海洋曲霉属真菌抗菌活性物质的研究进展

Advances in the research of antibacterial active substances derived from marine Aspergillus fungi

摘要

海洋微生物由于其独特的生存环境造就了许多结构新颖、具有特殊生物活性的代谢产物。随着科学技术的发展，科学界掀起了对海洋微生物代谢物的研究浪潮。近年来的研究表明，海洋曲霉属真菌及其次级代谢产物具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性。通过查阅文献与资料，对近年来海洋曲霉属真菌及其次级代谢产物的化学结构及生物活性研究与开发的进展进行综述总结，以期有助于后续研究及应用。

Abstract

Due to their unique living environment, marine microorganisms have created many metabolites with novel structures and special biological activities. With the development of science and technology, a wave of research on marine microbial metabolites has been set off. Recent studies have shown that marine Aspergillus fungi and their secondary metabolites have anti⁃tumor, anti⁃bacteria, anti⁃virus and other biological activities.In this paper, by referring to the literature and data, the progress of the research and development on the chemical structure and biological activities of marine Aspergillus fungi and their secondary metabolites in recent years is summarized, which is helpful for the follow⁃up research and application.

Graphical abstract

关键词

曲霉属真菌 / 抗菌活性 / 研究开发进展

Key words

Aspergillus fungi / antibacterial activity / research and development progress

0 引 言

生存环境的逐年恶化威胁着人们的健康，加之抗生素的滥用引发了病原菌耐药性慢慢增强，使得我们对新型药物的需求不断上升。因此，研究开发满足人们需求的新药刻不容缓。海洋因其独特的自然环境，具有巨大的新药开发潜能。此外，海洋真菌也因其生长周期较短，不受季节等条件限制，以及可人工大量培养的优点，在科研和生产中广受重视。

1 曲霉属真菌活性物质的研究概述

1992年Numata等^[1]在海水鱼的消化道中获得一株曲霉属真菌，对其代谢产物加以分离和纯化得到fumiquinazoline A-C，由此拉开了人们对海洋来源曲霉真菌研究的序幕。迄今为止，被报道的源自于海洋曲霉的新型产物，依据生源合成方式的区别展开分类，共有六大类：聚酮类（polyketides）(占47%)、生物碱类（fumiquinazolines） (占20%)、肽类（peptides）(占15%)、萜类（terpenes）(占15%)、甾体类（steroidals）(占2%)和内脂类（lactones）(占1%)^[2]。

1.1 聚酮类

海洋灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）所产生的次级代谢产物灰绿霉素A是聚酮类的产物之一，目前聚酮类药物在市场所占畅销药的比例高达20%。研究表明，聚酮类的药物在化学预防、免疫的过程中有抗菌、抗病毒以及抗肿瘤等方面的显著疗效。从扇形叉枝藻（Gymnogongrus flabelliformis）的发酵产物得到三氧杂蒽酮类化合物yicathin A~C（图1A，B），而化合物yicathin A~C在卤虫的毒性研究实验中测得其IC₅₀分别为0.20 μmol/L和0.22 μmol/L以及0.30 μmol/L^[3]。马尾藻（Scagassum sp.）的发酵产物aurasperone F（图1C）对HeLa细胞有抑制作用^[4]。从黑曲霉（Aspergillus niger）的发酵产物分离发现aurasperone H（图1D）和fonsecinones C（图1E），aurasperone H对人急性早幼粒白血病细胞HL⁃60有细胞毒性，其IC₅₀为11.5 μmol/L^[5]；fonsecinones C对胃癌细胞MGC⁃803和人肺癌细胞A549以及人急性早幼粒白血病细胞HL⁃60均有细胞毒性，其IC₅₀值分别为2.2 μM，2.8 μΜ，0.8 μM。研究者从绿曲霉（Aspergillus glaucus）HB1⁃19次级代谢的产物中分离得到27个单体化合物（第47~第73）^[6]，研究表明，其中化合物47和54以及58（图1F~H）在DPPH自由基的清除方面具有较强的活性，其IC₅₀值分别为9.3 μM、9.8 μM以及7.6 μM。研究发现聚酮类化合物具有抗氧化的活性，此类物质不仅在免疫抗炎方面有功效，还为美容护肤的研究提供了依据^[7]。从Nagabhishek等^[8]的文献资料报道总结得源于海洋海绵内的聚酮类物质monacolin X可改变线粒体膜，增加溶解氧（ROS）的生成以及诱导细胞凋亡等而发挥抗癌作用。

