重组抗A型肉毒毒素人鼠嵌合单克隆抗体的瞬时表达及中和活性研究

Transient expression and neutralization activity of recombinant anti⁃botulinum neurotoxin type A human and mouse chimeric monoclonal antibody

摘要

为了制备重组抗A型肉毒毒素（botulinum neurotoxin A，BoNT/A）人鼠嵌合单克隆抗体并分析中和活性，以BoNT/A作为抗原筛选鼠源抗BoNT/A噬菌体单链抗体库，将筛选得到的鼠源抗BoNT/A特异性单链抗体的重链和轻链可变区分别克隆到pGP5KCγ和pGP5KCκ载体构建表达质粒。表达质粒共转染HEK⁃293EBNA1细胞，瞬时表达抗BoNT/A人鼠嵌合单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）。蛋白A亲和纯化mAb，分子排阻高效液相色谱（size exclusion high performance liquid chromatography，SEC⁃HPLC）分析mAb纯度，小鼠中和试验评价mAb中和活性。结果显示，经过筛选得到4个序列正确且各不相同的抗BoNT/A单链抗体。4个抗BoNT/A人鼠嵌合mAb表达质粒均构建成功并转染HEK⁃293EBNA1细胞，根据转染效率指示绿色荧光蛋白的表达推测，50%~62.5%的细胞表达抗BoNT/A抗体。表达上清经过蛋白A亲和纯化，浓度均>200 μg/mL，单体纯度均>90%。小鼠中和试验显示mA1、mA2、mA3和mA4单株抗体均不能完全中和4 LD₅₀的A型肉毒毒素，但从延迟小鼠生存时间可以得出4个抗体的中和活性为mA3>mA2>mA1>mA4。mA1、mA2、mA4中任何一个抗体与mA3连用中和活性为80 LD₅₀/mg。本研究制备了4个具有不同程度中和活性的抗BoNT/A人鼠嵌合mAb，为A型肉毒神经毒素鸡尾酒疗法奠定了基础。

Abstract

To prepare recombinant anti⁃botulinum neurotoxin type A (BoNT/A) human and mouse chimeric monoclonal antibody and analyze the neutralization activity, BoNT/A was used as antigen for screening murine anti⁃BoNT/A single⁃chain variable fragment of antibody (ScFv) phage display library, and the variable regions of heavy chain and light chain of murine ScFv were cloned into pGP5KCγ and pGP5KCκ vectors to construct expression plasmid respectively. The expression plasmids were co⁃transfected into HEK⁃293EBNA1 cells to expressed anti⁃BoNT/A human and mouse chimeric monoclonal antibody. The monoclonal antibody was affinity purified using protein A. The purity and neutralization activity were analyzed using size exclusion high performance liquid chromatography (SEC⁃HPLC) and mouse neutralization test respectively. Due to screening, 4 anti⁃BoNT/A ScFv with correct and different sequences were obtained. Expression plasmids of the 4 human and mouse chimeric antibody were successfully constructed and transfected into HEK⁃293EBNA1 cells. According to the expression of green fluorescent protein which was used as transfection efficiency indicating protein, it was speculated that 50%~62.5% of the cells expressed anti⁃BoNT/A antibodies. The supernatant was affinity purified by protein A. The purified antibody concentration was more than 200 μg/mL, and the monomer purity was more than 90%. Mouse neutralization tests showed that single mA1, mA2, mA3, and mA4 could not completely neutralize 4 LD₅₀ of BoNT/A, but the neutralization activity was mA3>mA2>mA1>mA4 according to prolonged mouse survival time. The neutralization activity of any of the mA1, mA2 and mA4 in combination with mA3 was 80 LD₅₀/mg. Four anti⁃BoNT/A human mouse chimeric monoclonal antibodies with varying degrees of neutralization activity were prepared, laying the foundation for BoNT/A cocktail therapy.

Graphical abstract

关键词

A型肉毒毒素 / 人鼠嵌合 / 瞬时表达 / 中和活性

Key words

botulinum neurotoxin A / human and mouse chimera / transient expression / neutralization activity

0 引 言

肉毒毒素（botulinum neurotoxins，BoNTs）是自然界中毒性最强的物质，可以导致包括人类在内的所有哺乳动物、鸟类和鱼类中毒，并可能被滥用为生物武器^[1]。根据BoNTs抗原性的差异将其分为A~G共7个型，不同型之间的序列高度同源且具有相似的结构和功能^[2]。BoNTs均由一个100×10³ 的重链和一个50×10³ 的轻链组成，重链负责与神经细胞膜上的受体结合并跨膜转运，轻链为具有强效蛋白酶活性的毒性成分^[3]。BoNTs的中毒机理为毒素结合神经细胞膜上的受体并跨膜转运及活化，最后切割可溶性N⁃乙基马来酰亚胺敏感分子附着蛋白受体（soluble N⁃ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor，SNARE），由于神经肌肉接头释放乙酰胆碱离不开SNAREs，而BoNTs对SNAREs的切割导致骨骼肌麻痹，最终患者因呼吸衰竭而死亡^[4,5]。

