猪脂肪干细胞的特点及其应用

Characteristics and application of porcine adipose⁃derived stem cells

摘要

脂肪干细胞(adipose⁃derived stem cells，ADSCs) 是从脂肪组织中分离得到的一种具有多元分化潜能的干细胞，且脂肪组织在人体内的储量丰富，取材简单。因此，人源脂肪干细胞(human adipose⁃derived stem cells，hADSCs) 具有良好的应用前景，如干细胞治疗、再生以及药物研发等。然而，要将这些基础研究成果应用于临床，必须通过临床前的安全性、可行性和潜在的风险评估。而在实验动物中，猪与人类在解剖学、遗传学和生理学上非常相似，因此猪脂肪干细胞(porcine adipose⁃derived stem cells，pADSCs) 的相关研究对人脂肪干细胞走向临床应用具有重要的理论及实践意义。基于猪脂肪干细胞的重要作用，本文综述了猪脂肪干细胞的分离、培养、免疫表型、分化能力及应用前景。

Abstract

Adipose⁃derived stem cells (ADSCs) isolated from adipose tissue are reliable adult stem cells owning broad differentiation abilities, and have the advantage of being an abundant and easily attainable cell source.Thus, human adipose⁃derived stem cells (hADSCs) have good application prospects, such as stem cell therapy, regeneration, and drug development. However, in order to apply these basic research results to the clinic,it requires first to pass the pre⁃clinical safety, feasibility and potential risk assessment in animals. In laboratory animals, pigs and humans are very similar in anatomy, genetics, and physiology. Therefore, the related knowledge of porcine adipose⁃derived stem cells (pADSCs) has important theoretical and practical significance for clinical application of hADSCs. So, we briefly summarize the current findings about the isolation, culture, immunophenotype, differentiation ability and application prospects of pADSCs.

关键词

猪脂肪干细胞 / 免疫表型 / 分化能力 / 白色脂肪细胞 / 棕色脂肪细胞 / 临床前应用

Key words

porcine adipose⁃derived stem cell / immunophenotype / differentiation ability / white adipocyte / brown adipocyte / pre⁃clinical application

0 引 言

自二十世纪60年代首次从小鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞(adipose⁃derived stem cells，ADSCs)^[1]以来，医学界和公众对脂肪组织的关注度越来越高。与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)类似，ADSCs是一种从脂肪组织中分离出来的成体干细胞^[2]。2017年，世界经济合作与发展组织(organization for economic co-operation and development，OECD) 对全球肥胖人数进行了调查，在美国、墨西哥、新西兰和匈牙利，成年人的肥胖率均超过30%，且其他发达国家也都存在不同程度的肥胖问题。在发展中国家，肥胖问题虽没发达国家严重，但超重人数也在不断增加。肥胖人数的增加致使医学减肥的案例增多，很多人通过抽脂手术减肥。因此，出现了越来越多的医疗废弃脂肪，而这些脂肪组织吸引了整形外科医生和其他研究人员的关注，并对这一来源丰富和易获得的细胞开展了一系列研究。

脂肪组织来源的细胞群作为一种新的治疗资源在全球范围内引起了一个新研究领域和产业的发展。然而，在学术界对脂肪组织来源细胞群体的认知有限，存在很多细胞名称混用的情况。2013年国际脂肪移植与脂肪干细胞治疗(International Federation of Adipose Therapeutics and Sciences，IFATS) 和国际细胞治疗学会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)联合发表声明，对脂肪来源的血管基质组分(stromal vascular fraction，SVF)和人脂肪干细胞(human adipose⁃derived stem cells，hADSCs)给出了明确的定义。脂肪组织经物理切碎、酶消化、中和、洗涤后离心去除成熟脂肪细胞，得到的沉淀细胞便是脂肪组织分离的血管基质细胞 (SVF)。而分离出来的 SVF 经培养、贴壁、传代纯化后便得到了hADSCs，这些干细胞与其他组织来源的间充质干细胞表达相同的表面标记物 (CD90+，CD73+，CD105+，CD44+及CD45-，CD31-)^[3]。SVF中有丰富的ADSCs以及成纤维细胞、免疫细胞和血管相关细胞等^[4~6]。SVF在体外培养过程中，成纤维细胞、免疫细胞和血管相关细胞的含量逐渐减少，最终得到纯ADSCs。SVF细胞和hADSCs细胞最主要区别是CD45在SVF中高表达，而在hADSCs中较低或检测不到^[7]。

