Leguminosae）植物蒙古黄芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. var. Mongholicus （Bge.） Hsiao）或膜荚黄芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bunge）的干燥根，具有补气固表、利尿、强心、降压、抗菌、托毒、排脓、生肌、加强毛细血管抵抗力、止汗和类性激素的功效，治表虚自汗、气虚内伤、脾虚泄泻、浮肿及痈疽等^［22］。黄芪的化学成分复杂，主要含皂苷类、黄酮类、多糖类及氨基酸类等几大类，其中又以黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为主^［23］。根据2018版中国药典规定，黄芪含量检测的标准为黄芪甲苷（C₄₁H₆₈O₁₄）不得少于0.040%；含毛蕊异黄酮葡萄糖苷（C₂₂H₂₂O₁₀）不得少于0.020%^［24］。

目前，国内对此中药方剂的使用并没有统一的标准，医生根据实际情况用药，而药材因不同采摘季节、不同产地^［25］，其主要成分的含量也有所不同，导致方剂的治疗效果存在差异，容易造成用药过程中出现误差；并且也没有对方剂中的主要成分进行分离纯化及含量测定，对制药前后主成分含量进行比较，无法判断经过配置是否能够加强主要成分的功效或抑制其毒性，以便将其配方和配置工艺标准化。该药剂涉及的原材料来源、适用病症的种类、医生处置的理念、制作工艺等可变因素，导致药剂的实际配方以及有效成分含量或比例存在显著差异。如何让中医药针对不同病症的配方和配置工艺达到规范化或标准化，是一项重要挑战。本文以健脾益肺膏为例，以河北省沧州中西医结合医院研发配置的健脾益肺膏为研究对象，首次采用提取及柱色谱分离方法对其主要成分进行了分离纯化，通过检测其主要活性成分黄芪甲苷和毛蕊异黄酮的含量及其与配伍之间的关系，为传统中药的规范化和标准化配置及其与适应症之间的关系研究，以及为进一步开发中药材资源及其规范化利用提供有益的数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

健脾益肺膏由河北省沧州中西医结合医院制剂科配制和提供，由25味中药配制，其配方包括黄芪30 g、太子参10 g、茯苓15 g、白术15 g、陈皮10 g、桔梗10 g、升麻6 g、桑白皮15 g、甘草6 g等中药材，采用的批号为20191221、20191222和20191223，其中黄芪的百分含量为25.64%；对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷购置于中国生物制品检定研究院，纯度大于98%、黄芪甲苷购置于中国生物制品检定研究院，纯度大于98%。

1.2 仪器与试剂

电子天平（XP603S，瑞士梅特勒·托利多中国公司）；数显恒温水浴锅（HH⁃6，常州普天仪器制造有限公司）；数控超声波清洗器（KQ⁃600DE，昆山市仪器有限公司）；旋转蒸发仪（N‐1100V‐W/WD型，东京理化器械株式会社）；薄层色谱用硅胶和柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂产品）；Sephadex LH⁃20（Pharmacia公司）；HPLC（LH⁃9100，JAI）；所用试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 样品的提取

取健脾益肺膏300 g于圆底烧瓶，加入 250 mL甲醇，加热回流提取2.5 h，静置冷却，过滤，减压浓缩，反复3次，得到干燥的提取物浸膏31 g。

2.2 活性化学物的分离

取2.1步骤中的浸膏（30 g）用甲醇溶解，拌200~300目硅胶（120 g），挥干甲醇后进行干柱色谱分离，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯及甲醇洗脱，浓缩得4个不同极性部分。醋酸乙酯部分再次进行硅胶柱色谱，用氯仿⁃甲醇梯度洗脱，得到流份Fr.1~Fr.9，其中Fr.3流份挥干溶剂的过程中，析出白色针晶，得到化合物3；Fr.5再经过SephadexLH⁃20柱色谱（V_氯仿∶V_甲醇=1∶1）纯化，得到化合物1；Fr.7经Sephadex LH⁃20（V_氯仿∶V_甲醇=1∶1）和HPLC（V_甲醇∶V_水=1∶1）反复柱色谱分离，得到化合物2；Fr.9继续进行HPLC（V_甲醇∶V_水=1∶4）柱色谱分离，得到的流份挥干溶剂，分别得到白色晶体，分别为化合物4和化合物5。流程见图1，结构见图2。

