铁皮石斛异胡豆苷合成酶基因STR序列结构及表达模式分析

Analysis on STR sequence structure and expression pattern of strictosidine synthetase gene in Dendrobium officinale

摘要

异胡豆苷合成酶基因STR编码吲哚类生物碱合成的关键酶异胡豆苷合成酶，并参与植物抗逆和花粉发育等生物过程。本研究通过对铁皮石斛异胡豆苷合成酶基因DoSTR的结构及特异性表达进行分析，探究其在铁皮石斛生长发育中的潜在功能。从铁皮石斛基因组数据中获得铁皮石斛异胡豆苷合成酶编码序列（DoSTRs），利用ClustalW软件进行氨基酸序列的比对，利用Gene Structure Display Server 2.0在线软件分析基因内含子和外显子结构，利用PlantCARE数据库分析基因启动子区元件；基于转录组数据和qRT⁃PCR对铁皮石斛根茎叶组织、共生与非共生生长的种子和根、冷诱导和茉莉酸甲酯诱导后叶片中的STR家族基因的表达情况进行检测和分析，从铁皮石斛基因组中预测获得10个STR成员，具有典型的“Str_synth”结构域，且启动子区存在大量顺式作用元件，涉及到茉莉酸甲酯响应和低温响应等多个生物学过程；DoSTRs基因家族不同成员表达模式存在较大差异，DoSTR3、DoSTR7、DoSTR10在叶片中的表达量高于茎和根中，DoSTR9和 DoSTR2在铁皮石斛种子萌发时显著高表达，DoSTR5和DoSTR10在茉莉酸甲酯处理早期，具有明显的上调表达趋势，推测STR家族可能参与不同的生物学过程，研究结果为深入探究铁皮石斛STR家族基因奠定了基础。

Abstract

In order to study the sequence characteristics and potential functions of Dendrobium officinale, local BLASTP was used to search the STR gene family members of D. officinale (DoSTRs) in the Dendrobium genome, and then the conserved Str_synth domain structural characteristics of DoSTRs was predicted. The sequence alignment and gene structure analysis of DoSTRs were conducted using ClustalW and Gene Structure Display Server 2.0. The PlantCARE database was used to predict cis⁃acting elements in the promoter region of DoSTRs.On the basis of transcriptome data, heat map was drawn to show the expression level of DoSTRs. Based on transcriptome data and qRT⁃PCR, the expression of STR family genes in rhizome and leaf tissues, symbiotic and non⁃cogenetically grown seeds and roots, cold⁃induced and methyl jasmonate⁃induced leaves of D.officinale was detected and analyzed. 10 STR members were predicted to have conserved Str_synth domains, and numersus cis⁃acting elements were present in the promoter region, involving multiple biological processes such as methyl jasmonate reponse and low temperature response. 6 DoSTRs showed significantly different expression levels in different tissues under different conditions. 10 members of DoSTRs may participate in different biological processes. The results provide a basis for further study of the STR gene family in D. officinale.

Graphical abstract

关键词

铁皮石斛 / 异胡豆苷合成酶 / 异胡豆苷合成酶基因家族 / 共生

Key words

Dendrobium officinale / strictosidine synthetase / STR family / symbiosis

0 引 言

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科（Orchidacea）石斛属（Dendrobium）植物，含有多种活性物质，是中国传统的名贵药用植物^[1]。石斛碱是石斛属植物重要的有效成分，属于吲哚萜类生物碱（terpenoid indole alkaloid，TIA）。异胡豆苷合成酶（strictosidine synthetase，STR）是吲哚萜类生物碱合成的关键酶，催化裂环马钱子苷和色胺进行Pictet⁃Spengler缩合反应，得到吲哚生物碱通用合成前体——异胡豆苷，异胡豆苷再经过不同途径合成不同的吲哚生物碱^[2,3]。

