0 引 言
内生真菌是指一类生活史存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的真核生物
[1]。内生真菌在与宿主植物协调共生的过程中，能产生与宿主植物相同或相似的生物活性成分
[2]。植物内生真菌具有生活环境的特异性、代谢产物的多样性、丰富性和新颖性，已成为天然药物的重要来源之一
[3,4]。近年来，国内外学者从多种药用植物中分离内生真菌，并在内生真菌次生代谢产物中筛选化学物质，这些化学物质具有多种生理活性
[5,6]。植物内生真菌次生代谢的天然产物还呈现出多种生物活性，如抗菌、抗病毒 、抗寄生虫、抗肿瘤等
[7]。
薏苡（
Coix lacryma⁃jobi L）为禾本科（Gramineae）黍亚科（Subfam）薏苡属（
Coix Linn.）一年生或多年生草本植物，具有清热解毒、利尿去湿和消炎的作用，是重要的传统药食兼用植物。国内外学者对薏苡多个部位的化学成分进行了研究，得到了脂肪酸及其脂、酰胺、酚和醇、木脂素、吲哚、茚、黄酮、螺甾内酯、甾醇、三萜、多糖、腺苷和生物碱等化合物，并报道了这些化合物的多种化学成份的抗癌、抗炎活性、降糖作用、抗菌活性以及免疫调节等作用
[8,9]。在前期工作中，我们从薏苡种仁中分离到23株内生真菌并报道了其抗菌活性
[10]，同时对抗菌活性较好的茎点霉属（
Phoma sp.） GZR19号菌株的次级代谢产物进行了研究，发现该菌株产生大量的6⁃甲基水杨酸
[11]。为了发掘更多的薏苡内生真菌及其抗菌活性菌株，本研究继续对薏苡不同部位内生真菌进行分离，并筛选其抗菌活性，系统报道薏苡根、叶及种仁中的内生真菌多样性及其抗菌活性菌株，为发掘更多的薏苡内生真菌活性菌株资源，继续研究其次生代谢产物并发现具有抗生素活性的化合物成分提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料
采自贵州省黔西南州娄纳地区薏苡种植基地健康的薏苡植株。
1.1.2 试剂
琼脂粉、牛肉膏和蛋白胨( 生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司)；葡萄糖( 分析纯，天津市津北精细化工有限公司) ；青霉素、链霉素( 华北制药股份有限公司)。
1.1.3 仪器
DL⁃CJ⁃1N型超级洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；YM系列不锈钢（智能型）立式压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司）；HPX⁃9082MBE电恒温培养箱（常州市伟嘉仪器制造有限公司）；XSP⁃3生物显微镜（上海普丹光学仪器有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 薏苡内生真菌的分离
采用组织块法分离
[12]，培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) ：马铃薯去皮200 g，切成小块，蒸馏水煮沸30 min, 4层纱布过滤，收集滤液，加蒸馏水补充至1 000 mL，加葡萄糖20 g，琼脂20 g，pH自然，121 ℃高压灭菌30 min。分离培养基灭菌后待培养基不烫手时加100 U/mL青霉素和链霉素；将分离材料在自来水下冲洗2 h，在超净工作台上用无菌水将分离组织反复洗6次，切成0.5 cm×0.5 cm小块，在75%的乙醇中浸泡3 min，无菌水洗3次，用0.1%的升汞进行表面除菌2.5 min，再用无菌水洗3次，将小块的边缘除去，无菌滤纸吸干，接入分离培养基28 ℃培养7 d，待组织切口处长出菌落，根据其形态、颜色及长出时间的差异，采用尖端菌丝挑取法转接于新鲜PDA纯化培养基（无青霉素和链霉素）中培养7 d，镜检无杂菌，即获得纯化菌落。
