重组抗A型肉毒毒素人鼠嵌合单克隆抗体的瞬时表达及中和活性研究

摘要

为了制备重组抗A型肉毒毒素（botulinum neurotoxin A,BoNT/A）人鼠嵌合单克隆抗体并分析中和活性,以BoNT/A作为抗原筛选鼠源抗BoNT/A噬菌体单链抗体库,将筛选得到的鼠源抗BoNT/A特异性单链抗体的重链和轻链可变区分别克隆到pGP5KCγ和pGP5KCκ载体构建表达质粒。表达质粒共转染HEK-293EBNA1细胞,瞬时表达抗BoNT/A人鼠嵌合单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）。蛋白A亲和纯化mAb,分子排阻高效液相色谱（size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC）分析mAb纯度,小鼠中和试验评价mAb中和活性。结果显示,经过筛选得到4个序列正确且各不相同的抗BoNT/A单链抗体。4个抗BoNT/A人鼠嵌合mAb表达质粒均构建成功并转染HEK-293EBNA1细胞,根据转染效率指示绿色荧光蛋白的表达推测,50%～62. 5%的细胞表达抗BoNT/A抗体。表达上清经过蛋白A亲和纯化,浓度均>200μg/mL,单体纯度均>90%。小鼠中和试验显示mA1、mA2、mA3和mA4单株抗体均不能完全中和4 LD₅₀的A型肉毒毒素,但从延迟小鼠生存时间可以得出4个抗体的中和活性为mA3>mA2>mA1>mA4。mA1、mA2、mA4中任何一个抗体与mA3连用中和活性为80 LD₅₀/mg。本研究制备了4个具有不同程度中和活性的抗BoNT/A人鼠嵌合mAb,为A型肉毒神经毒素鸡尾酒疗法奠定了基础。

关键词

A型肉毒毒素 / 人鼠嵌合 / 瞬时表达 / 中和活性