1.2 生物碱类

生物碱类物质的功能在很多方面得以体现，包括抗真菌和细胞毒作用，以及可作为海洋真菌费氏新萨托菌（Neosartorya fischeri）产生的神经激肽P和肠促胰酶肽（cholecystokinin）的拮抗剂，也可作为杀虫剂在GABA发挥受体作用等^[9]。王宇等^[10]针对海洋烟曲霉（Aspergillus fumigatus）YK⁃7的发酵液及产生的菌丝，通过高效液相色谱结合硅胶柱色谱等方法，对其产物进行分离纯化，在综合分析理化性质及波谱数据进行鉴定后，得到10个属于生物碱类的产物，其中包含6个吲哚类的生物碱和4个螺内酰胺类的生物碱；其体外抗细胞的增殖活性实验结果表明，化合物1~4对人单核细胞白血病细胞表现中等强度的活性抑制作用，其IC₅₀值分别为55.9 μmol/L、18.5 μmol/L、22.8 μmol/L、25.4 μmol/L；化合物5~9未明显表现出活性抑制作用，测得IC₅₀>100 μmol/L。同时该实验表明其化合物1~9号对LNCaP均未有活性的抑制作用，针对人前列腺癌细胞的实验结果表明IC₅₀>100 μmol/L^[11]。Buttachon等^[12]通过发酵一种海绵（Epipolasis sp.）得到化合物preussin C（图2A），结果表明：preussin C在浓度为32 μg/mL时对金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213有抑制作用。对来自海绵的曲霉属真菌中分离出的吲哚生物碱misszrtine A（图2B）的细胞毒性实验中证明了misszrtine A对癌细胞LNCaP和HL60具有细胞毒性，IC₅₀值为3.1 μmol/L和4.9 μmol/L^[13]。从一种海绵（Phakellia fusca）中分离得到絮状曲霉（Aspergillus flocculosus），对其加以发酵得到了preussins G（图2C）和preussins I-K（图2D~F），发现它们可抑制脂多糖诱导THP⁃1细胞产生IL⁃6，其IC₅₀分别为0.11 μmol/L，0.19 μmol/L，2.3 μmol/L和16 μmol/L^[14]。从海洋一种海绵的曲霉真菌中分离出来的羟基吡咯烷衍生物KUFA 0062能抑制人乳腺癌细胞生长^[15]。

1.3 肽类

海洋属曲霉真菌所转化产生的肽类化合物为低毒性、高效率的新型防污剂方面的研究提供了资源和结构基础。陈立等^[16]研究了3株柳珊瑚共附生真菌，涵盖了曲霉属真菌XS⁃2009⁃0B15和XS⁃2009⁃0066以及散囊菌属Eurotium sp.真菌XS⁃2009⁃00E6。在对发酵产物加以检验、选取后发现该化合物具备抗污损功能，同时该化合物的功能体现在针对米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）和赤潮异湾藻（Heterosigma akashiw）的生长抑制方面，其EC₅₀值分别为1.16 μg/mL和4.36 μg/mL。Ma等^[17]对柳珊瑚（Melitodes squamata）产生的曲霉属真菌进行分离后得出结论：肽类化合物aspergillipeptides D（图3A）可抑制产生耐药性的I型单纯疱疹病毒HSV⁃1⁃153生长，其IC₅₀为12.5 μmol/L。

1.4 萜类

对9个化合物具有的抗病毒活性进行细胞抑制实验^[18]，在利用H1N1病毒来感染MDCK细胞的实验中，1~3号异吲哚酮类物质具有抵抗病毒侵染的活性作用，IC₅₀值的结果分别为：42.07、62.05、60.18 μmol/L^[19]。从一种海绵(Tethya aurantium)曲霉真菌内分离得到萜类化合物（图3B），在对其发酵产物加以实验后证明该萜类化合物能够抑制假单胞菌（Pseudomons adaceae），滨海玫瑰杆菌（Roseobacter litoralis）和哈维弧菌（Vibrio harveyi）的生长^[20]。对褐藻(Sargassum fusiforme)中温特曲霉（Aspergillus wentii）进行发酵后得到萜类化合物Aspewentins A-C，实验证明：Aspewentins B的功能体现在对唾液卤虫（Artemia saliva）和赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）生长的抑制方面，其IC₅₀分别为6.36 μmol/L和2.88 μmol/L^[21]。利用源于热带马尾藻的温特曲霉EN⁃48对温特曲霉次级代谢产生的萜类化合物加以分离后发现，该类化合物可抑制真菌、清除DPPH自由基，在抑制肿瘤生长方面也有效果^[22]；而海虾致死模型的实验表明，其中10号、13号、14号、15号化合物对海虾的致死活性影响有着显著差异，结果显示14号化合物LD₅₀为7.2 mg/kg。检测混合生源萜类37号化合物抗炎活性，结果显示其通过阻断P38和Akt蛋白的磷酸化表达，从而抑制各种炎症因子如IL⁃6及NO，IL⁃1β等物质，而达到抗炎效果。