鼠一直作为研究人类疾病的动物模型，但有研究发现，鼠与人对肥胖和炎症相关细胞因子的应答具有差异^[8]，因此在研究肥胖介导的疾病方面，鼠并不能作为很好的动物模型。猪与人类具有相似的代谢功能、心血管系统以及成比例的器官大小^[9]，且猪自身有足够厚的脂肪层，不需要混合不同层或不同动物的脂肪组织，也能得到足够多的脂肪细胞进行研究。因此科研人员更倾向使用猪作为研究人类能量代谢和肥胖的动物模型。鉴于pADSCs的重要作用，因此本文将围绕pADSCs的相关特征进行综述。

1 猪脂肪干细胞的分离、培养及特征

通常选择从猪背部和腹部的皮下脂肪组织中获得pADSCs，而其他部位的白色脂肪组织也能分离得到pADSCs。从颊脂垫中能分离出pADSCs，且其特征与从皮下肩胛间区获得的pADSCs相似^[10]。分离脂肪干细胞最常用的方法是：将脂肪组织从猪特定部位取出，剪碎后在37 ℃下用酶(胶原酶、中性蛋白酶酶、胰蛋白酶或其他相关酶)充分消化(通常是30 min~1 h)，消化好的组织碎片经过滤，离心后去除上清中的成熟脂肪细胞，沉淀则为SVF。之后重悬沉淀，铺板(铺板密度通常为每平方厘米5 000~7 000个细胞)培养。研究显示，将Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)与Ham’s F⁃12培养基按1∶1的体积比例配制再加入10%的血清是分离pADSCs的最佳培养基配方^[11,12]。培养48~72 h后，PBS清洗2~3遍，换液去除非贴壁细胞，贴壁的细胞即pADSCs，此时细胞呈梭形，形态与成纤维细胞相似^[13,14]。此过程会去除基质组分中大部分的造血细胞^[3]。通常1 mL的脂肪组织可以分离得到(0.5~1)×10⁶个贴壁存活的细胞^[15]，获得的细胞数量受猪的年龄^[16,17]及健康状态影响。pADSCs来源于SVF亚群细胞，它的细胞类型数量比SVF少，所以本质上来说pADSCs在细胞组成上较SVF相对均质，但都由多种类型的细胞组成，且随着培养代次的增加细胞类型会减少。

pADSCs在60~80 h内即可完成一次细胞周期^[11,15,18]。研究显示这些细胞经30~40代培养后也不会出现细胞衰老的迹象^[11,18]。而液氮保存对pADSCs细胞的活性，细胞表面标志物的表达及分化能力均无影响^[19]。细胞贴壁后，即使不更换分化培养基，原代脂肪干细胞也会出现程度不高的自动分化情况^[20]。

IFATS和ISCT联合声明中建议通过流式细胞术来检测多色荧光标记抗体组合来判断hADSCs，推荐鉴定的阳性表达标记物有：CD13，CD29，CD44，CD73，CD90，CD105(>80%)；推荐的阴性标记物有：CD31，CD45，CD235a (<2%)；CD34的表达也呈阴性，但不同细胞系检测出的CD34阴性百分比差异较大。除了以上鉴定指标外，还可以检测高表达蛋白（CD10，CD26，CD36，CD49d，CD146，CD49e）以及低表达或不表达的表面标记物（CD3，CD11b，CD49f，CD106，PODXL）。目前学术界对鉴定pADSCs的表面标记物没有统一的标准，市面上猪特异性抗体有限，且猪表面抗原不与其他物种的抗体发生交叉反应，使得流式细胞术鉴定pADSCs表面标记物存在困难。使用有限的pADSCs抗体进行鉴定，发现pADSCs与hADSCs存在相似的表面标记物^[21]。因此除使用联合声明中提到的hADSCs表面标记物外，还可采用其他表面标记物的组合来鉴定pADSCs，使用细胞表面标记物CD29，CD44，CD90，MHC I (or HLA I)呈阳性，CD4a，CD31，CD45，MHC II (or HLA II)呈阴性^[22]；使用CD44，CD90，CD105呈阳性，CD45呈阴性^[23]；使用CD29，CD44，CD90呈阳性，CD45，CD8a，HLA⁃DR呈阴性来检测pADSCs特性^[24]。

2 猪脂肪干细胞的分化

2.1 向白色脂肪细胞分化

白色脂肪细胞形态为单泡脂肪细胞，巨大的单泡脂滴占据了脂肪细胞的大部分，细胞质被挤到细胞的边缘，脂滴的边界靠近内质网和线粒体，细胞核被挤到周边，形成“半月”形^[25,26]。细胞质内的细胞器比较少，甘油三酯(TAG)和胆固醇酯(CE)构成胞内脂滴的主要成分，并由磷脂单层包裹与其他细胞器分离^[27]。体外培养ADSCs向白色脂肪细胞分化，最有可能再现体内脂肪组织发育中的成脂过程。破译脂肪生成和脂肪生成过程的转录调控，可能为治疗肥胖或糖尿病提供理论基础^[28,29]。已有大量实验对pADSCs分化为白色脂肪的过程进行探索。