1997年Treimer首次从长春花悬浮培养细胞中分离并纯化得到异胡豆苷合成酶^[4]，随后在印度萝芙木（Rauvolfia serpentine）、短小蛇根草（Ophiorrhiza pumila）中也分离出异胡豆苷合成酶^[5,6]。在产吲哚生物碱的鸡蛋花亚科9个属的15种植物中证明了异胡豆苷合成酶的存在^[4]。在不产吲哚生物碱的植物中，水稻（Oryza sativa）^[7]，拟南芥（Arabidopsis thaliana）^[8]、甘蓝型油菜（Brassica napus）^[9]中也具有异胡豆苷合成酶类基因。

19世纪80年代末，从印度萝芙木中克隆得到STR1基因的cDNA，分析得知，STR1基因编码蛋白序列由344个氨基酸组成，分子量约为35.3×10^3[10,11]。随后发现STR1蛋白整体三维结构为六叶β⁃螺旋桨状，每叶由4个反向平行的β螺旋片组成^[12]；Glu⁃309是STR1重要的活性催化残基位点，通过氢键和色胺的氨基连在一起，Cys⁃89和Cys⁃101对维持该酶的三维结构具有重要作用^[13]。日本蛇根草（O. japonica）中，OjSTR在各个组织部位均有表达，其中在花中表达量最高，叶和根次之，茎中最低^[14]。短小蛇根草中，STR酶活性在茎、根和毛状根中被检测到，在叶和愈伤组织中没有检测到，其组织特异性分布和STR mRNA的表达一致^[15]。2013年在铁皮石斛中发现了两个注释为STRs的基因，且在叶中的表达量均高于其在茎中的表达量^[16]。拟南芥中鉴定出15个STR家族成员^[17]，但提取自拟南芥叶片和毛状根的蛋白不具有异胡豆苷合成酶活性^[8]。研究发现^[17]，水杨酸、茉莉酸甲酯等能够诱导拟南芥异胡豆苷合成酶类基因AtSSL5⁃7表达，推测其在植物抗逆方面可能有重要作用。水稻中鉴定出21个STR⁃like家族成员，所有成员均缺乏STR1具有的催化位点Glu⁃309残基；不同成员的表达模式存在差异，同时试验证明，OsSTRL2在水稻花药发育和花粉壁形成中有重要作用，可能是一个非典型的异胡豆苷合成酶^[7]。

研究发现，在铁皮石斛各组织中，叶中总生物碱的含量最高，其次是茎、根、花^[18]。铁皮石斛独特的石斛碱及其功效使之具有较高的研究价值，但对铁皮石斛吲哚生物碱合成关键酶STR家族的研究较少。本文利用铁皮石斛基因组数据，对铁皮石斛STR家族进行生物信息学表达分析，为石斛碱和STR家族的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

铁皮石斛基因组数据^[19,20]。SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）数据库：HTTP://smart.embl Heidelberg.de。pfam数据库：http://pfam.Xfam.org/。氨基酸序列分析软件MEGA6.0、ClustalW（www.ebi.ac.uk/Clustalw)，基因结构分析软件：Gene Structure Display Server 2.0，热图绘制：HemI1.0，启动子预测数据库：PlantCARER（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。

1.2 方法

1.2.1 铁皮石斛DoSTR基因家族预测

下载铁皮石斛全基因组蛋白编码序列^[19,20]到本地，利用水稻OsSTRL2（LOC_Os03g15710）和印度萝芙木RsSTR（GenBank登录号P68175）蛋白序列在铁皮石斛蛋白序列文件中进行BLASTP比对搜索（设置缺省参数），手动去除错配序列，获得候选铁皮石斛DoSTR家族蛋白序列。

1.2.2 DoSTR家族蛋白保守结构域分析

将BLASTP比对获得的潜在的DoSTRs蛋白序列文件保存为FASTA格式，利用SMART和Pfam数据库验证DoSTRs蛋白序列的保守结构域“Str_synth”（PF03088.9）及可能的保守功能位点（设置缺省参数）。利用ClustalW软件对具有STR保守结构域的蛋白序列进行多重比对与校正，并手动标记结构域特征位点。