分离材料组织表面杀菌后通过漂洗液检测法
[13]和组织印迹法
[14]作印迹对照。
1.2.2 薏苡内生真菌的鉴定
用胶带从培养7~14 d菌落的中心向边缘粘，75%的乙醇固定，乳酸石碳酸美兰染色，通过100倍油镜观察内生真菌的的显微特征，对照《真菌鉴定手册》
[15]；同时通过5.8 S ITS（特异性引物ITS4，ITS5）分子鉴定， ITS5：5’⁃GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG⁃3’，ITS4：5’⁃TCCTCCGCTTATTGATATGC⁃3’，由上海生工合成。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，最后72 ℃ 5 min。PCR产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。获得的序列在GenBank核酸序列数据库中进行相似性分析，形态特征结合分子鉴定，判定薏苡内生真菌的属别。
1.2.3 抗菌活性筛选
通过菌饼法进行抗菌筛选。指示菌株为大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis)、 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,4株指示菌株均在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）购买。将指示菌株稀释到浓度为每毫升1×106个的菌悬液。用无菌9 mm直径的试管口在酒精灯下烧热，将培养7 d的薏苡内生真菌印制菌饼备用。取100 µL指示菌菌悬液快速倒入40~50 ℃的牛肉膏蛋白胨培养基中，摇匀，迅速倒板制备含指示菌的培养基。
将制备好的9 mm直径菌饼置于含指示菌的培养基上，37 ℃培养24 h，观察抑菌圈的大小，采用十字交叉法测其抑菌圈（不含有9 mm直径菌饼）的直径，每株菌重复3次，取平均值。
2 结 果
2.1 薏苡内生真菌分离结果
2.1.1 根内生真菌分离结果
从薏苡根中分离得到37株内生真菌，收集菌体，其形态和真核生物5.8 S ITS分子鉴定结果见
表1。
如
表1所示，根据形态和分子生物学特征，薏苡根中的37株薏苡内生真菌分别属于假球壳目暗球腔菌科的弯孢属的薏苡弯孢、格孢腔菌属的不明种、链孢属的玉米链格孢菌和不明种、棘壳孢属的土栖棘壳孢菌；葫芦目葫芦科西瓜属的西瓜菌；肉座菌目生赤壳科帚霉属的粉红粘帚霉菌，虫草菌科虫草属的布氏虫草、白僵菌属的假球孢白僵菌；丛赤壳科镰刀菌属的芳香镰孢菌、镰刀孢属的芳香镰孢菌、腐皮镰刀菌以及不明种；粪壳菌科的粪壳菌属的不明种；散囊菌目发菌科篮状菌属的
Talaromyces verruculosus；小丛壳目小丛壳科刺盘孢属的毁灭炭疽菌，合计5个目8个科12个属和11个种以及不明种类。
2.1.2 叶内生真菌分离结果
从薏苡叶中分离得到的16株薏苡内生真菌，收集菌体，经过真核生物5.8 S ITS分子鉴定结果见
表2。
如
表2所示，根据形态和分子生物学特征，薏苡叶中16株内生真菌分别属于假球壳目暗球腔菌科的旋孢腔菌属的
Cochliobolus nisikadoi、平脐蠕孢属的离蠕孢属菌、小球腔菌属的
Leptosphaeria microscopica、附球菌属的黑色附球菌和
Epicoccum nigrum以及1个不明属；巨鼻目虎耳草科顶囊壳属的
Gaeumannomyces glycinicola；肉座菌目丛赤壳科镰刀菌属的禾谷镰刀菌
；小丛壳目小丛壳科炭疽菌属的不明种。合计4个目4个科7个属和1个不明属以及未知菌类。
2.1.3 种仁内生真菌分离结果