1.5 甾体类

该类物质因其具备抗炎活性，故未来可能作为先导化合物在抗炎药物方面得以广泛应用。刘颖^[23]对从植物根系周围的土壤样品所得的一株曲霉真菌加以分离、发酵后，得到了2个类固醇衍生物ergosterdiacids A和B，对结核分枝杆菌蛋白络氨酸磷酸酶抑制实验的结果显示，IC₅₀分别为15.1、30.1 μmol/L；同时表现出抑制NO活性释放的能力，IC₅₀测定为4.5 μmol/L与3.6 μmol/L^[24]。Gu等^[25]从棕色扁海绵(Phakellia fusca)中得到一株曲霉属真菌Aspergillus flocculsus 16D⁃1，发酵分离得到的甾类化合物aspersecosteroids A⁃B（图3C、D），实验表明：这两个化合物均有免疫抑制活性。

1.6 内脂类

Namikoshi等^[26]对孔曲霉（Aspergillus ostianus）TUF01F313采取分离提纯操作后获得三个化合物，即14~16号，经研究显示，14~16号化合物能够显著抑制大西洋鲁杰氏菌（Ruegeria atlantica）的活性，14~16号化合物可抑制金黄色葡萄球菌的生长。随后研究发现另外3个14元大环内酯22~24号化合物，对L1210细胞毒性LD₅₀分别为2.1、71.0 和2.0 μg/mL^[27]。

2 海洋曲霉属真菌抗菌活性物质开发进展

随着人们对海洋探索的不断深入和科学技术的发展，科学家分离得到的海洋曲霉属真菌的种类越来越多，对真菌的抗菌物质研究也越来越透彻。人类健康是世界发展的一个永恒主题，人类不断探索和发掘海洋中的奥秘，最终也是希望能够利用海洋中珍贵的资源为人类的健康发展做贡献。海洋曲霉属真菌中抗菌物质的开发和利用，正是人类探索海洋过程中的一部分。面临着开发过程中可能出现的问题，科学家们也致力于提出可行的解决方案。

2.1 国内外海洋曲霉属真菌抗菌物质开发情况

目前，关于海洋曲霉活性物质获得国内外药品监管部门所批准且进入临床Ⅲ期尚只有衍生物普纳布林（Plinabulin, NPI⁃2358)，该化合物可在不损害自身正常血管的情况下精准作用于肿瘤细胞的微管蛋白而达到抑制肿瘤的血流的效果，为肿瘤的治疗提供了新的治疗方式^[28]。迄今，肽类药物在实现精准治疗过程中发挥着重要的作用，如Bicycle Therapeutics公司研发新型多肽药物的抗肿瘤药物BT⁃1718解决了寻常的肽类药物代谢过快的问题。但是因肽类药物本身存在产量较低、分离难度大等问题而使其生产受到限制^[29]。当下开发阶段我们应把握活性物质在稳定期大量合成的自然特性，借助生物学策略对合成途径中的关键元件如：启动子、整合质粒、RBS等进行操纵，使得产物的“质”和“量”达到预期的效果。

2.2 抗菌物质开发过程面临的问题

曲霉菌的次级代谢产物包括许多活性物质，但因其非菌体生长必需物质，故而产量较低。至今在开发过程仍存在着问题亟待解决：①在生物方面，尚未了解肽类等活性物质与遗传物质间的作用；②在化学方面，还未了解生物活性大分子的合成表达途径；③在结构方面，未能清晰了解作为药物在细胞膜的作用机制^[30]；④对抗菌活性物质的吸收、代谢等方面的研究也尚未健全，比如生物分子合成路径、生物分子的吸收及代谢机制、以及关于群体感应系统的调控机理^[31]。

2.3 抗菌物质开发面临问题的解决方案

近几年，随着计算机模拟计算、多肽固相合成等技术的不断突破，我们有望利用这些新型技术弄清海洋曲霉抗菌活性物质的作用机理，并开发出更高效的研发靶向药物使其得以大规模生产，为其合成的产业化铺垫^[32]。

3 结 语

综上所述，有关于海洋曲霉属真菌的报道中，萜类化合物的报道较多，某些化合物表现出对病原菌抑制功能的作用，例如内酯类化合物。某些化合物表现出强于对照组抑菌的作用，例如萜类化合物。由此可知海洋真菌较为丰沛，由于其生存的自然环境多样化，代谢途径特殊化等特点能够产生许多结构较新颖且抗菌活性显著的次级代谢产物，其中一部分在未来经过进一步结构改造开发，有望成为新型抗生素，运用于日后的医疗研究中。

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基金资助

2018年福建省高校杰出青年科研人才培育计划

2019年福建省中青年教师教育科研项目(JAT190852)

国家级大学生创新创业训练计划项目(201812631004)

福建省大学生创新创业训练计划项目(201912631014)