1.2.3 DoSTR家族基因结构及启动子预测

通过在线Gene Structure Display Server 2.0软件分析铁皮石斛DoSTR基因内含子及外显子结构，设置缺省参数。使用PlantCARE数据库预测铁皮石斛DoSTR基因启动子区域顺式作用元件，预测区域为起始密码子前1 700 bp序列。

1.2.4 DoSTRs基因表达模式分析

① DoSTRs基因在共生与非共生萌发种子中表达模式分析。采集正常生长的四年生铁皮石斛苗成熟种子（中国林业科学研究院科研温室）^[21]，按照Scott的方法进行播种^[22]，分别进行体外共生和非共生萌发试验。一组种子用来构建与美孢胶膜菌（Tulasnella calospora，ITS序列GenBank登录号：GU166418.1）^[23]体外共生萌发体系（DoTc），另一组种子进行体外非共生萌发到相同阶段（Do），两组试验分别设置三组生物学重复。在显微镜下观察种子萌发情况，利用Zhao^[24]的方法判断共生体系的建立，选取萌发到第四阶段（第一片真叶出现）的共生和非共生种子，液氮速冻，超低温保存，提取RNA，分别用于转录组测序和qRT⁃PCR试验基因表达分析。

将转录组测序获得的STR家族基因reads数^[25]进行标准化处理得到基因表达的RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）值，然后取对数log₂值，使用HemI1.0^[26]软件绘制DoSTRs基因表达热图。设置|log₂（Fold change）|>1（P<0.01)作为基因差异表达筛选条件^[27]，分析DoSTRs基因在共生与非共生萌发的铁皮石斛种子中的表达情况。

② DoSTRs基因在共生与非共生根中表达模式分析。选取生长状况良好的铁皮石斛无菌幼苗（高7~8 cm）与上述美胞胶膜菌建立共生体系，同时设置非共生对照组。待3个月后，分别取共生和非共生试验组幼苗的根，通过徒手切片然后镜检的方法在共生处理的根内检测到共生真菌菌丝，非共生对照组的根内未检测到真菌菌丝。重新分离纯化共生根内真菌，对其ITS序列进行PCR扩增和Sanger测序，并与GenBank登录的ITS序列GU166418.1进行比对，结果序列100%相同，确认与铁皮石斛幼苗共生的真菌是试验用美胞胶膜菌菌株。分别取相同状态的共生根和非共生根液氮速冻后储存在-80℃冰箱备用，设置3组生物学重复。同时自然生长于中国林业科学研究院科研温室的四年生铁皮石斛苗根、茎、叶3个组织部位，液氮速冻后储存在-80℃冰箱备用，设置三组生物学重复。

③ DoSTRs基因在非生物胁迫条件下表达模式分析。选取同一生长环境条件下的株高15 cm的二年生铁皮石斛幼苗，分别进行冷诱导和茉莉酸甲酯诱导处理，以未处理的幼苗作为对照。对铁皮石斛幼苗进行4 ℃冷诱导处理，取冷诱导后2 h，6 h，10 h的叶片，液氮速冻后储存在-80℃冰箱备用。使用100 μmol/L的茉莉酸甲酯浇灌幼苗，每次浇灌100 cm，取茉莉酸甲酯处理后2 h，6 h，10 h的叶片，液氮速冻后储存在-80℃冰箱备用。同时取正常培养的对照组幼苗叶片，液氮速冻后储存在-80℃冰箱备用。每组设置3个生物学重复。

使用艾德莱生物EASYspin Plus多糖多酚复杂植物RNA快速提取试剂盒分别提取铁皮石斛共生、非共生种子和根的RNA；铁皮石斛组培幼苗根、茎、叶部位的RNA；冷诱导与茉莉酸甲酯处理的铁皮石斛叶片的RNA。使用TIANScript RT Kit试剂盒反转录合成cDNA第一条链，并以cDNA为模板进行引物筛选和实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）分析。RNA提取和反转录具体试验步骤见各试剂盒说明书；荧光定量PCR预混液使用TIANGEN FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)，反应体系及程序见说明书。使用2^-△△ct计算每个基因的相对表达量。

