特色香料作物油樟叶内生Bacillusvelezensis YZ12的鉴定及拮抗病原菌活性

Identification and antagonistic activity of an endophytic strain Bacillusvelezensis YZ12 isolated from Cinnamomum longepaniculatum leaves

摘要

植物内生菌关系到植物的健康生长，且与植物产生的相关功效产物紧密关联。以我国四川宜宾油樟叶片分离筛选得到的内生细菌作为研究对象，利用传统微生物培养方法，基于形态学观察,16S rRNA和gyrA基因系统发育分析的多相分类学方法，将其鉴定为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）；并通过对从油樟叶片中分离的油樟真菌YZP⁃01以及常见植物病原真菌绳状篮状菌（Talaromycesfuniculosus）、拟轮枝镰孢菌（Fusariumverticillioides）、草酸青霉（Penicilliumoxalicum）四种致病菌株进行了拮抗试验，发现了该菌株具有广谱且良好的拮抗病原菌活性。使用特定引物扩增功能基因（bioA，bmyB，ituC，fenD，srfAA，srfAB，yngG和yndJ），并成功从菌株YZ12中扩增出这些基因。

Abstract

Endophytic bacteria are related to the healthy growth of plants, and are closely related to the efficacy products produced by plants. In this study, the endophytic bacteria isolated from the leaves of Cinnamomumlongepaniculatum in Sichuan Province of China were used as research objects, and strain YZ12 was identified as Bacillusvelezensis by traditional microbial culture methods，polyphasic taxonomy based on morphological identification, 16S rRNA and gyrA gene phylogenetic analysis. Antagonistic testing was carried out against the four pathogenic strains, the strain YZP⁃01 isolated from the leaves of Cinnamomumlongepaniculatum, Talaromycesfuniculosus, Fusariumverticillioides, and Penicilliumoxalicum, and it was found that the strain YZ12 has a broad spectrum and good antagonistic pathogen activity. Biological functional genes bioA, bmyB, ituC, fenD, srfAA, srfAB, yngG and yndJ were amplified using specific primers, and they were found in the endophytic bacterium Bacillusvelezensis YZ12 strains.

Graphical abstract

关键词

油樟叶片 / 内生细菌 / 贝莱斯芽胞杆菌YZ12 / 分离 / 鉴定 / 拮抗 / 生防菌

Key words

Cinnamomum longepaniculatum leaf / endophyte / Bacillusvelezensis YZ12 / isolation / identification / antagonistic activity / biocontrol bacterium

0 引 言

油樟(Cinnamomum longepaniculatum)为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）植物，由于全国约65%的油樟产于四川宜宾，又被称为“宜宾油樟”，是一种中国特有的高大常绿阔叶乔木，具有生长快、木制优良、抗病害等特点，及独特的药用价值^[1]。国内外已有许多关于油樟药理活性的科学研究，如抗菌、抗炎、抗镇痛、抗氧化、抗癌等活性，另外目前国外也开展了抗抑郁、抗焦虑、改善免疫功能等方面的研究^[2~4]。由于油樟的根、木、叶、树皮、果实等都具有一定的利用价值，目前已经被广泛应用于国防、轻工、医疗、香料、日化等多个领域中。油樟作为我国重要的香料作物，具有非常高的经济价值^[5]。

植物内生菌是一种微生物共生体，能够在植物组织中定殖且生命周期的大部分时间都生活在植物体内并与植物和谐共生，不会引发其宿主植物实质性病害，可以产生具有特殊生物活性的次级代谢产物，能够帮助植物抵抗病害，促进植物健康生长^[6,7]。受植物内生菌在次生代谢物合成和转化的启示，香料植物内生菌在天然香料的合成及制备中的作用和应用也成为研究热点，油樟作为重要的香料作物也越来越受到研究者的关注^[8]，目前关于油樟的众多报道主要集中在油樟精油的提取加工^[9,10]、其活性物质的研究^[11]、油樟优良繁殖和栽培技术的研究^[12]、以及樟脑的开发利用方面，而关于对油樟具有重要潜在影响的内生菌的研究较少，且集中在内生真菌，如游玲等^[13]研究了油樟内生真菌对植物病原真菌的抑制作用，谭韵雅等^[14]研究了油樟油对油樟内生真菌中活性化合物的影响，张萍^[15]等对油樟内生菌分布差异进行了研究；对油樟内生细菌的研究则相对较少，冯瑞章等^[16]筛选油樟内生溶磷细菌，并探索该类菌的促生和抗逆性能。开展油樟内生细菌的研究，对油樟生产以及油樟产地的经济发展极为重要。