2.3 样品中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖的含量测定

2.3.1 标准品的配置及含量计算公式

精密称取黄芪甲苷标准品10 mg，用50%的乙醇水溶液配制成25 mL溶液。分别吸取黄芪甲苷标准品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL至25 mL容量瓶中，依次加入蒸馏水6.0，5.5，5.0，4.5，4.0，3.5，3.0 mL，摇匀后，在203 nm处测定吸收度，绘制标准曲线^［26~29］。以吸光度为纵坐标、黄芪甲苷质量浓度为横坐标绘制标准曲线，所得标准曲线。回归方程为A=-0.040 2+0.010 37C，r=0.998 9，其中A为吸光度、C为浓度。黄芪甲苷质量浓度在10~50 mg/L内具有良好的线性关系。

精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖标准品10 mg，用50%的乙醇水溶液配制成25mL溶液。分别吸取毛蕊异黄酮葡萄糖标准品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL至25 mL容量瓶中，依次加入蒸馏水6.0，5.5，5.0，4.5，4.0，3.5，3.0 mL，摇匀后，在260nm处测定吸收度，绘制标准曲线^［30~32］。以吸光度为纵坐标，毛蕊异黄酮葡萄糖质量浓度为横坐标绘制标准曲线，所得标准曲线。回归方程为A=0.063 2+12.634C，r=0.999 7，其中A为吸光度、C为浓度。毛蕊异黄酮葡萄糖质量浓度在10~50 mg/L内具有良好的线性关系。

2.3.2 样品溶液的配置和含量计算

精确称取2.1步骤中的浸膏10 mg，用50%的乙醇水溶液配制成25 mL溶液，待测。

健脾益肺膏中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖成分含量的计算公式为：

含量（%）=\frac{C\times n\times V}{\mathrm{1}\mathrm{000}\times M}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

在该式中，黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖的质量浓度为C（mg/mL），滤液稀释倍数为n，溶液体积为V（mL），健脾益肺膏质量为M（g）。

3 结果分析

3.1 结构鉴定

化合物1：白色固体。m.p.>300 ℃。ESI⁃MS m/z： 808.0 ［M＋Na］⁺。¹H⁃NMR （600MHz， C₅D₅N） δ： 0.95 （3H， s， CH₃）， 1.31 （3H， s， CH₃）， 1.31 （3H， s， CH₃）， 1.39 （3H， s， CH₃）， 1.43 （3H， s， CH₃）， 1.60 （3H， s， CH₃）， 2.05 （3H， s， CH₃）， 0.60 （1H， d， J=3.6 Hz， H⁃19b）， 0.22 （1H， d， J=3.6 Hz， H⁃19a）， 4.92 （1H， d， J=7.8 Hz， Glc⁃H⁃1″）， 4.87 （1H， d， J=7.4 Hz， Xyl⁃H⁃1′）， 3.12~3.75（11H， overlapped， Glc/Xyl⁃H⁃2″， 3″， 4″， 5″， 6″ ）。以上数据与文献报道基本一致^［33］，因此鉴定化合物1为黄芪甲苷。

化合物2：白色固体。m.p. 221~222 ℃。ESI⁃MS m/z： 469.5 ［M＋Na］⁺。¹H NMR （600 MHz， DMSO⁃d₆） δ： 8.27 （1H， s， H⁃2）， 7.93 （1H， d， J=8.6 Hz， H⁃5）， 7.01 （1H， s， H⁃2′）， 6.92 （3H， overlapped， H⁃5′， 6， 6′）， 6.80 （1H， s， H⁃8）， 3.74 （3H， s， -OCH₃）， 5.01 （1H， m， Glc⁃H⁃1″）， 3.62（1H， m， Glc⁃H⁃6″a）， 3.43 （1H， overlapped， Glc⁃H⁃6″b）， 3.38 （1H， overlapped， Glc⁃H⁃5″）， 3.21 （2H， m， Glc⁃H⁃2″， 3″）， 3.15 （1H， m， Glc⁃H⁃4″）， 9.03 （1H， s， 3′-OH）。以上数据与文献报道基本一致^［34］，因此鉴定化合物2为毛蕊异黄酮葡萄糖苷。