BoNTs的7个型中A、B、E和F可以导致人类致病，其中A型肉毒神经毒素（botulinum neurotoxin A，BoNT/A）毒性最强，且因其极高的效力和持久性给医疗带来了严重的挑战，且被列为六大A类生物威胁制剂之一，因此开发安全有效的治疗药物对于防范潜在生物恐怖至关重要^[6]。目前临床中使用的马源抗毒素具有潜在病毒污染、来源受限及过敏反应等诸多缺点，所以开发一种安全、有效、可再生的重组抗毒素势在必行^[7]。本实验室采用A型肉毒类毒素免疫小鼠构建了鼠源抗A型肉毒毒素噬菌体单链抗体库，从该抗体库中筛选并构建人鼠嵌合抗A肉毒毒素抗体，为肉毒毒素抗体的开发及生物武器的防御奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

昆明小鼠由兰州生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供，实验动物生产许可证号为SCXK（甘）2012⁃0001；HEK293⁃EBNA1细胞购于北京协和细胞资源中心；抗体重链表达载体pGP5KCγ、抗体轻链表达载体pGP5KCκ、转染效率指示绿色荧光蛋白表达质粒pGP5GFPq购于无锡天演生物技术有限公司；A型肉毒毒素由兰州生物制品研究所梭菌实验室制备，毒力介于1×10⁴ LD₅₀/mL到1×10⁶ LD₅₀/mL之间；鼠源抗BoNT/A噬菌体单链抗体库由本科室构建，库容为1.2×10⁸，序列正确率为87.5%，序列覆盖了IgHV、IgKV和IgLV的优势家族。

1.2 抗BoNT/A特异性单链抗体的筛选

BoNT/A作为抗原包被免疫管对鼠源抗BoNT/A噬菌体单链抗体库进行筛选，抗体库筛选和噬菌体抗体颗粒ELISA分析方法参照文献[8]进行。第1、2、3和4轮抗原包被浓度分别为4、2、1、0.5 μg/mL，洗涤次数分别为10、20、30和40次。第4轮筛选后挑取90个克隆进行噬菌体抗体颗粒ELISA分析，阳性克隆测序分析单链抗体序列。

1.3 抗BoNT/A人鼠嵌合抗体瞬时表达质粒的构建

参照文献[9]的方法构建瞬时表达质粒，分别将4个鼠源单链抗体重链可变区克隆到已构建人抗体重链恒定区的pGP5KCγ载体中，且分别将4个鼠源单链抗体轻链可变区克隆到已构建人抗体Kappa轻链恒定区的pGP5KCκ载体中。测序验证构建的表达质粒序列是否与单链抗体序列一致。采用转染级质粒提取试剂盒提取抗体重链和轻链表达质粒。

1.4 抗BoNT/A单抗的瞬时表达

转染前24 h将HEK293⁃EBNA1细胞以每毫升5×10⁵ 个的密度接种于FreeStyle F17培养基中，置于5%CO₂摇床37 ℃，110 r/min无血清悬浮培养。转染前将细胞于25 ℃，800×g离心10 min后重悬于FreeStyle F17培养基，调整细胞密度为每毫升1×10⁷个。转染条件为每1×10⁷个细胞加6.1 μg质粒和26.7 μg PEI，其中轻链和重链质粒的比例为2∶1，并加入1/50的pGP5GFPq质粒作为转染效率指示。使用FreeStyle F17培养基将质粒及PEI分别稀释至5%待转染细胞体积，室温静置5 min后将PEI轻轻加入质粒中混匀，室温静置10 min形成转染复合物，然后将转染复合物加入细胞中。转染后的细胞于37 ℃，5%CO₂培养箱中静置1 h后加FreeStyle F17培养基将细胞密度调整为每毫升1×10⁶个，置于5% CO₂摇床37 ℃，110 r/min悬浮培养144 h。培养上清于4 ℃，12 000×g离心10 min，取上清用0.22 μm滤膜过滤。

