微生物除臭剂发酵工艺条件优化及硫素转化的研究

Study on optimization of fermentation process conditions and sulfur conversion of microbial deodorant

摘要

利用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌三种可食性微生物复配发酵制备微生物除臭剂，研究微生物复配比、发酵时间、发酵温度、接种量四个因素对H₂S去除率的影响。以单因素实验为基础，利用Box⁃Behnken响应面法优化最佳发酵条件，进一步研究硫元素转化及含量动态变化。结果表明酵母菌、乳酸菌、醋酸菌质量比为1∶2∶2时，各因素对H₂S去除率的影响由高到低依次为发酵温度>发酵时间>接种量，最优发酵条件为发酵时间48.5 h、发酵温度30 ℃、接种量12.75%，H₂S的去除率可达到71.84%；实验组与对照组的硫元素转化及含量动态变化相比，实验组的SO₄^2-含量显著较高（P<0.05），H₂S释放量显著较低（P<0.05）说明该微生物除臭剂可以调节硫元素转化，有效抑制H₂S产生。

Abstract

The microbial deodorant was prepared by the compound fermentation of yeast, lactobacillus and acetobacter, and the effects of four factors, including the ratio of microorganisms, fermentation time, fermentation temperature, and inoculation amount, on H₂S removal rate were studied. Based on the single factor experiment, the optimal fermentation conditions were optimized by using the Box⁃Behnken response surface method, and the transformation of sulfur and its dynamic changes were further studied. The results showed that when the mass ratio of yeast, lactobacillus and acetobacter was 1∶2∶2, the influence of various factors on the removal rate of H₂S was fermentation temperature>fermentation time>inoculation amount, the optimal fermentation conditions were the fermentation time of 48.5 h, fermentation temperature of 30 ℃, inoculation amount of 12.75%, and the removal rate of H₂S could reach up to 71.84%. Compared with the control group’s sulfur conversion and dynamic changes in content, SO₄^2- content of the experimental group was significantly higher (P<0.05), the release amount of H₂S was significantly lower (P<0.05), which indicated that the microbial deodorant could regulate the conversion of sulfur element and effectively inhibit the production of H₂S.

Graphical abstract

关键词

除臭效果 / 响应面优化 / 复配发酵 / 硫素转化

Key words

deodorization effect / response surface optimization / compound fermentation / sulfur conversion

0 引 言

随着社会经济水平的提高，恶臭污染问题越来越受到大众的关注。恶臭污染物指一切刺激嗅觉器官使人不愉快及影响生活环境的气体物质^[1]。迄今为止，已有数万种恶臭物质被发现，以空气为介质，能被嗅觉器官感知的恶臭物质约有4 000多种，这些恶臭气体几乎都具有挥发性、亲水性和亲脂性，按照气体的化学组分不同，将其分为5类^[2,3]：（1）硫醇类、H₂S、硫醚类等含硫化合物；（2）NH₃、吲哚、胺类等含氮化合物；（3）卤代烃、氯气等卤素及其衍生物；（4）烯烃、烷烃、芳香烃等烃类；（5）酚、醛、酮等含氧有机物。

恶臭污染作为一种感知性污染，具有污染源多、涉及面广等特点，不仅会对生态环境造成危害，对人体的危害也不容小觑。恶臭污染不仅会刺激人的嗅觉器官使人产生心理厌恶感，还会对人体的消化系统、内分泌系统、神经系统等产生不良影响，引起身体不适。其中对人体危害较大的恶臭物质包括H₂S、NH₃、甲醛、苯乙烯和酚类等^[4,5]，例如H₂S对机体黏膜有强烈的刺激作用，高浓度H₂S会造成窒息症状并破坏中枢神经系统^[6]；NH₃对机体呼吸道黏膜有刺激和腐蚀作用，高浓度NH₃会导致机体贫血、组织缺氧、抵抗力降低^[7,8]。

目前，国内外主要采用物理、化学和生物除臭法处理恶臭气体，使恶臭气体的物相和结构发生改变，从而达到除臭的效果^[9]。生物除臭法是指利用微生物代谢将恶臭物质降解或转化为低害或无害物质的除臭方法^[10]。与物理、化学法相比，生物除臭法具有处理效率高、无二次污染、便于操作、成本低等特点，已被国内外广泛应用于恶臭治理方面 ^[11,12]。

