南海孔石藻可培养细菌多样性及代谢产物四溴吡咯研究

Diversity of culturable bacteria isolated from Porolithon onkodes and metabolite tetrabromopyrrole

摘要

钙化藻和微生物在造礁石珊瑚幼虫的附着变态过程中扮演着重要角色，对珊瑚礁生态系统的健康具有重要意义。对南海珊瑚礁区钙化藻的共附生细菌进行分离培养，一方面有利于发掘南海珊瑚礁的微生物资源，另一方面有利于进行微生物与珊瑚、钙化藻等珊瑚礁框架生物的相互作用研究。本研究分离获得孔石藻（Porolithon onkodes）表面共附生细菌，基于16S rRNA基因序列进行系统发育分析，并通过高效液相色谱和质谱对分离得到的假交替单胞菌属菌株的代谢产物进行比较分析。从孔石藻分离获得的369株细菌菌株分别隶属于变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）的5纲12目22科47属的97个种级类群。在属级水平上，假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）的菌株数量最多，分属于7个种。在假交替单胞菌属的代谢产物分析中，发现3株在系统发育树中聚为一簇的假交替单胞菌的代谢产物中存在四溴吡咯，而其余没有。研究结果不仅表明了钙化藻中含有丰富的可培养微生物和潜在新物种资源，还首次发现四溴吡咯在南海珊瑚礁区特定类群菌株的代谢产物中的存在，为珊瑚幼虫附着变态的化学信号研究提供基础。

Abstract

Calcified algae and microorganisms play an important role in the process of settlement and metamorphosis of reef⁃building coral larvae and are of great significance to the health of coral reef ecosystems. Isolating the cultured bacteria from calcified algae of coral reefs in South China Sea (SCS) can help to discover the microbial resources of coral reefs in SCS. Moreover, it is beneficial to study the interaction between microorganisms and framework organisms such as corals and calcified algae in coral reefs. For this, phylogenetic analysis of cultured bacteria isolated from Porolithon onkodes was conducted based on 16S rRNA gene sequence, and the metabolites of the isolated bacteria were analyzed by HPLC and mass spectrometry. The results showed that a total of 369 bacterial strains were isolated, belonging to 5 classes, 12 orders, 22 families, 47 genera and 97 species in three phyla: Proteobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes, containing 91 strains with 16S rRNA gene sequence similarity between 95%~98% and 6 strains with less than 95% similarity. At the genus level, Pseudoalteromonas has the highest proportion, which affiliated to 7 species. In the analysis of metabolites of Pseudoalteromonas, tetrabromopyrrole was detected in metabolites of 3 strains of Pseudoalteromonas clustered in the phylogenetic tree while the rest were not. The results not only indicate that calcified algae are rich in culturable microorganisms and potential new species resources, but also the first discovery of the presence of tetrabromopyrrole in the microbial metabolites of coral reefs in SCS, which promote future studies on chemical signals of coral larval settlement and metamorphosis.

Graphical abstract

关键词

孔石藻 / 细菌多样性 / 假交替单胞菌 / 代谢产物 / 四溴吡咯

Key words

Porolithon onkodes / bacterial diversity / Pseudoalteromonas / metabolite / tetrabromopyrrole

0 引 言

珊瑚礁是地球上生物多样性和生产力最高的生态系统之一，虽然珊瑚礁面积仅占海洋的0.2%，但其价值和提供的服务占了海洋生态系统的2.85%。然而，由于气候变化和人类活动等因素的影响，全球珊瑚礁近十几年来发生了不同程度的退化，珊瑚礁的保护、恢复和可持续开发成为了社会各界高度关注的焦点^[1]。

孔石藻（Porolithon onkodes）是一种广泛分布于热带和亚热带珊瑚礁生态系统的壳状珊瑚藻（crustose coralline algae，CCA），隶属于红藻门（Rhodophyta）、珊瑚藻目（Corallinales）、孔石藻属（Porolithon）^[2]。孔石藻等CCA作为珊瑚礁生态系统中的重要组成部分，在珊瑚礁的发育过程中发挥着多种重要的生态学作用，包括提供初级生产力、稳固珊瑚礁结构以及诱导造礁石珊瑚幼虫的附着和变态^[3,4]。研究表明，CCA的共附生细菌，包括诱导效果较为突出的假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），在珊瑚幼虫附着和变态过程中起着关键作用^[5]。因此，加深对孔石藻共附生细菌多样性的研究，尤其是已发现的具有特殊功能类群细菌的多样性，对于今后研究海洋生态系统中藻类、细菌与珊瑚之间的相互作用关系，促进珊瑚等无脊椎动物幼虫的人工繁育以及开展珊瑚礁生态系统的管理与修复具有重要意义。