1.5 抗BoNT/A单抗的纯化

将5 mL的HiTrap MabSelect Sure预装柱连接到AKTA Avant蛋白纯化系统相应柱位，设置流速为5 mL/min用纯化水冲洗5个柱体积，然后用20 mmol/L的PBS平衡10个柱体积，UV₂₈₀校零后按不超过30 mg/mL的载量将瞬时表达上清进行上样，接着用20 mmol/L的PBS冲洗预装柱直到基线走平，然后用20 mmol/L的乙酸钠（pH=3.5）洗脱，收集UV₂₈₀>50 mAU的洗脱峰，加入1 mol/L的Tris⁃HCL（pH=9.0）调pH至6.5左右。用纯化水冲洗2个柱体积并将预装柱保存于20%的乙醇。NanoVue超微量分光光度计测定纯化抗体的浓度。

1.6 抗BoNT/A单抗的纯度分析

将纯化后抗体用100 mmol/L PBS稀释为1 mg/mL。将SEC色谱柱TSKgel SuperSW mAb（7.8 mm ID × 30 cm）按流动相方向连接到HPLC，用100 mmol/L PBS平衡色谱柱1 h。设置流速0.7 mL/min，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量50 μL，时间20 min。将样品依次进样检测，检测完毕后以纯水冲洗色谱柱30 min，以流速0.2 mL/min换20%乙醇冲洗色谱柱30 min，最后将色谱柱保存在20%乙醇中。采用面积归一化法分析色谱图并计算单体纯度。

1.7 A型肉毒毒素毒力的测定

将A型肉毒毒素稀释成1×10⁴、4×10⁴、8×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶共六个稀释度，每个稀释度2.5 mL。选取14~16 g的昆明小鼠，每个稀释度腹腔注射4只小鼠，每只0.5 mL。观察96 h，统计结果用Reed⁃Muench法计算出A型肉毒毒素半数致死量（50% Lethal Does，LD₅₀）。

1.8 抗BoNT/A单抗中和活性的测定

取纯化抗体与4 LD₅₀的A型肉毒毒素在37 ℃中和1 h，对照组不加抗体只有4 LD₅₀的A型肉毒毒素。若为单一抗体中和，则纯化抗体使用剂量为每只50 μg；若为两株抗体连用，则两株抗体各为每只25 μg。选取14~16 g的昆明小鼠，进行小鼠腹腔注射，每只0.5 mL，每组4只，观察96 h并统计结果。

1.9 统计学方法

本研究统计分析均采用Graphpad Prism 5.0软件，小鼠生存时间比较采用Log⁃Rank检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 抗BoNT/A特异性单链抗体的筛选

共进行了4轮筛选，各轮筛选噬菌体抗体的投入量、产出量及产出率见表1。经过4轮筛选，在抗原包被浓度逐渐降低，且洗涤次数逐渐增加的前提下，噬菌体抗体共富集了3 642倍。挑取的90个克隆，ELISA分析得到72个阳性克隆，测序显示72个克隆中49个序列完全相同，通过序列比对最终得到4个序列正确且各不相同的抗BoNT/A单链抗体，命名为mA1、mA2、mA3和mA4。

2.2 抗BoNT/A人鼠嵌合抗体质粒的构建

以单链抗体为模板PCR分别扩增出4个抗BoNT/A单链抗体的重链可变区（VL）和轻链可变区（VH），目标条带均在350 bp左右且与理论值相符（图1）。构建的抗BoNT/A人鼠嵌合抗体重链和轻链表达质粒经测序验证序列均符合预期，提取的转染级质粒浓度介于1 000~1 500 ng/μL，A_{260 nm}/A_{280 nm}介于1.8~2.0。

2.3 抗BoNT/A人鼠嵌合抗体的瞬时表达

pGP5KCγ⁃VH、pGP5KCκ⁃VL及pGP5GFPq三种质粒共转染HEK⁃293EBNA1细胞，转染后24 h荧光显微镜下观察4个抗BoNT/A mAb绿色荧光蛋白表达情况（图2）。转染效率指示pGP5GFPq质粒的转染量为抗体表达质粒转染量的1/50，荧光显微镜下观察到大约1%~1.25%的细胞有绿色荧光蛋白表达，则推测50%~62.5%的细胞表达抗BoNT/A抗体。

2.4 抗BoNT/A人鼠嵌合抗体的纯化

4个抗BoNT/A抗体的表达上清经过亲和纯化，纯化图谱以mA1为例见图3所示。亲和纯化介质捕获人鼠嵌合抗体，不能被捕获的杂质出现在上样峰，被捕获的人鼠嵌合抗体经过低pH洗脱出现在洗脱峰。纯化过程不仅将抗体与其他杂质有效分离，而且将抗体进行了有效地浓缩。NanoVue超微量分光光度计测定4个抗BoNT/A抗体浓度均大于200 μg/mL。

2.5 抗BoNT/A人鼠嵌合抗体的纯度

SEC⁃HPLC将纯化的抗BoNT/A抗体的聚体、单体及不完全分子片段有效地分离（图4）。面积归一化积分显示，4个抗BoNT/A人鼠嵌合抗体的单体纯度均大于90%。