本文利用微生物培养的方法分离纯化油樟叶片内生细菌，在30 ℃条件下，在LB琼脂上一些细菌菌株周围48 h出现抑菌圈。由此初步得出结论，这些细菌可能具有生物拮抗活性。本研究以四川宜宾油樟叶片分离筛选得到的内生细菌作为研究对象，对其进行分类鉴定及其生防菌资源进行挖掘与评价，旨在为进一步了解其生物功能机制，挖掘开发相关生物防治菌剂奠定微生物基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株YZ12

菌株由本课题组采集自，北纬28.47 °，东经104.59 °（中国四川省宜宾市高县月江森林经营所）的油樟叶片中分离获得，并于本实验室4 ℃保存。

1.1.2 培养基及试剂

LB培养基、TSA培养基、R2A培养基与PDA培养基：北京陆桥技术股份有限公司；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) Mix、脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA) Marker：北京全式金生物技术公司；细菌基因组提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物由北京诺赛生物公司合成。

1.1.3 仪器设备

FTC⁃300P型实时荧光定量PCR仪：加拿大 Funglyn Biotech公司；GelDoc EZ型凝胶成像系统：美国Bio⁃rad公司；DYY⁃8C型电泳仪：北京六一生物科技有限公司；BPH⁃9402精密恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；VS⁃840⁃1超净工作台：上海博迅实业有限公司；YX⁃280A手提式压力蒸汽灭菌器：合肥华泰集团有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油樟叶片内生细菌的分离与纯化

先用无菌水清洗油樟叶片，再用无菌水冲洗5~7次，然后在无菌滤纸无菌条件下晾干，同时取最后一次淋洗水120 μL涂于LB固体平板上，28 ℃恒温培养72 h，检测油樟叶片表面灭菌效果。在超净工作台将表面彻底灭菌的油樟叶片用无菌研钵研磨成粉末，然后取1 g样品于15 mL离心管，加10 mL无菌水，采用梯度稀释法制备稀释倍数为1×10^-1、1×10^-2的系列稀释液。分别取稀释梯度为1×10^-1和1×10^-2的稀释样品100 μL涂布于LB、TSA、R2A平板上，每个处理组设置3个平行，30 ℃培养3 d后根据菌落的形态根据平板上菌落的形态(表面光泽度、透明度、大小、颜色、形状、边缘整齐度等)随机挑取具有代表性的单菌落，纯化后4 ℃保存备用。

1.2.2 形态学观察

将检测菌接种于LB固体培养基，置于30 ℃培养24 h后，观察其在LB培养基上的培养特征；并利用光学显微镜及电子显微镜进行菌体特征观察。

1.2.3 菌株YZ12的分子生物学鉴定

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取试验菌株基因组DNA，具体步骤参见试剂盒说明书，提取的基因组DNA用1.0%的琼脂糖进行检测，由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成测序。

以基因组DNA为模板，采用16S rDNA基因扩增引物27F(5'⁃AGAGTTTCATCTGGCTCAG⁃3')和1492R(5'⁃GGTTACCTTGT⁃TACGACTT⁃3')以及gyrA基因扩增引物BS⁃gyra⁃f(5'⁃CAGTCAGGAAATGCGTACGTCTT⁃3')和BS⁃gyrA⁃R(5'⁃CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT⁃3')。PCR反应体系(50 μL): DNA模板3 μL、10×buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL、Taq酶(5 U/L)0.25 μL、引物27F(10 mmol/L)1 μL、引物1492R(10 mmol/L)1 μL，最后用ddH₂O补足至50 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸1.5 min，30个循环后72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。将测序得到的结果在EZbiocloud数据库中进行比对，确定与已知序列同源关系，对YZ12及其若干近缘种16S rRNA基因和gyrA基因序列进行多序列比对^[17]，并上传获得序列号，在EzTaxonserver2.1中进行比对分析^[18]，以确定其与模式菌种的同源关系，并下载各模式菌种的有效序列。利用CLUSTAL_Xv1.8对菌株YZ12及其若干近缘种的16S rRNA基因和gyrA基因序列进行比对与长度均一化处理^[19]，并利用N⁃J法通过MEGA5软件进行系统发育及分子进化分析^[20]。