引物筛选体系如下：模板1 µL；Taq(1 U/µL) 0.2 µL；10×Buffer 2 µL；dNTP (2 mmol/L) 1.6 µL；ddH₂0 14.6 µL；正反向引物0.3 µL。引物筛选PCR程序为：94 °C预变性3 min；94 °C变性30 s，58 °C退火30 s，72 °C延伸反应1 min，循环35次；终延伸72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳筛选引物，选取片段长度合适，特异性好的引物。qRT⁃PCR试验设置3个生物学重复和3个技术重复。

2 结果与分析

2.1 STR家族生物信息学分析

利用BLASTP搜索比对工具从铁皮石斛蛋白数据库中找出与OsSTRL2和RsSTR相似度较高的序列（E⁃value<0.001），经过SMART预测和Pfam数据库比对两种方法验证，10条STR蛋白序列（DoSTRs）含有“Str_synth”结构域，分别命名为DoSTR1~DoSTR10（表1）。

10个DoSTRs蛋白氨基酸序列长度为212~413 aa，包含4~6个β⁃螺旋结构（图1红色区域），其中DoSTR1、DoSTR3、 DoSTR5和DoSTR9可能有6个β⁃螺旋，DoSTR2、DoSTR6和DoSTR10可能有5个β⁃螺旋，DoSTR4，DoSTR7和DoSTR8有4个β⁃螺旋，β⁃螺旋数量的不同可能会导致蛋白功能的差异。DoSTR1~DoSTR6含有形成二硫键的Cys⁃89位点和Cys⁃101位点（图1绿色区域），DoSTR7~DoSTR10不含该位点或只有一个半胱氨酸残基位点。研究表明印度萝芙木中Glu⁃309是重要的活性催化位点^[13]，图1中红色字体是印度萝芙木Glu⁃309位点，产吲哚生物碱的夹竹桃科印度萝芙木、萝芙木、长春花的序列在此位点附近非常保守，而铁皮石斛内STR蛋白序列在Glu⁃309位点附近差异较大，推测铁皮石斛的谷氨酸关键催化残基位点可能存在差异。

对铁皮石斛DoSTR家族基因序列进行分析，绘制其内含子和外显子结构图，结果如图2所示。DoSTRs基因结构差异较大，内含子数量为1~4个，其中DoSTR9内含子数量最多（4个），DoSTR8仅包含有1个内含子。不同基因间内含子序列长度差异较大。

通过铁皮石斛基因组序列^[19]获取铁皮石斛DoSTR家族9个基因的启动子区序列，并对启动子区域的顺式作用元件进行预测和可视化分析(图3)。如表2所示，DoSTR家族启动子区域含有多种顺式作用元件，除CAAT⁃box和TATA⁃box外，存在37种顺式作用元件，其中有6种涉及到胁迫响应，5种涉及到激素响应，18种涉及到光反应响应，5种涉及到组织特异性表达等，DoSTR家族成员可能由多因素调节参与铁皮石斛生命活动调控。在长春花生物碱次生代谢转录调控研究中发现，AP2/ERF家族转录因子ORCA能够通过茉莉酸甲酯诱导，结合到STR启动子区域JERE区域，激活STR的表达^[28]。9个DoSTRs基因均包含茉莉酸甲酯响应的顺式作用元件，数量由不等，DoSTRs基因的表达可能受茉莉酸甲酯诱导。