体外诱导白色脂肪细胞分化试验的配方组成主要包含有3⁃异丁基⁃1甲基黄嘌呤(isobutyl⁃methylxanthine，IBMX)，地塞米松(dexamethasone，DXMS)，胰岛素，罗格列酮。不同的诱导试剂配方的培养基都能使猪脂肪干细胞向白色脂肪细胞分化，如张罕星等^[13]分离培养了7日龄三元杂(杜×长×大)分离的肌内和皮下ADSCs，在细胞贴壁后，更换为含有850 nmol/L胰岛素和50 nmol/L DXMS的完全培养基进行诱导。诱导分化6天后用油红O染色，可见细胞已分化为成熟脂肪细胞。分离获得2日龄长白猪与荣昌猪的杂交仔猪皮下脂肪组织中的pASCs，使用三种不同的分化培养基诱导其成脂分化，通过油红O染色和PPARα、PPARγ基因的表达量对脂肪细胞中脂滴分化速度进行比较^[30]。发现分化培养基(DM)（DMEM/F12基础培养基+10%胎牛血清(FBS)+100 IU/mL青霉素+100 mg/mL链霉素+50 nmol/L胰岛素+100 nmol/L DXMS+0.25 mmol/L IBMX+100 nmol/L罗格列酮）是三种分化培养基中使脂肪细胞成脂速度最快的培养基。从7日龄关中黑猪皮下脂肪组织分离出pADSCs并进行诱导分化，在生长培养基(GM)(DMEM/F12基础培养基+10%FBS+100 IU/mL青霉素+100 mg/mL链霉素)中添加0.5 mmol/L IBMX、1.0 μmol/L DXMS、1 μg/mL胰岛素培养2 d，之后更换添加1 μg/mL 胰岛素的GM再培养2 d，最后换成GM，每隔2 d天换一次液。第8 d时的PPARγ mRNA的表达量比培养初期高40倍，且细胞内有油红O染色的脂滴，确认细胞已分化为成熟脂肪细胞^[31]。从5日龄的从江香猪分离皮下ADSCs和肌内ADSCs，待细胞长至一定程度，更换为添加5 μg/mL胰岛素、1 μmol/L DXMS和0.5 mmol/L IBMX的GM培养基培养72 h，之后换为添加1 μg/mL胰岛素的GM培养基，每隔2 d换一次液，诱导分化第6 d的细胞进行油红O染色，可见有大量成熟脂肪细胞分化产生^[32,33]。

2.2 向棕色脂肪细胞分化

棕色脂肪细胞体积较白色脂肪小，且细胞质中也有油滴，但是小且分散，并有大量的线粒体，圆形细胞核位于细胞中央。它们具有产热和调控体内能量平衡等相关过程的能力^[34,35]。人类的棕色脂肪在出生后逐渐消失，而目前未发现猪体内存在棕色脂肪，这使得猪的棕色脂肪研究成果对人的相关研究更有参考价值。

体外诱导棕色脂肪细胞的配方组成主要包含：IBMX，DXMS，胰岛素，罗格列酮，生物素，泛酸，三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine，T3),吲哚美辛。不同动物来源ADSCs分化通常采用不同的诱导配方，即使同一物种，不同实验也可采用不同配方诱导出棕色脂肪细胞。在三元杂(杜×长×大)仔猪的皮下脂肪组织中分离得到pADSCs，细胞长满后，换成分化培养基DM(在DMEM/F12里添加10%FBS，1.7 μmol/L胰岛素,1 μmol/L DXMS，1 μmol/L罗格列酮，17 μmol/L泛酸，33 mmol/L生物素和1 nmol/L T3)继续培养9 d。之后使用150 μmol/L硬脂酸(stearic acids，STA)处理24 h，10 μmol/L去甲肾上腺素(NE)处理4 h，发现代谢相关基因PGC⁃1α的表达量显著提高。单独使用10 μmol/L的β1肾上腺素能受体激动剂处理4 h，分化细胞中UCP1和PGC⁃1α mRNA的表达量也显著上升^[36]。