假交替单胞菌属于γ⁃变形菌纲（Gammaproteobacteria）、交替单胞菌目（Alteromonas）、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）^[6]，已有研究报道其在珊瑚幼虫的附着和变态过程中的重要作用。从加勒比海域的壳状珊瑚藻表面分离得到的假交替单胞菌菌株可以诱导珊瑚幼虫的附着和变态，并且发现该菌是通过产生一种代谢产物——四溴吡咯（tetrabromopyrrole，TBP）起作用^[7]，然而这种化合物的相关研究在国内尚未见报道。本研究以广泛分布于三亚鹿回头珊瑚礁区的孔石藻中的细菌为研究材料，基于16S rRNA基因序列对分离的细菌进行分子鉴定及系统发育分析，并通过高效液相色谱和质谱等方法比较假交替单胞菌属的代谢产物特征，筛选能够产TBP的菌株，为深入研究钙化海藻⁃细菌⁃珊瑚之间的关系提供理论基础，也为钙化海藻细菌资源的利用开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本次实验的孔石藻样品于2018年10月采自海南省三亚市鹿回头海域（18°20'N， 109°47'E），通过水肺潜水于3~5 m的深度采集（图1）。用无菌海水将采集到的孔石藻样品表面清洗干净，去除表面杂藻和沙砾，带回实验室后立刻进行共附生菌的分离。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化与保藏

用无菌手术刀刮取孔石藻表层藻体组织（约1 cm²），置于无菌研钵中，加入1 mL无菌海水研磨，充分研磨后转移到2 mL无菌离心管中，在涡旋震荡仪震荡10 min。上悬液用无菌海水按10倍梯度稀释后，取100 μL稀释溶液涂布于2216E固体培养基上（青岛海博生物技术有限公司），28 ℃培养3 d。根据菌落形态等特征挑取不同菌落，四线法纯化，于25%（m/V）甘油管中-80 ℃保藏^[8]。

1.2.2 细菌16S rRNA基因序列扩增和测定

细菌DNA的提取采用Chelex⁃100提取法^[9]。采用细菌16S rRNA基因通用引物27F（5′⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCA⁃3′）和1492R（5′⁃GGTTACCTTGTTACGACTT⁃3′）进行扩增。PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix（全式金，北京）25 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL， ddH₂O 22 μL。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s（30个循环）；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至广州天一辉远基因科技有限公司进行序列测定。

1.2.3 系统发育分析

将获得的序列在EzBioCloud数据库^[10]进行相似性比对分析（https://www.ezbiocloud.net/identify）。选取比对结果中同源性较高序列作为参比序列，使用MEGA7.0软件^[11]，采用多序列比对算法ClustalW^[12]，根据Kimura模型估算进化距离^[13]，采用邻近法（Neighbor⁃Joining）进行聚类分析和构建系统发育树^[14]，分支构型稳定性检验的自举值（Bootstrap值）设为1 000^[15]。

1.2.4 细菌发酵和代谢产物提取

用接种环取适量菌体接种于200 mL灭菌的2216E液体培养基（青岛海博生物技术有限公司）中，于28 ℃、180 r/min摇床培养72 h。发酵菌液经超声细胞破碎15 min后，用乙酸乙酯等体积萃取2次，收集上层有机相，通过旋转蒸发仪去除溶剂后，用甲醇溶解粗提物并转移到液相小瓶。

1.2.5 高效液相色谱分析

采用1260InfinityⅡ型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；色谱柱：安捷伦Ecllpse XDB⁃C18柱（9.4 mm × 250 mm，5 μm）；以水（A）⁃乙腈（B）为流动相梯度洗脱，洗脱程序：0~5 min，5%B；5~50 min，15%→100%B；50~56 min，100%→5%B；56~60 min，5%B。流速：2.5 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。