本文利用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌三种可食性微生物复配发酵制备微生物除臭剂，研究微生物复配比、发酵时间、发酵温度、接种量四个因素对H₂S去除率的影响，进一步研究硫元素转化及含量动态变化，可为微生物除臭剂的开发应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸杆菌属（Lactobacillus sp.）、醋酸杆菌属（Acetobacter sp.）均来源于兰州理工大学食品科学与工程学院中心实验室。

蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖（天津市致远化学试剂有限公司）；牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）；铬酸钾（东莞市乔科化学有限公司）；CaCO₃、氯化钡、无水硫酸钠（天津市大茂化学试剂厂）；浓盐酸（甘肃志毅工贸有限公司）。

1.2 仪器与设备

DHP⁃9082电热恒温培养箱（上海恒一科学仪器有限公司）；FA2004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；YX280B压力蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）；SHZ⁃82恒温振荡器（上海贺帆仪器有限公司）；TG22⁃WS台式高速离心机（上海秉越电子仪器有限公司）；752N紫外可见风光光度计（上海精科仪器分析有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基

乳酸菌培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL。

醋酸菌培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，CaC0₃ 15 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL。

酵母菌培养基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂18 g，蒸馏水 1 000 mL。

1.3.2 菌体细胞收集

将酵母菌、乳酸菌、醋酸菌经斜面活化后，分别接入相应的装有500 mL 液体培养基的三角瓶中，于30 ℃，120 r/min条件下摇床培养至对数生长期（3~6 d）。8 000 r/min 条件下离心30 min 收集菌体。

1.3.3 微生物最佳复配比确定

将酵母菌、乳酸菌、醋酸菌菌体按质量比为3∶1∶1、2∶2∶1、1∶1∶3、1∶2∶2、1∶3∶1、2∶1∶2复配接种（总接种量5%）到基础培养基上，于30 ℃，120 r/min 条件下摇床培养 72 h，获得微生物除臭剂，进行除臭效果实验，测定其对H₂S的去除率，确定最佳复配比。

1.3.4 除臭效果测定（以H₂S的去除率为指标）

取塑料瓶，留下瓶底2/3部分，制成多孔盖（孔径为5 mm）备用；在大烧杯底部放入100 g猪粪（含水率45%），添加微生物除臭剂，与猪粪搅拌均匀，形成堆体，用多孔盖盖住，以不添加微生物除臭剂的猪粪为对照组；分别在实验组和对照组的多孔盖上方装有锌铵络盐溶液的小烧杯用作吸收H₂S。用多层塑料膜密封进行发酵，每5 d取样测量H₂S和无机硫（SO₄^2-）的含量。

H₂S含量的测定采用亚甲基兰分光光度法^[13]；无机硫（SO₄^2-）含量的测定采用HJ/T 342⁃2007中铬酸钡分光光度法^[14]。

H₂S的去除率（%）=（对照组释放量-实验组的释放量）/对照组的释放量×100%

1.3.5 单因素实验设计

将酵母菌、乳酸菌、醋酸菌按质量比1∶2∶2接种到基础培养基上，以发酵时间（12、24、36、48、60、72 h）、发酵温度（10、15、20、25、30、35 ℃）、接种量（2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%）三个因素进行单因素实验，每个因素设计三组平行实验，确定影响H₂S去除率（Y）的单因素条件。

1.3.6 响应面优化实验设计

结合单因素实验结果，选择影响H₂S去除率（Y）的三个因素：发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）为自变量，利用Design⁃Expert11.0.4软件进行Box⁃Behnken实验组合设计三因素三水平实验，并进行数据分析，实验因素水平如表1所示。

1.3.7 数据处理与分析

有效数据均用三组平行实验的平均值表示，用SPSS Statistics 21、Origin Pro 2018c、Design⁃Expert 11.0.4、excel 2016等软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 微生物复配比对H₂S去除率的影响