2.2 铁皮石斛STR家族基因表达分析

2.2.1 STR基因在共生与非共生组织中差异表达分析

为探究DoSTR家族基因在共生与非共生萌发铁皮石斛种子中的表达情况，基于转录组数据筛选获得7组STR家族差异表达数据，并使用HemI1.0软件绘制基因表达热图（图4）。结果显示，DoSTR家族不同成员在共生与非共生萌发铁皮石斛种子中的表达模式存在差异。在非共生萌发种子（Do）中，DoSTR9表达量最高，DoSTR10表达量最低。在共生萌发种子（DoTc）中，DoSTR9表达量最高，DoSTR7表达量最低。DoSTR9和DoSTR2在共生和非共生萌发种子中表达量相对其他成员均处于较高水平，但基因表达差异不显著。DoSTR10在共生萌发种子中显著上调表达（>5⁃fold），而DoSTR7在共生萌发种子中显著下调表达，其他基因在共生萌发的种子中表达量虽下降但差异不显著。铁皮石斛种子与美孢胶膜菌的共生萌发可能显著促进DoSTR10基因的表达，同时显著抑制DoSTR7基因的表达，推测DoSTR10和DoSTR7基因可能参与铁皮石斛种子与美孢胶膜菌共生萌发过程调控。

以铁皮石斛共生和非共生萌发的种子、共生和非共生根为材料，利用荧光定量PCR筛选获得6组特异性较好的qRT⁃PCR引物（表3），并以18s rDNA为内参基因^[29]，进行qRT⁃PCR实验，分析DoSTR家族成员在铁皮石斛与美胞胶膜菌共生和非共生体系中的表达情况。试验结果显示，在共生萌发种子中DoSTR10基因显著上调表达，DoSTR2，DoSTR5，DoSTR7和DoSTR8基因则显著下调表达（图5），与转录组数据分析结果呈现不同的表达差异倍数，但表达趋势一致。相对于在非共生根中的表达量，DoSTR10基因在共生根中上调表达，而DoSTR2、DoSTR5、DoSTR7、DoSTR8基因在共生根中则下调表达，其中DoSTR5、DoSTR7、DoSTR8基因在共生根中显著下调表达。

2.2.2 DoSTR基因在不同组织中的表达分析

以四年生铁皮石斛苗根、茎、叶组织为材料，以18s rDNA为内参基因（表3），进行qRT⁃PCR试验，分析DoSTR家族成员在不同组织中的表达情况。试验结果如图6所示，DoSTR3、DoSTR7和DoSTR10基因在叶中的相对表达量较高，DoSTR2和DoSTR5基因在根中的相对表达量较高，DoSTR8基因在茎中的相对表达量较高。

2.2.3 冷胁迫和茉莉酸甲酯诱导下DoSTR基因在叶片中的表达

为进一步探究STR基因家族的功能分化，对同一生长环境下株高15 cm的二年生铁皮石斛幼苗进行冷胁迫和茉莉酸甲酯诱导，对处理后2 h、6 h、10 h叶片中DoSTR2、DoSTR3、DoSTR5、DoSTR8、DoSTR10基因的表达情况进行荧光定量分析。结果如图7所示，与未处理的对照组相比，低温胁迫下叶片中DoSTR10的相对表达量随着处理时间的延长逐渐增加，而DoSTR3的相对表达量随着处理时间的延长逐渐下降，DoSTR2和DoSTR5的相对表达量呈现先增加然后下降的趋势。在茉莉酸甲酯处理下，DoSTR2，DoSTR5和DoSTR10的相对表达量呈现先上调然后下调表达的趋势，而DoSTR3和DoSTR8的相对表达量随着处理时间的延长逐渐下调。

DoSTR8、DoSTR10启动子区域具有低温响应元件LTR，但两者在低温下的表达趋势分别为下调和上调。DoSTR3、DoSTR5、DoSTR8、DoSTR10基因启动子区具有茉莉酸甲酯响应的元件，试验表明DoSTR5和DoSTR10能够受到茉莉酸甲酯的诱导，而DoSTR8的表达具有下调的趋势。推测不同DoSTR基因的表达调控存在差异，同时进一步证明了DoSTR家族的功能存在分化。