化合物3：白色针晶。经过与三个不同溶剂系统薄层硅胶色谱的对照品对照，Rf值一致，混合后熔点不下降，故确定其为β⁃谷甾醇。

化合物4：白色晶体。经过与三个不同溶剂系统薄层硅胶色谱的对照品对照，Rf值一致，混合后熔点不下降，确定其为果糖。

化合物5：白色针晶。经过与三个不同溶剂系统薄层硅胶色谱的对照品对照，Rf值一致，混合后熔点不下降，确定其为葡萄糖。

3.2 健脾益肺膏中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷成分含量

将测得的样品溶液的吸光度带入2.3.2的公式中，得到黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷成分质量百分含量分别为0.014%和0.008 3%。本文采用了3个批次，具体数据见表1。

4 讨 论

健脾益肺法在现代临床医学中治疗各种肺部疾病，其配置成的剂型中各种药材的比例对方剂的治疗效果至关重要，而各种药材中的主要成分又是其发挥疗效的根本。本文的研究对象健脾益肺膏就是用健脾益肺法制作的临床使用的膏剂， 黄芪为其主要的配方药材，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功能。现代研究发现，黄芪含有多种三萜皂甙、黄酮、多糖，以及氨基酸、亚油酸、生物碱、胆碱等复杂的化学成分。其中，黄芪甲苷和毛蕊异黄酮又是黄芪中含量较高的主要功效成分^{［35，36］}，黄芪甲苷的含量更是黄芪药材质量检测的指标成分，因此它们的含量对此方剂的功效起到关键作用。

目前为止，国内未见关于健脾益肺法/健脾益肺膏中成分分离鉴定或含量测定方面的研究，本实验首次通过系统分离的方法从健脾益肺膏中分离得到了5种含量较高的主要成分，经过核磁数据和薄层色谱的比对确定为黄芪甲苷（化合物1），毛蕊异黄酮葡萄糖苷（化合物2），β⁃谷甾醇（化合物3），果糖（化合物4），葡萄糖（化合物5），其中黄芪药材中的主要成分黄芪甲苷（化合物1）和毛蕊异黄酮葡萄糖苷（化合物2）确实为此配方中含量较高的主要功效成分；并首次采用紫外吸收分光光度的方法，对健脾益肺膏中方中之重黄芪的主要成分黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行了含量测定，确定其质量百分含量分别为0.014%和0.008 3%。根据中外药典中对黄芪质量标准的记载^［36］，黄芪中黄芪甲苷的含量测定不得少于0.040%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷不得少于0.020%。本研究中的健脾益肺膏其主要药材黄芪的质量百分含量为25.64%，测量得到黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷成分质量百分含量分别为0.014%和0.008 3%，说明这两种有效成分符合且略高于2015版《中国药典》中的规定含量^［37］。导致差异的原因可能为原材料的差异、配置过程导致损失或有效成分更容易释放出来等。有研究表明，当归补血汤中黄芪和当归合煎时黄芪甲苷含量高于黄芪单煎时的黄芪甲苷含量，这可能是因为当归中的化学成分具有助溶性，使黄芪甲苷的溶出量增加^［38］。因此黄芪与当归配伍，有利于有效成分黄芪甲苷的溶出，这为传统的配伍理论提供了一定的科学依据。配置过程也会对有效成分的含量产生影响，如对化胃舒颗粒的制备方法研究中发现^［39］，采用氨试液洗涤、加热破乳及避免与酸性药材共同提取可使黄芪甲苷含量增加，可见黄芪甲苷在酸性条件下的水解受pH影响。这些差异的存在，说明中药制剂在加工制作过程中会带来偏差。

由于临床医生在进行配方时，药材中主要成分的含量会随着采摘条件的不同、药剂配伍的影响、加工制备方法的差异等因素，从而影响方剂的治疗效果。而目前我国对中药方剂的质量控制标准并不完善，甚至有些方剂还没有评价标准；本文通过健脾益肺膏中主要活性成分的含量测定，从更微观的角度，为以后评价、控制此方剂的质量提供了参考的依据从而促进药剂配置和工艺的规范化或标准化的推进。

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基金资助

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