如图1所示，当总接种量为5%时，将酵母菌、乳酸菌、醋酸菌三种微生物的菌体按不同质量比复配，所得的除臭剂均具有一定的除臭效果。由于酵母菌、乳酸菌、醋酸菌之间存在协同作用，酵母菌发酵产生乙醇，醋酸菌吸收酵母菌产生的乙醇转化为醋酸，乳酸菌产生乳酸，醋酸、乳酸形成酸性环境避免其他微生物的侵染^[15]。在除臭过程中，水溶解臭气分子，酸与臭气分子结合，进而与发酵产物发生反应，从而完成除臭过程。当菌体复配比为3∶1∶1时，除臭效果较差，H₂S去除率仅为45.8%，当菌体复配比为1∶2∶2时，除臭效果最好，H₂S去除率可达75.57%。因此，酵母菌、乳酸菌、醋酸菌菌体的最佳复配比为1∶2∶2。

2.1.2 发酵时间对H₂S去除率的影响

如图2所示，随发酵时间的增加，H₂S去除率呈现先增大后减小再趋于稳定的趋势。发酵时间为48 h时，除臭效果最好，H₂S去除率高达63.17%。发酵时间在12~48 h时，除臭剂中的微生物数量逐渐增加，酵母菌、乳酸菌、醋酸菌之间的协同作用增强，除臭效果明显。发酵时间大于48 h时，随着除臭剂中营养物质的消耗及除臭剂pH的变化，微生物数量及种类随之发生变化，使其除臭效果略有降低。经方差分析可知，发酵时间对H₂S去除率的影响极显著（P<0.01）；经相关性分析可知，H₂S去除率与发酵时间呈极显著相关（r=0.892，P<0.01）。因此，除臭效果最好时的最佳发酵时间为48 h。

2.1.3 发酵温度对H₂S去除率的影响

由图3可知，随发酵温度的升高，H₂S去除率呈现先增大后减小的趋势。发酵温度为30 ℃时，除臭效果最好，H₂S去除率达到71.34%；当发酵温度低于25 ℃或高于35 ℃时，发酵温度很大程度上影响微生物繁殖数量和新陈代谢速度，因而H₂S去除率明显降低。经方差分析可知，发酵温度对H₂S去除率的影响极显著（P<0.01）；经相关性分析可知，H₂S去除率与发酵温度呈极显著相关（r=0.954，P<0.01）。因此，除臭效果最好时最佳发酵温度为30 ℃。

2.1.4 接种量对H₂S去除率的影响

如图4所示，随接种量的增加，H₂S去除率先增大后趋于稳定。对于一定量的臭源而言，接种量过大，快速导致营养物质匮乏而缺乏竞争 ，降低了生物活性和关键生物酶的代谢，当接种量达到饱和状态时，其除臭效果保持稳定^[16]。当接种量在12.5%左右时，其除臭效果基本趋于稳定。经方差分析可知，接种量对H₂S去除率的影响极显著(P<0.01)；经相关性分析可知，H₂S去除率与接种量呈极显著相关（r=0.947，P<0.01）。因此，从成本的角度考虑，除臭效果最好时最佳接种量为12.5%。

2.2 响应面优化实验结果分析

2.2.1 Box⁃Behnken响应面优化实验结果

在单因素实验结果的基础上，利用Design⁃Expert 11.0.4软件进行Box⁃Behnken优化，以发酵时间（36、48、60 h）、发酵温度（25、30、35 ℃）、接种量（10%、12.5%、15%）为自变量，H₂S去除率（Y）为响应值，设计三因素三水平实验，实验设计与结果见表2。

2.2.2 回归模型的建立及显著性分析

利用Design⁃Expert11.0.4软件对实验数据进行多元回归拟合分析得实验因子发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）间的二次多项回归方程：