1.2.4 功能基因srfAA、srfAB、ituC、fenD、bmyB、bioA、yndJ和yngG的克隆

以提取获得的YZ12基因组DNA为模板，根据Joshi等^[21]报道的bioA，bmyB，ituC，fenD，srfAA，srfAB，yngG和yndJ基因的特异性引物分别为：2F(5'⁃TTCCACGGCCATTCCTATAC⁃3')和2R(5'⁃TTTGTCCCCTTATCCTGCAC⁃3')，BMBF2(5'⁃TGAAACAAAGGCATATGCTC⁃3')和BMBR2(5'⁃AAAAATGCATCTGCCGTTCC⁃3')，ITUCF1(5'⁃TTCACTTTTGATCTGGCGAT⁃3')和ITUCR3(5'⁃CGTCCGGTACATTTTCAC⁃3')，FNDF1(5'⁃CCTGCAGAAGGAGAAGTGAAG⁃3')和FNDR1(5'⁃TGCTCATCGTCTTCCGTTTC⁃3')，SRFAF1(5'⁃GAAAGAGCGGCTGCTGAAAC⁃3')和SRFAR1(5'⁃CCCAATATTGCCGCAATGAC⁃3')，110F(5'⁃GTTCTCGCAGTCCAGCAGAAG⁃3')和110R(5'⁃GCCGAGCGTATCCGTACCGAG⁃3')，135F(5'⁃GAACTGTCCGAAACATGTCCG⁃3')和135R(5'⁃CTGAGCTCTTGAACGGTCCGG⁃3')，147F(5'⁃CAGAGCGACAGCAATCACAT)和147R(5'⁃TGAATTTCGGTCCGCTTATC⁃3')进行扩增内生菌株YZ12的脂肽抗生素生物控制基因。20 μL PCR反应体系：1.6 μL DNA模板，10 μL 2 × Taq PCR Master Mix，引物各0.8 μL，ddH₂O 6.8 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，65 ℃复性45 s，70 ℃延伸2 min，35个循环后70 ℃延伸8 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖进行检测，并在凝胶成像系统中观察。

1.2.5 YZ12内生细菌拮抗病原菌实验

本研究选取的病原菌为从油樟叶片中分离的油樟真菌YZP⁃01以及本实验室保藏的常见植物病原菌绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）、拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)。所有病原菌经过两次转移培养和激发后，将10 mL无菌水加入病原菌斜面试管中；用接种针小心地刮掉孢子和菌丝，然后倒入一个无菌的装有玻璃珠的三角形烧瓶中。将病原菌在漩涡振荡器上摇动，使其分散，致成菌悬液（每毫升1×10⁶~1×10⁷个细胞），倒入300 mL马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，混匀，将培养基冷却至45 ℃分装到培养皿中，水平放置待其冷却凝固后，放置小型圆形无菌滤纸(每个容器两片)，将待检油樟叶片内生细菌菌株接入液体LB培养基中，150 r/min、30 ℃振荡培养过夜，菌悬液密度为每毫升1×10⁸~1×10⁹个细胞，取3 μL点种于病原菌培养基上，30 ℃培养12 h后，观察抑菌圈，并计算抑菌率。

抑菌率（%）=(对照菌落直径―处理菌落直径)/对照菌落直径×100%

2 结果与分析

2.1 形态学观察

菌株YZ12在LB培养基上菌落乳白色，粘液状，凸起，半透明，具有整个边缘，菌体细胞呈棒状，（3~6）μm×（15~35）μm，革兰氏阳性，芽孢为椭圆形，胞囊膨大。

2.2 菌株YZ12的分子生物学鉴定

菌株YZ12的基因组DNA提取后利用引物27f和1492r扩增得到16S rRNA基因全长序列，结果显示，PCR产物仅有一条带，大小为1 395 bp。扩增产物经测序及分析处理后，将序列信息提交至GenBank，登录号为MN429080。以嗜盐喜盐芽孢杆菌（Halobacillus halophilus） DSM2266T（HE717023）为外群，构建YZ12与相关近缘模式菌株的系统发育树（图1）。由系统发育分析可断，菌株YZ12归为芽胞杆菌属（Bacillus sp.）。

通过gyrA基因系统发育分析，序列相似性计算表明，内生菌株YZ12与芽胞杆菌KACC13105T（100%）密切相关，使用gyrA多相分类法将四川宜宾油樟叶片内生细菌YZ12进一步鉴定为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）（图2）。

2.3 功能基因srfAA、srfAB、ituC、fenD、bmyB、bioA、yndJ和yngG的克隆

对从四川宜宾油樟叶片中分离出的贝莱斯芽胞杆菌YZ12进行脂肽抗生素基因扩增。利用已报道的8对特异引物成功从该菌株中扩增出bioA(210 bp),bmyB (395 bp),ituC (575 bp),fenD (293bp),srfAA (273 bp),srfAB (308 bp),yngG (372 bp)和yndJ (212 bp)8种具有生物控制潜力的脂肽抗生素基因（图3）。

2.4 菌株YZ12的分类鉴定

通过形态学观察，16S rRNA基因序列系统发育分析，gyrA基因多相分类法鉴定及功能基因srfAA、srfAB、ituC、fenD、bmyB、bioA、yndJ和yngG的比对分析，四川宜宾油樟叶片内生细菌YZ12被鉴定为贝莱斯芽胞杆菌。