2 结 果

2.1 孔石藻可培养细菌的分离

本实验从孔石藻共分离获得369株细菌，16S rRNA基因序列的比对结果显示，可培养细菌分属于3个门、5个纲、12个目、22个科、47个属的97个物种。其中，变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为优势类群，分别占79.4%和20.3%，厚壁菌门（Firmicutes）仅有1株细菌。5个纲分别为α⁃变形菌纲（Alphaproteobacteria）、γ⁃变形菌纲（Gammaproteobacteria）、黄杆菌纲（Flavobacteria）、噬纤维菌纲（Cytophagia）和芽胞杆菌纲（Bacilli），分别占47.4%、32.0%、19.2%、1.1%和0.3%。在属级水平，丰度最高的5个类群为假交替单胞菌属、海水菌属（Aquimarina）、鲁杰氏菌属（Ruegeria）、假弧菌属（Pseuvibrio）和弧菌属（Vibrio）（图2）。分离细菌最多的假交替单胞菌属共有63株细菌，分属于7个种，其中深红假交替单胞菌（Pseudoalteromonas rubra）21株、海绵假交替单胞菌（P. spongiae）18株、金黄色假交替单胞菌（P. flavipulchra）10株、藤黄紫假交替单胞菌（P. luteoviolacea）5株、苯酚假交替单胞菌（P. phenolica）5株、海盗假交替单胞菌（P. piratica）3株、杀鱼假交替单胞菌（P. piscicida）1株。另外，分离获得的369株细菌中，16S rRNA基因序列相似性高于98%的有272株（73.7%），相似性95%~98%的有91株（24.7%），低于95%的有6株（1.6%）（表1），表明孔石藻具有较丰富的微生物新物种资源。

2.2 可培养细菌的系统发育分析

拟杆菌门和变形菌门为孔石藻的主要优势细菌类群，分别从拟杆菌门、变形菌门的可培养细菌中选取约20株不同物种的代表菌株，结合数据库中与代表菌株同源性最近的标准菌株，使用MEGA7.0软件采用邻接法分别构建拟杆菌门的系统发育树（图3）和变形菌门的系统发育树（图4）。

如图3所示，拟杆菌门包含黄杆菌纲和噬纤维菌纲2个纲级类群，其中黄杆菌纲包含1个科的20个物种，噬纤维菌纲包含2个科的3个物种。如图4所示，变形菌门是孔石藻最容易获得纯培养的一大类群，包括α⁃变形菌纲的7个科的40个物种和β⁃变形菌纲的11个科的33个物种。系统发育分析显示了孔石藻可培养细菌之间的系统发育关系以及在不同分类水平下的多样性。在较高分类水平，拟杆菌门包含3个科级类群，变形菌门的科级类群数量是其6倍。而在较低分类水平，拟杆菌门包含23个种级类群，变形菌门包含的种级类群约为拟杆菌门的3.2倍。

2.3 假交替单胞菌代谢产物比较

采用相同发酵条件和HPLC条件，比较11株假交替单胞菌和1株交替单胞菌（表2）的代谢产物，结果显示，编号为31311、33301和31123菌株的液相图谱在41 min出现相同的紫外吸收峰（图5），经过HR⁃ESI⁃MS检测在m/z 377.6780处给出[M-H]^-峰，化合物的分子式为C₄Br₄N，鉴定该化合物为四溴吡咯（tetrabromopyrrole）^[22,23]。16S rRNA基因序列的比对结果显示，31311与最相似菌株杀鱼假交替单胞菌的相似度为99.58%，33301和31123与最相似菌株金黄色假交替单胞菌的相似度分别为99.36%和99.15%。对分离得到的假交替单胞菌构建系统发育树，结果显示3株产四溴吡咯的假交替单胞菌属菌株31311、31123、33301和已报道的两株产四溴吡咯的菌株J010、PS5在系统发育树中聚成一簇，而在其他8株假交替单胞菌的次级代谢产物中没发现四溴吡咯（图6）。