Y=71.97+1.66A+2.18B+1.60C-0.96AB+0.72AC-0.97BC-13.85A²-6.41B²-6.59C²

由表3可知，模型F值为45.57，P<0.000 1，说明该模型拟合程度达到极显著水平；失拟项P=0.080 1>0.05，该模型不失拟；对回归方程进行检验，调整模型决定系数R²_Adj=0.961 6，说明该模型能解释约96.16%响应值的变化，总决定系数R²=0.983 2，说明该模型的拟合程度较好，实验误差小；因此，该回归模型可以对H₂S去除率进行准确预测和分析。发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）对H₂S去除率均具有显著性影响（P_A=0.036 9<0.05,P_B=0.011 8<0.05,P_C=0.041 8<0.05)，显著性顺序依次为发酵温度（B）>发酵时间（A）>接种量（C）。

2.2.3 响应面不同因素间交互作用分析

根据二次多项回归方程绘制不同因素间交互作用对H₂S去除率影响大小的等高线图和响应面立体分析图，结果如图5所示。

由多元回归拟合模型可知，发酵时间（A）、发酵温度（B）、接种量（C）对H₂S去除率均有影响，结合等高线形状及疏密程度分析两因素间交互作用的强弱，等高线呈椭圆形且曲线密集说明两因素间的交互作用对响应值的影响大，反之亦然^[17,18]。

由图5（a）可知，发酵时间（A）和发酵温度（B）之间形成的等高线较稀疏，中心区域呈微椭圆形，响应面相对陡峭，说明二者的交互作用较强，对H₂S去除率的影响较大(P=0.327 5>0.05)；由图5（b）可知，发酵时间（A）和接种量（C）之间形成的等高线较稀疏，中心区域接近圆形，响应面相对陡峭，说明二者的交互作用较弱，对H₂S去除率的影响较小(P=0.454 2>0.05)；由图5（c）可知，发酵温度（B）和接种量（C）之间形成的等高线稀疏，中心区域呈圆形，响应面较平缓，说明二者的交互作用弱，对H₂S去除率的影响较小(P=0.322 8>0.05)。

2.2.4 验证实验

利用Box⁃Behnken响应面分析结果获得最优条件组合：发酵时间为48.689 h、发酵温度为30.783 ℃、接种量为12.783%，H₂S去除率可达到72.276%。根据实际操作对最优条件进行修正：发酵时间为48.5 h、发酵温度为30 ℃、接种量为12.75%，在该条件下进行三组平行实验，H₂S去除率可达到71.84%，预测值与真实值偏差为0.6%，二者具有良好的拟合性。

2.3 硫元素转化及含量动态变化

如图6所示，发酵过程中硫元素转化及含量动态变化，实验组和对照组的SO₄^2-含量均在发酵时间为30 d时达到最大，分别为57.31 mg/kg、47.52 mg/kg，即实验组的SO₄^2-含量显著高于对照组的SO₄^2-含量(P<0.05)，说明该微生物除臭剂具有促进H₂S向SO₄^2-形式转换的作用。对照组在发酵过程中，H₂S释放量呈现持续降低趋势，发酵时间为30 d时，对照组的H₂S释放量由52.54 µg/kg降低到17.36 µg/kg，降低了66.96%。与对照组相比，实验组在发酵过程中H₂S释放量显著偏低(P<0.05)，可能是因为发酵产物与H₂S发生反应将H₂S转化为单质硫或硫酸盐^[19,20]，说明该微生物除臭剂可以调节硫元素转化，有效抑制H₂S产生。

3 结 论

本文利用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌三种可食性微生物复配发酵制备微生物除臭剂，研究微生物复配比、发酵时间、发酵温度、接种量四个因素对H₂S去除率的影响。以单因素实验为基础，利用Box⁃Behnken响应面法优化最佳发酵条件，进一步研究硫元素转化及含量动态变化。结果表明酵母菌、乳酸菌、醋酸菌质量比为1∶2∶2时，各因素对H₂S去除率的影响依次为发酵温度>发酵时间>接种量，最优发酵条件为发酵时间48.5 h、发酵温度30 ℃、接种量12.75%，H₂S的去除率可达到71.84%；实验组与对照组的硫元素转化及含量动态变化相比，实验组的SO₄^2-含量显著较高(P<0.05)，H₂S释放量显著较低(P<0.05)，说明该微生物除臭剂可以调节硫元素转化，有效抑制H₂S产生。因此，本文可为微生物除臭剂的开发应用提供一定的理论基础。

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基金资助

国家自然科学基金(31860004)