3 讨 论

本研究在铁皮石斛全基因组范围内预测获得10个可能的DoSTR家族成员。在其他植物长春花、拟南芥、水稻中分别有6、14、21个成员^[4,7,8]，研究者在动物和微生物中也发现了STR家族的存在^[9,10]。STRs可能是一个古老而保守的基因家族，序列比对发现植物中STRs序列具有高度保守性，在长期进化过程中出现功能位点的变异和分化。

本研究预测获得的DoSTRs序列长度为212~413个氨基酸，预测其三级结构主要由4~6个β⁃螺旋组成，序列的完整性可能影响β⁃螺旋数量。Glu⁃309是STR1蛋白的重要活性催化残基位点，Cys⁃89和Cys⁃101对维持该酶的三维结构具有重要作用^[14]。石斛碱是铁皮石斛重要的活性成分，相应的DoSTR家族中具有能够催化石斛碱生物合成作用的成员，对铁皮石斛具有催化作用DoSTR蛋白的确定及相应三维结构的确定需要进一步研究。

异胡豆苷合成酶作为萜类吲哚生物碱合成过程中的关键酶，其组织表达模式可能对植物的组织建成和生长发育起重要作用。已有研究表明，水稻OsSTRL2基因在花粉发育和花粉壁形成过程中起着关键作用^[7]，甘蓝型油菜BnSTR基因的功能可能与花瓣的发育有关^[9]；拟南芥AtSTR可能和拟南芥种子的成熟有关^[7]。DoSTR家族成员启动子分析也发现，DoSTR启动子区存在4种顺式作用元件分别与分生组织、胚乳、种子特异性表达相关，推测DoSTR可能在不同组织中发挥调控功能，参与铁皮石斛的生长发育。

铁皮石斛根、茎、叶等不同组织中，叶片中石斛碱含量最高^[18]。本研究发现，DoSTR3、DoSTR7、DoSTR10在叶中的表达量相对于其他组织较高，推测其可能参与铁皮石斛石斛碱的生物合成。同时发现DoSTRs基因在铁皮石斛与美胞胶膜菌共生的根与萌发种子中显著上调或下调表达，表明DoSTR家族基因可能以不同的调控模式参与铁皮石斛种子共生萌发过程和菌根共生生物学调控。DoSTR5和DoSTR10基因启动子区具有茉莉酸甲酯响应元件，茉莉酸甲酯处理早期，DoSTR5和DoSTR10基因在铁皮石斛幼苗中能够响应外源茉莉酸甲酯信号，呈现明显的上调表达趋势。

STR是萜类合成的关键酶之一，在植物次生代谢的调控网络中具有重要作用。通过基因表达分析和启动子预测，推测DoSTR成员可能参与除生物碱合成的其他生物过程，并受到激素、逆境等多重调控，但目前对铁皮石斛DoSTR家族及其调控机制的研究较少。随着多组学研究和分子生物学的发展，深入挖掘DoSTR的不同功能及其调控机理有助于铁皮石斛碱调控机理研究和植物次生代谢调控研究。

4 结 论

STR基因分布广泛，具有典型的催化吲哚萜类生物碱合成关键酶作用，同时在不产生物碱的植物中，STR基因在花发育等过程中具有重要作用。本文预测得到铁皮石斛10个DoSTR家族基因，对比其他植物发现STR序列具有高度保守性，但DoSTR成员间的结构和表达模式存在差异，可能产生功能的分化。DoSTR家族基因启动子区具有多种抗逆、光反应、激素响应等顺式作用元件，除了参与石斛碱的生成，还可能参与复杂的植物调控网络。本文对铁皮石斛中DoSTR家族进行初步探究，为DoSTR家族的研究提供参考，同时DoSTR成员的不同功能及其调控机制需要进一步的探究和验证。

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基金资助

中国林业科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目子课题(CAFYBB2019ZA001)

北京市植物园科技课题(BZ201901)