3 讨 论

本研究从南海珊瑚礁区一种广泛分布的钙化红藻孔石藻中分离得到共附生细菌369株，基于16S rRNA基因序列的鉴定，分布在3门5纲12目22科下的47个细菌属级类群，结果表明孔石藻表面具有比较丰富的细菌组成。其中，α⁃变形菌纲、γ⁃变形菌纲和黄杆菌纲为孔石藻可培养细菌的主要优势菌群，这与紫菜属红藻（Porphyra umbilicalis）和珊瑚藻（Corallina officinalis）共附生细菌的研究结果一致^[24,25]。α⁃变形菌纲主要包括红杆菌目（Rhodobacterales）和根瘤菌目（Rhizobiales），结果与Hester等^[26]对3种珊瑚和1种壳状珊瑚藻的细菌群落研究结果一致。γ⁃变形菌纲是海藻中最常见的细菌分支^[27]，本研究中γ⁃变形菌纲主要包括交替单胞菌目（Alteromonadales）和弧菌目（Vibrionales）。黄杆菌纲的分离菌株均属于黄杆菌目（Flavobacteriales）。研究结果反映了孔石藻可培养细菌组成与其他大型海藻细菌组成的差异。另外，本研究中16S rRNA基因序列相似性为95%~98%的分离菌株有91株，而相似性低于95%的分离菌株有6株，表明了南海珊瑚礁区域的孔石藻具有较大的微生物新物种资源开发潜力。近年来，一些学者指出通过分离培养虽然能够获得大量共附生细菌，但由于可培养方法的限定难以代表自然状态下的群落组成，有必要采用纯培养和免培养两种方法来研究环境样品中微生物群落的多样性^[28,29]。本研究在前期采用高通量测序的方法对孔石藻共附生菌进行分析（未公开），发现弧菌目（Vibrionales）、假单胞菌目（Pseudomonadales）、红杆菌目（Rhodobacterales）、红螺菌目（Rhodospirillales）、根瘤菌目（Rhizobiales）和黄杆菌目（Flavobacteriales）为孔石藻免培养共附生菌的主要菌群（丰度大于2%），与可培养方法所得的共附生菌主要类群相似，但丰度存在有明显差异，如弧菌目在免培养和可培养中分别占比为39.4%和7.6%。

作为珊瑚礁的重要组成部分，孔石藻等钙化藻在珊瑚礁发育过程中的生态作用研究较多，然而在钙化藻与共附生微生物的相互作用方面的研究较少^[30]。有研究发现，共附生微生物对藻类寄主表现出适应性，具有与寄主相似的生态功能^[31]。另外，虽然已有研究表明大型海藻与共附生微生物之间存在广泛的有益或有害的相互作用，但是大型藻类与共附生微生物的组成是否存在系统发育关系存在不同的假说。通过总结过去绿藻、红藻和褐藻三大藻类类群的共附生细菌组成研究，认为在较高分类学水平上似乎存在由α⁃变形菌、γ⁃变形菌、厚壁菌、CFB菌群和放线菌组成核心群落^[27]。然而，在共附生微生物群落的形成过程中，细菌群落特异性可能由细菌的功能基因决定，而不是细菌的分类水平^[32]。研究发现石莼（Ulva australis）的细菌群落的生理功能与藻类宿主的生活方式保持一致，而且这些功能可以由不同系统发育的细菌类群来完成^[33]。本实验通过分离培养的方法获得的孔石藻共附生细菌，可以为进一步开展共附生细菌对孔石藻生理生态研究提供材料。

造礁石珊瑚幼虫的附着和变态是珊瑚进行有性繁殖和扩大种群的关键过程，而该过程往往依赖钙化藻和微生物产生的诱导作用^[5]。筛选有诱导活性的海洋微生物和藻体组分或代谢产物的分离提纯和结构鉴定对研究幼虫附着变态机制具有重要意义。假交替单胞菌属细菌是目前已发现的能够诱导珊瑚幼虫附着和变态的少数特殊细菌类群之一^[34]。Tebben等^[23]从大堡礁海域的两种壳状珊瑚藻中分离得到3株可以诱导珊瑚幼虫变态的假交替单胞菌属菌株J010、J021和J104，并从菌株J010的次级代谢产物中分离出第一个细菌来源的具有诱导珊瑚幼虫变态活性的化合物四溴吡咯（TBP）。2014年，Sneed等^[7]从加勒比海域的壳状珊瑚藻表面分离出一株可以诱导多种珊瑚幼虫附着和变态的假交替单胞菌株PS5，并发现该菌株的诱导活性也是由单一化合物TBP产生。这些研究表明了TBP在珊瑚幼虫附着变态过程中具有重要的诱导活性，但是TBP是否存在于不同种假交替单胞菌属菌株中仍不清楚。本研究首次从南海珊瑚礁区的孔石藻表面分离获得多株不同种的假交替单胞菌属菌株，并对其中11株分属于6个种的假交替单胞菌属菌株进行代谢产物比较和系统发育分析，发现3株产TBP的假交替单胞菌属菌株31311、31123、33301和已报道的2株产TBP的菌株J010、PS5在系统发育树中聚成一簇，表明产TBP的假交替单胞菌之间具有高度相似的系统发育关系，而与其他不产TBP的假交替单胞菌有明显的进化距离。研究结果为假交替单胞菌和TBP广泛存在不同地理区域壳状珊瑚藻中提供了进一步的证据，也为今后研究南海珊瑚幼虫附着变态的化学信号奠定基础。