从薏苡种仁中分离得到的23株薏苡内生真菌分子鉴定结果见参考文献[
10]。
分别对76株薏苡内生真菌多样性类别进行统计，结果见
表3。
去除重复，76株薏苡内生真菌分别属于假球壳目暗球腔菌科的弯孢属、格孢腔菌属、链格孢属、棘壳孢属、旋孢腔菌属、平脐蠕孢属、小球腔菌属、附球菌属一个个不明属；葫芦目葫芦科的西瓜属；肉座菌目生赤壳科的帚霉属、镰刀菌属，虫草菌科的虫草属、白僵菌属，粪壳菌科的粪壳菌属，丛赤壳科的镰刀菌属，赤壳科玉蜀黍赤霉属；散囊菌目发菌科的篮状菌属、曲霉属；小丛壳目小丛壳科的炭疽菌属、刺盘孢属；巨鼻目虎耳草科的顶囊壳属；从梗孢目暗梗孢科的弯孢霉属、链孢属、砖孢属；球壳孢目球壳孢科的茎点霉属；蜡钉菌目暗皮皿科灰软盘菌属；壳霉目杯霉科稻黑孢属；合计10个目14个科26个属和1个不明属以及未知菌类。
其中，假球壳目暗球腔菌科在薏苡根和叶中有重复，肉座菌目丛赤壳科在薏苡叶和种仁中有重复，散囊菌目发菌科在根和种仁中有重复，小丛壳目小丛壳科在根和叶部位有分离重复；属于肉座菌目的内生真菌在薏苡根、叶和种仁中有分布。
2.1.4 部分菌落及孢子图片
从薏苡中分离的内生真菌，部分菌落图片和孢子显微结构见
图1。
2.2 薏苡内生真菌抗菌活性筛选
2.2.1 薏苡根内生真菌抗菌活性筛选
37株薏苡根内生真菌对标准菌株抗菌活性检测结果见
表4。
如
表4所示，37株薏苡根内生真菌中，有17株薏苡根内生真菌次生代谢产物对大肠杆菌有抗菌活性，其抗大肠杆菌的比例为45.9%；有20株对金黄色葡萄球菌有抗菌活性，其对金黄色葡萄球菌的比例为54.1%；有16株对枯草芽胞杆菌有抗菌活性，其抗枯草芽胞杆菌的比例为43.2%；有17株对酿酒酵母有抗菌活性，其对酿酒酵母的比例为45.9%。有9株薏苡根内生真菌对以上4种指示菌株都具有抗菌活性，分别是GG1、GG3、GG11、GG12、GG24、GG27、GG29、GG35、GG37号菌株，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母都具有抗性的比例为24.3%，这些抗性菌株分布于肉座菌目生赤壳科帚霉属，丛赤壳科镰刀孢属，粪壳菌科粪壳菌属，散囊菌目发菌科篮状菌属及2株未知菌类。
2.2.2 薏苡叶内生真菌抗菌活性筛选
16株薏苡叶内生真菌抗菌活性检测结果见
表5。如
表5所示，16株薏苡叶内生真菌中，有2株薏苡根内生真菌此生代谢产物对大肠杆菌有抗菌活性，其抗大肠杆菌的比例为12.5%；有2株对金黄色葡萄球菌有抗菌活性，其对金黄色葡萄球菌的比例为12.5%；有1株对枯草芽胞杆菌有抗菌活性，其抗枯草芽胞杆菌的比例为6.2%；有1株对酿酒酵母有抗菌活性，其对酿酒酵母的比例为6.2%；薏苡叶中分离得到的16株内生真菌中，对以上4种指示菌株均不具有抗菌活性，仅1株对对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、酿酒酵母都有抗菌活性，其比例为6.2%，属于假球壳目暗球腔菌科平脐蠕孢属。
2.2.3 薏苡种仁内生真菌抗菌活性筛选
种仁内生真菌抗菌活性筛选见参考文献[
10]。GZR11、GZR14、GZR19、GZR21号菌株对4种指示菌株都具有抗菌活性，占薏苡种仁分离菌株比例的17.39%，属于球壳孢目(Sphaeropsidales)球壳孢科(Sphaeropsidaceae)茎点霉属(
Phoma sp.)。
2.2.4 部分抑菌图片
从薏苡分离的内生真菌，部分部分抗性筛选图片见
图2。
3 讨 论
从薏苡根、叶和种仁中分离到的内生真菌，在进行纯化过程中，以菌落的形态特征为标准，初步去除了重复，并且在薏苡植株的茎、种仁外壳部位也进行了分离实验，发现其菌落特征多样性单一，与叶、根和种仁部位分离出的内生真菌重复，因此，本实验重点对薏苡根、叶和种仁部位进行了内生真菌的分离试验，旨在发现薏苡植株内生真菌的多样性。从薏苡的以上三个部位分离得到了76株薏苡内生真菌，分别属于10个目14个科26个属和1不明属以及未知菌类。刘军等