除体外诱导培养以外，冷暴露也会诱发猪白色脂肪棕色化，并诱导皮下脂肪中UCP3蛋白的表达增加，分化后细胞内的棕色脂肪标记基因Dio2、PGC⁃1α、Cidea mRNA高表达，白色脂肪标记基因Rb1和Tcf21低表达^[37]。在敲除MSTN基因的梅山猪脂肪组织中，PGC⁃1α、PRDM16和Cidea mRNA的表达量显著高于野生型猪，即MSTN敲除后加强了猪皮下脂肪棕色化趋势^[38]。在pADSCs中联合高表达小鼠UCP1和猪PGC⁃1α基因，能使pADSCs获得解偶联呼吸作用，提高了棕色和米色脂肪组织标记基因Lhx8、Zic1、Cidea、PDK4的mRNA水平。与在pADSCs中单独高表达猪PGC⁃1α基因相比，联合高表达猪PGC⁃1α和小鼠UCP1基因降低了Lhx8的mRNA水平，但提高了Cidea、CD137和SLC27a1的mRNA水平，这些结果表明，猪PGC⁃1α和小鼠UCP1的联合高表达诱导了pADSCs的棕色化^[39]。

2.3 分化为其他细胞的能力

pADSCs具有脂肪干细胞的基础能力，即成脂、成骨以及成软骨分化^[3,40,41]，而添加不同分化培养基，还可使pADSCs向肌细胞、肝细胞和神经元等分化，且pADSCs可被重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)^[21]。pADSCs在5%的马血清和2 μL氢化可的松(LGC)的DMEM⁃High Glucose培养基诱导下，pADSCs分化为成肌细胞。肌源性分化后，pADSCs形成类似于肌纤维的平行紧密排列的群，在许多细胞中检测到存在多个细胞核^[42]。此外，培养基中隔日添加维甲酸，可使细胞向心源性分化。分化19 d后,可用免疫荧光的方法标记α⁃肌节肌动蛋白、肌生成素、肌肉转录调节因子1、结蛋白、心肌蛋白和GATA⁃6等因子。利用强力霉素(DOX)介导的慢病毒载体过表达OSKM(Oct4, Sox2, Klf4, c⁃Myc)因子，可将pADSCs转化为iPSCs，进而作为体细胞核移植的供体细胞^[43]。pADSCs分化成肝细胞后，CD105表达明显下降，细胞呈典型的多边形肝细胞的形态^[44]。对pADSCs向神经元样细胞进行诱导分化，诱导3小时后pADSCs胞质开始向细胞核收缩，形成收缩的胞体，胞质延长，20小时后，细胞体逐渐呈球形，有多个细胞突起，呈神经元样^[45]。从9日龄雄性仔猪背部皮下脂肪的SVF中分离出pADSCs，并将其置于壳聚糖涂层板上诱导分化^[46]。这一步骤促进了pADSCs向胰岛样簇(PILC)的分化，且表达胰腺和十二指肠同源盒(PDX⁃1)、胰岛素基因增强蛋白(ISL⁃1)和胰岛素。将pADSCs与小鼠C2C12细胞联合培养后，pADSCs与成肌细胞融合并形成肌管，证明pADSCs具有分化成肌的潜能，表明在再生医学上可用pADSCs对肌肉损伤组织进行修复^[47]。从约克郡猪的皮下脂肪组织以及耳、气管软骨分别得到pADSCs和软骨细胞，之后将培养到第二代pADSCs和第一代软骨细胞进行共培养，在不使用外源生长因子的条件下，pADSCs可直接分化为软骨细胞^[48]。

3 猪脂肪干细胞的临床前应用

ADSCs具有易获得、数量多的独特优势，在干细胞移植和再生医学资源方向非常有前景。在现有的脂肪干细胞来源中，pADSCs因猪与人在生理学上具有极高的相似性以及即将推出的人源化猪模型而备受关注。而临床前的动物研究是将细胞移植或组织工程技术从实验室转移到临床应用的关键步骤。

3.1 再生医学应用

使用pADSCs在再生医学方面已有多种研究，如在先天性括约肌缺乏的猪模型中，使用猪自体脂肪组织中提取的SVF直接注入尿道损伤边缘后，尿道表面的损伤显著减轻，尿道表面肌肉显著增加，改善了尿道的愈合^[49]。皮肤的创面愈合是目前再生医学的一大挑战，因猪源脂肪干细胞的优势，许多研究利用pADSCs对创面愈合进行临床前的实验。将pADSCs注射到皮肤伤口后，发现伤口的外观明显改善，且在显微镜下发现伤口再上皮化的速度加快^[50]。将pADSCs注入皮肤真皮层能使快速扩张组织上覆的皮肤扩增速度加快，并发现扩增皮肤中的血管内皮生长因子和表皮生长因子的表达较高，胶原纤维密度也较高，表明pADSCs能通过提高皮肤扩张效率，避免皮肤组织受到破坏^[51]。用pADSC对猪糖尿病创面治疗后，伤口处血管生成显著增加，同时分析炎症因子的mRNA和蛋白质含量，其炎症反应减弱，表示pADSC能调节炎症反应并促进猪糖尿病创面的愈合^[52]。