参考文献

[1] 赵焕庭, 王丽荣, 袁家义. 南海诸岛珊瑚礁可持续发展[J]. 热带地理, 2016(1): 55⁃65.

[2] Zhao H T, Wang L R, Yuan J Y. Sustainable development of the coral reefs in the South China Sea Islands[J]. Trop Geogr, 2016(1): 55⁃65.

[3] Maneveldt G W, Keats D W. Taxonomic review based on new data of the reef⁃building alga Porolithon onkodes (Corallinaceae, Corallinales, Rhodophyta) along with other taxa found to be conspecific [J]. Phytotaxa, 2014, 190(1): 216⁃249.

[4] Ritson⁃Williams R, Arnold S N, Paul V J, et al. Larval settlement preferences of Acropora palmata and Montastraea faveolata in response to diverse red algae[J]. Coral Reefs, 2014, 33(1): 59⁃66.

[5] Harrington L, Fabricius K, De'Ath G, et al. Recognition and selection of settlement substrata determine post⁃settlement survival in corals [J]. Ecology, 2004, 85(12): 3428⁃3437.

[6] Gómez⁃Lemos L A, Doropoulos C, Bayraktarov E, et al. Coralline algal metabolites induce settlement and mediate the inductive effect of epiphytic microbes on coral larvae [J]. Sci Rep, 2018, 8: 17557.

[7] Skovhus T L, Ramsing N B, Holmström C, et al. Real⁃time quantitative PCR for assessment of abundance of Pseudoalteromonas species in marine samples [J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(4): 2373⁃2382.

[8] Sneed J M, Sharp K H, Ritchie K B, et al. The chemical cue tetrabromopyrrole from a biofilm bacterium induces settlement of multiple Caribbean corals [J]. Proc Biol Sci, 2014, 281(1786): 20133086.

[9] 陈柔雯, 王可欣, 何媛秋, 等. 一份南海深海沉积物样品中可培养细菌的多样性[J]. 生物资源, 2018, 40(4): 321⁃333.

[10] Chen R W, Wang K X, He Y Q, et al. Diversity of cultured bacteria isolated from a deep see sediment in South China Sea [J]. Biotic Resour, 2018, 40(4): 321⁃333.

[11] Walsh P S, Metzger D A, Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR⁃based typing from forensic material [J]. BioTechniques, 1991, 10(4): 506⁃513.

[12] Kim O S, Cho Y J, Lee K, et al. Introducing EzTaxon⁃e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2012, 62(3): 716⁃721.

[13] Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets [J]. Mol Biol Evol, 2016, 33(7): 1870⁃1874.

[14] Thompson J D, Higgins D G, Gibson T J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position⁃specific gap penalties and weight matrix choice [J]. Nucl Acids Res, 1994, 22(22): 4673⁃4680.

[15] Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences [J]. J Mol Evol, 1980, 16(2): 111⁃120.

[16] Saitou N, Nei M. The neighbor⁃joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees [J]. Mol Biol Evol, 1987, 4(4): 406⁃425.

[17] Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap [J]. Evolution, 1985, 39(4): 783.

[18] Arun A B, Chen W M, Lai W A, et al. Parvularcula lutaonensis sp. nov., a moderately thermotolerant marine bacterium isolated from a coastal hot spring [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2009, 59(Pt5): 998⁃1001.

[19] Nedashkovskaya O I, Kim S B, Shin D S, et al. Fulvivirga kasyanovii gen. nov., sp. nov., a novel member of the phylum Bacteroidetes isolated from seawater in a mussel farm [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2007, 57(5): 1046⁃1049.