2.5 菌株YZ12拮抗病原菌的效果

通过拮抗试验，显示菌株YZ12对从自身油樟叶片中分离的油樟真菌YZP⁃01以及所选取供试的常见植物病原真菌绳状篮状菌、拟轮枝镰孢菌以及草酸青霉的拮抗圈明显，平均抑菌率分别为53.33%，80.00%，60.00%及50%，均有明显的拮抗效果，体现了菌株YZ12具有拮抗上述病原菌良好的生物学活性（图4）。

3 讨 论

与植物相联合的内生菌中已发现许多具有生防作用的细菌种类，目前已在小麦^[22]、番茄^[23]、水稻^[24]棉花^[25]等植物中分离出对植物病原微生物具有抑制作用的植物内生细菌，而截至目前，在油樟中关于具有生防功能内生菌的相关研究尚没有报道。在具有生防功能的植物内生细菌中，芽胞杆菌由于具有很强的抗逆性^[26]，是目前植物病害生物防治中应用最为广泛的细菌^[27]，生防芽胞杆菌主要有枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilies）、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）、乳杆菌（Lactobacillus sp.）、蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）、地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）等^[28~33]。本研究从油樟叶片中筛选分离的菌株YZ12经鉴定为贝莱斯芽胞杆菌。

目前，关于贝莱斯芽胞杆菌的研究越来越广泛，关于其生防功能的研究和应用则更为集中。国内外科学家已经从土壤^[34]、深海^[35]、作物^[36]等分离得到大量的贝莱斯芽胞杆菌，并通过研究发现许多贝莱斯芽胞杆菌菌株在促进植物生长、拮抗病原菌方面发挥了很重要的作用。通过研究发现贝莱斯芽胞杆菌CC09可以直接或间接损害小麦根系中病原真菌小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)的致病性，从而提高小麦的抗病能力^[37]；研究发现贝莱斯芽胞杆菌L⁃1对于梨的一些病害可以有效地防治并通过基因测序预测了次生代谢产物生物合成有关的簇，为可能的生物控制机制提供了见识^[38]；根据系统基因分析，最终确定菌株QST713为贝莱斯芽胞杆菌^[39]。分析显示，有两个集群编码具有NRPS和TransATPKS合成酶的潜在新抗菌素。贝莱斯芽胞杆菌QST713的基因组中也含有一些之前被认为参与了表面定殖和生物膜形成的基因，表现出拮抗侵占木霉(Trichoderma aggressivum)侵袭性的能力。研究发现贝莱斯芽胞杆菌BS87和RK1对尖孢镰刀菌具有很高的拮抗作用，或许具有控制草莓枯萎病的潜力^[40]。美国的一些研究人员发现，贝莱斯芽胞杆菌AH2菌株对灰葡萄孢，腐霉菌属，疫霉菌，菌核菌，青霉菌和链格孢菌都有很好的抗性^[41]。韩国科学家从韩国人参中分离出的贝莱斯芽胞杆菌G341对稻瘟病，稻鞘枯萎病，胡椒炭疽病，番茄灰霉病，小麦根腐病和大麦白粉病等植物病害具有很强的抑制作用^[42]。本研究从油樟叶片中筛选分离到一株贝莱斯芽胞杆菌YZ12，发现该菌株对绳状篮状菌、拟轮枝镰孢菌具有明显的拮抗活性，对其他一些植物病原草酸青霉也具有较好的抑制效果，其中贝莱斯芽胞杆菌YZ12 可以拮抗从其自身油樟叶片中分离的油樟真菌YZP⁃01，并显示出较为明显的拮抗效果，这为油樟病害的生物防治提供了新的微生物资源。

本研究在国内外首次对我国二级重点保护野生植物以及重要香料作物——宜宾油樟叶片内生细菌为对象，利用形态学观察，16S rDNA和gyrA基因序列分析及系统发育学分析，对其菌种分类地位进行研究，最终将油樟叶片内生细菌YZ12鉴定为贝莱斯芽胞杆菌；并通过从油樟叶片中分离的油樟真菌YZP⁃01以及多种植物病原菌作为生防对象进行拮抗试验，发现了该菌株具有广谱且良好的拮抗病原菌活性。

本研究为了解植物微生态系统中微生物与其宿主植物之间的相互作用关系提供了新的见解，对生防功能基因的分析为研究贝莱斯芽胞杆菌的代谢活性物质提供了新的线索，同时为下一步充分发挥与利用该菌株的生物学活性，促进油樟植物生长、功效性成分产生及在油樟产品相关生产过程中合理实施必要的微生物控制与强化提供了新的思路。

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基金资助

香料植物资源开发与利用四川省高校重点实验室开放基金项目(2018XLZ009)

国家自然科学基金(31700025)

生物资源副产物绿色利用宜宾学院科研创新团队(2017TD01)

中央高校基本科研业务费资助项目(FRF-TP-18-012A1)

中央高校基本科研业务费资助项目(FRF-BR-18-009B)

北京青少年科技后备人才早期培养计划项目(2020)