[16]在2018年报道的325株檀香内生真菌隶属于 16 个属，与其他同处亚热带或热带区域的植物内生真菌接近，高于一些北方温带地区生长的药用植物，与之相比，薏苡植株内也蕴含着较为丰富的内生真菌资源。薏苡根中内生真菌资源分布为5个目8个科和12个属及未知菌类，虽然在“目”的层次稍次于薏苡种仁中分离得到的内生真菌，但是在“科”和“属”的层次上，薏苡根内生真菌的分布远高于其他2个部位的分布情况，从一定意义上认为根中的内生真菌资源比叶和种仁中丰富，有研究表明，植物根系长期存在于土壤中，土壤中微生物丰富，根系与土壤紧密相互作用，更容易受到土壤微生物的侵染，且植物根的新陈代谢活跃，因而土壤微生物的侵染的效率更高
[17]。因此，薏苡根内生真菌丰富与它的生长特性及生理功能相关。其中，肉座菌目在薏苡根内生真菌中分布较多，有4个科和5个属，且在薏苡根、叶及种仁中都有分布，从一定意义上讲肉座菌目（Hypocreales）内生真菌在薏苡根内生真菌中占优势。另外，试验过程中，在进行内生真菌的分离和纯培养时，由于形态上去除了重复，可能存在有的薏苡内生真菌被丢失的情况，所以在薏苡内生真菌的丰度上未能很好反应，待进一步研究探索。
植物内生真菌在与植物协同进化、互利共生的过程中，能产生与植物相同或相似的化合物，且内生真菌具有生产周期短和可再生性等特征，因此，研究药用植物的内生真菌及其次生代谢产物活性成分已经成为新药开发的重要途径，为环境保护特别是药用植物资源的保护提供了有效途径
[18]。植物内生真菌给植物提供光合产物和矿物质，同时，与菌根真菌或其他微生物进行营养竞争时，会产生一些抑制其他微生物生长的“毒素”而成为竞争的优胜者，这些能产生抗菌代谢产物的菌株，对病原细菌或真菌具有抗性作用，因此这些菌株是筛选天然抗生素不可或缺的资源
[19]。此研究从薏苡中分离到的76株薏苡内生真菌，以G
-的大肠杆菌、G
+的金黄色葡萄球菌、具有特殊细胞结构休眠体的枯草芽胞杆菌以及真菌的代表酿酒酵母为指示菌株筛选其抗菌活性，这些薏苡内生真菌对大肠杆菌具有抗菌活性的占分离菌株的比例为32.9%，对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性的比例为44.7%；对枯草芽胞杆菌具有抗菌活性的比例是31.6%，对酿酒酵母具有抗菌活性，占比例为30.3%，对4种标准菌株都有抗菌活性的有13株，占总株数的17.1%，其抗性作用包括革兰氏阴性、阳性菌、具有特殊休眠体的芽胞杆菌和真菌，表明作为药食兼用的薏苡植物内生真菌蕴藏着丰富的具有筛选天然抗生素的微生物资源，众所周知，细菌在自然界中广泛分布，一些病原菌可引人体疾病以及动植物病害。人类在与病原菌对抗的过程中，病原菌的抗性也在不断增强，如肠道球菌、金黄色葡萄球菌等，因此，迫切需要寻找新型结构、疗效更显著的抗菌药物资源
[20]。通过此次报道，薏苡以其丰富的抗菌活性内生真菌，极具进一步研究和开发的价值。
此次实验直接制备菌饼接种到指示菌株中，利用菌块对峙法初步筛选薏苡内生真菌对指示菌株的抗性作用，具有直观、简便、成本低等优点，是一种体外有效筛选活性内生真菌的方法，能快速筛选出活性菌株，为进一步确定其次生代谢产物活性成分提供快速的参考依据。另外，据文献报道
[21~23]，抗菌抑制试验中对目标菌群的抗性机理是通过破坏细胞壁和细胞膜的完整性以及影响其蛋白质合成，从而导致目标菌株的死亡而形成抑菌圈。因此，其菌块对峙法中的拮抗带宽度或抑菌圈直径在一定意义上是评价抑菌活性的重要参考指标。
京公网安备11010202008535号
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