此外，机体受到局部辐射会对辐射组织或皮肤造成损伤，产生炎症，以及肌肉纤维化。在研究pADSCs治疗唾液腺辐射损伤的作用中发现，小型猪唾液腺内移植自体的pADSCs能增加唾液流速和唾液淀粉酶的产生，且微血管的密度明显增加，表明使用pADSCs治疗辐射损伤具有一定的作用^[53]。在皮肤辐射综合症模型的小型猪皮下注射pADSCs后，增加了IL⁃10和TGF⁃β的含量，促进了皮肤辐射综合症的皮肤伤口愈合^[54]。

3.2 器官/组织修复应用

研究者还利用脂肪干细胞的多向分化的能力，进行器官或组织修复的研究。在研究急性肝功能衰竭猪模型的pADSCs和普通猪的pADSCs的细胞形态和功能差异中发现，急性肝功能衰竭不影响自体脂肪干细胞的特性和细胞活性；与普通猪的pADSCs相比，急性肝功能衰竭猪的pADSCs内的肝脏特异性基因的表达被增强，表明可使用自体脂肪干细胞作为修复急性肝功能衰竭的资源^[55]。肝脏缺血再灌注(I/R)是肝脏手术后的并发症，将pADSCs移植到肝切除猪模型后，通过减少氧化应激和抑制自噬明显减轻了肝细胞的凋亡，减轻了因I/R和肝切除引起的肝损伤^[56,57]。pADSCs在体外可分化为骨骼，并能准确复制面部骨骼的解剖结构，成功修复了尤卡坦小型猪的下巴，这对于先天性缺陷、外伤等需要进行骨骼修复方面有非常重大的意义^[58]。

在巴马小型猪的心梗模型中注射pADSCs，发现左心室室壁显著增厚，同时其分泌的细胞因子增加了损伤区域的血管生成，抑制了心肌细胞的坏死^[59]。将pADSCs经心肌内移植于猪心肌梗死的心脏中，左心室射血分数升高，容积减少^[60]。而在猪冠状动脉内注射异体pADSCs，同样改善了猪急性心肌梗死的心肌血流灌注，但未发现左心室射血分数与容积的变化^[61]。在使用海绵阻断左回旋动脉诱导猪心肌梗死之后，将pADSCs移植至心肌内，增加了损伤部位的血管数量和血流速度，刺激了组织血流灌注和未成熟胶原纤维的积累，减轻了心肌梗死后心脏的变形^[62]。将pADSCs和心肌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)联合应用，注入梗死边缘区的心肌内，明显发现损伤区域的血管数量增加、纤维化的程度降低以及梗死面积显著缩小，同时对功能进行测评，发现左心室射血分数增加^[63]。

3.3 其他应用

将小型猪的pADSCs和从pADSCs培养基中分离得到的外泌体联用来治疗大鼠急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)，脑磁共振成像及转角试验显示，联用治疗减少了脑栓塞的区域，增强了神经功能的恢复^[64]。将猪成熟脂肪细胞和pADSCs混合注入自体的右眼睑中，观察到表皮细胞、小动脉密度和胶原含量等增加，并发现皮肤质量显著改善，表明pADSCs对皮肤产生了积极作用^[65]。以上研究结果表明，使用pADSCs能够治疗某些疾病模型，这些成果可为之后的临床应用提供理论基础。

4 小 结

由于猪与人类在解剖学、遗传学和生理学上非常相似，科研人员将猪作为研究人类能量代谢和肥胖的动物模型，来设计治疗疾病的方案。这些科研成果有助于研究者运用到人类疾病的预防、干预技术和策略中，以此缓和人类的危机。猪脂肪干细胞因其来源广泛，储备充足的优点，在研究干细胞方面，有极大的优势，而脂肪干细胞的多重分化特征，更为治疗多种疾病带来曙光。

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基金资助

国家自然科学青年基金(31702088)

国家科技重大专项课题(2018ZX0800926B)

广东省动物分子设计与精准育种重点实验室(2019B030301010)

广东普通高校动物分子设计与精准育种重点实验室(2019KSYS011)

佛山科学技术学院高层次人才科研启动项目和广东省动物分子设计与精准育种重点实验室开放课题(2018A07)