[20] Hwang C Y, Lee I, Cho Y, et al. Sediminicola arcticus sp. nov., a psychrophilic bacterium isolated from deep⁃sea sediment, and emended description of the genus Sediminicola [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2015, 65(Pt5): 1567⁃1571.

[21] Nedashkovskaya O I, Vancanneyt M, Kim S B. Bizionia echini sp. nov., isolated from a sea urchin [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2010, 60(Pt4): 928⁃931.

[22] Wang Y, Ming H, Guo W, et al. Aquimarina aggregata sp. nov., isolated from seawater [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2016, 66(9): 3406⁃3412.

[23] Satomi M, Kimura B, Hayashi M, et al. Marinospirillum gen. nov., with descriptions of Marinospirillum megaterium sp. nov., isolated from kusaya gravy, and transfer of Oceanospirillum minutulum to Marinospirillum minutulum comb. nov [J]. Int J Syst Bacteriol, 1998, 48(4): 1341⁃1348.

[24] Andersen R J, Wolfe M S, Faulkner D J. Autotoxic antibiotic production by a marine Chromobacterium [J]. Mar Biol, 1974, 27(4): 281⁃285.

[25] Tebben J, Tapiolas D M, Motti C A, et al. Induction of larval metamorphosis of the coral Acropora millepora by tetrabromopyrrole isolated from a Pseudoalteromonas bacterium [J]. PLoS One, 2011, 6(4): e19082.

[26] Miranda L N, Hutchison K, Grossman A R, et al. Diversity and abundance of the bacterial community of the red macroalga Porphyra umbilicalis: did bacterial farmers produce macroalgae?[J]. PLoS One, 2013, 8(3): e58269.

[27] Johnson C R, Muir D G, Reysenbach A L. Characteristic bacteria associated with surfaces of coralline algae: a hypothesis for bacterial induction of marine invertebrate larvae [J]. Mar Ecol Prog Ser, 1991, 74: 281⁃294.

[28] Hester E R, Barott K L, Nulton J, et al. Stable and sporadic symbiotic communities of coral and algal holobionts [J]. ISME J, 2016, 10(5): 1157⁃1169.

[29] Hollants J, Leliaert F, de Clerck O, et al. What we can learn from sushi: a review on seaweed–bacterial associations [J]. FEMS Microbiol Ecol, 2013, 83(1): 1⁃16.

[30] Martin M, Barbeyron T, Martin R, et al. The cultivable surface microbiota of the brown alga Ascophyllum nodosum is enriched in macroalgal⁃polysaccharide⁃degrading bacteria [J]. Front Microbiol, 2015, 6: 1487.

[31] 邓阳, 余利岩, 张玉琴. 环贵州喀斯特高原湖泊环境中的细菌多样性[J]. 生物资源, 2019, 41(3): 215⁃227.

[32] Deng Y, Yu L Y, Zhang Y Q. Bacterial diversity in the soil surrounding the karst plateau lakes in Guizhou [J]. Biotic Resour, 2019, 41(3): 215⁃227.

[33] 李银强, 余克服, 王英辉, 等. 珊瑚藻在珊瑚礁发育过程中的作用[J]. 热带地理, 2016(1): 19⁃26.

[34] Li Y Q, Yu K F, Wang Y H, et al. Review on the coralline algae functions in the development process of coral reefs [J]. Trop Geogr, 2016(1): 19⁃26.

[35] Ashen J B, Goff L J. Molecular and ecological evidence for species specificity and coevolution in a group of marine algal⁃bacterial symbioses [J]. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(7): 3024⁃3030.

[36] Burke C, Steinberg P, Rusch D, et al. Bacterial community assembly based on functional genes rather than species [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(34): 14288⁃14293.

[37] Burke C, Thomas T, Lewis M, et al. Composition, uniqueness and variability of the epiphytic bacterial community of the green alga Ulva australis [J]. ISME J, 2011, 5(4): 590⁃600.

[38] Tran C, Hadfield M G. Larvae of Pocillopora damicornis (Anthozoa) settle and metamorphose in response to surface⁃biofilm bacteria [J]. Mar Ecol Prog Ser, 2011, 433: 85⁃96.

基金资助

国家自然科学基金(41806145)

中国科学院战略性先导科技专项（A类）(XDA13020203)

广州市科技计划项目(201707010174)