2.6 A型肉毒毒素毒力

A型肉毒毒素毒力测定结果见表2所示，A型肉毒毒素4×10⁴倍稀释时，小鼠死亡率为100%，8×10⁴倍稀释时小鼠死亡率为25%，1×10⁵倍稀释时小鼠死亡率为0%。Reed⁃Muench法计算得到A型肉毒毒素对小鼠的毒力为5×10⁴ LD₅₀/mL。Reed⁃Muench法计算得到A型肉毒素素对小鼠的毒力为5×10⁴ LD₅₀/mL。

2.7 单株抗BoNT/A人鼠嵌合抗体中和活性

通过小鼠中和试验评价4个抗BoNT/A人鼠嵌合抗体的中和活性并绘制了生存曲线，图5中A、B、C和D分别为mA1、mA2、mA3和mA4的生存曲线。mA1、mA2、mA3和mA4及对照组小鼠的中位生存时间分别为72 h、90 h、>96 h、18 h及12 h，log⁃rank检验显示χ²为12.92，P为0.012，差异具有统计学意义。mA1、mA2、mA3和mA4均不能完全中和4 LD₅₀的BoNT/A，但从延迟小鼠生存时间可以得出4个抗体的中和活性为mA3>mA2>mA1>mA4。

2.8 抗BoNT/A人鼠嵌合抗体联用中和活性

通过小鼠中和试验评价4个抗BoNT/A人鼠嵌合抗体两两联用的中和活性并绘制了生存曲线（图6）。mA1、mA2和mA4三株抗体两两组合均不能完全中和4 LD₅₀的A型肉毒毒素，但mA1、mA2和mA4中任何一株抗体与mA3联用均可以完全中和4 LD₅₀的A型肉毒毒素。计算得到mA1、mA2和mA4中任何一株抗体与mA3抗体联用的中和活性为80 LD₅₀/mg。

3 讨 论

肉毒毒素是目前所知的生物毒素中毒性最强的物质。虽然肉毒中毒的发病率低，但死亡率高，特别是肉毒毒素可能被恐怖组织利用进行恐怖袭击，因此开展肉毒中毒的免疫防治十分重要^[10]。本实验室构建了鼠源抗A型肉毒毒素噬菌体单链抗体库，其中抗体基因来源于A型肉毒类毒素免疫过的小鼠，免疫抗体库中获得的抗体特异性强亲和力高，易于筛选到A型肉毒神经毒素的中和抗体，有助于A型肉毒中毒的治疗。

本研究采用瞬时表达获得抗BoNT/A抗体进行活性分析，瞬时表达虽然难以大规模培养，但可以在短时间内获得高质量的抗体。选择无血清悬浮HEK⁃293EBNA1细胞表达抗体主要有3方面原因：①此细胞表达EB病毒的核酸抗原，转染时表达载体中加上EB病毒的复制原点Orip，可以使转染进入细胞的表达载体拷贝数增加以提高表达产量。②此细胞培养过程中不添加血清，有利于表达抗体的亲和纯化；③此细胞来源于人，相比于常用的CHO细胞其表达的抗体糖基化修饰更接近人体产生的抗体，而糖基化是影响抗体活性最重要的方面。本研究中抗BoNT/A抗体表达量均>20 μg/mL，是因为本实验室前期对此瞬时表达体系进行了DOE优化^[11]，筛选出了最佳质粒使用量、轻重链比例、PEI浓度和转染培养基，提高了抗体的瞬时表达量。

BoNT/A是一个分子量为150×10³的生物大分子，其作用机理复杂且中和表位并不单一，想要中和毒素必须封闭多个中和表位，单一抗体无法起到中和作用^[12,13]。本研究中制备的4个抗BoNT/A人鼠嵌合单克隆抗体mA1、mA2、mA3和mA4均不能完全中和4 LD₅₀的BoNT/A，只能短暂地延长小鼠的生存时间，这与文献中的研究结果相似。mA1、mA2和mA4中任何一株抗体与mA3联用均可以完全中和4 LD₅₀的A型肉毒毒素，且中和效果显著高于单株抗体中和效果，我们推测mA3可能与mA1、mA2和mA4具有不同的抗原表位。本研究中两株抗体联合使用只能中和4 LD₅₀的A型肉毒毒素，而韦娜^[14]采用3株针对BoNT/A重链不同表位的抗体联用，小鼠体内中和活性可以达到450 000 LD₅₀，未来研究中想要提高抗体的中和活性必须封闭毒素的多个抗原表位。

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基金资助

兰州市科技重大专项(2017-2-1)

甘肃省科技重大专项(1502FKDA008)