高粱SPL基因家族的鉴定及表达分析

摘要

Squamosa启动子结合类蛋白(SPL)基因家族编码一类植物特有的转录因子，其功能涉及作物遗传改良的许多方面，如产量、株型、抗逆性等，具有重要的实际应用价值。虽然SPL基因在很多作物中有广泛研究，但是在高粱中仍有待进一步探索。本研究通过生物信息学方法，利用同源序列法在高粱基因组水平对SPL基因家族进行分离和分析，共获得19个高粱SPL基因，并命名为SbSPL。高粱SbSPL家族基因不均匀地分布于高粱9条染色体上。通过系统进化树、保守结构域和基因结构等分析，将SbSPL基因家族成员分为5组，不同组的SbSPL基因在功能结构上具有保守性。此外，分析了SbSPL基因家族成员的启动子，发现SbSPL基因家族具有响应非生物胁迫相关信号转导的顺式作用元件。利用qRT⁃PCR技术，发现部分高粱SbSPL基因的表达受干旱胁迫诱导。这些结果揭示了SbSPL基因可能在高粱响应环境非生物胁迫过程中起到重要作用。

Abstract

Squamosa promoter binding protein⁃like (SPL) gene family encodes a class of plant⁃specific transcription factors, and its functions involve many aspects of crop genetic improvement, such as yield, plant type, stress resistance, and has important practical application values. Although the SPL gene has been extensively studied in many crops, it remains to be further explored in sorghum. This study used bioinformatics method to isolate and analyze the SPL gene family at the sorghum genome level using the homologous sequence method. A total of 19 SPL gene family were obtained and named SbSPL. Sorghum SbSPL family genes were unevenly distributed on 9 sorghum chromosomes. At the same time, SbSPL gene family members can be divided into 5 groups through phylogenetic tree, and conserved domain, gene structure, and the conservation of functional structure of SbSPL genes in different groups were analyzed. In addition, by promoter analysis of the SbSPL gene family, it was found that the SbSPL gene family has cis⁃acting elements in response to abiotic stress⁃related signal transduction. Using qRT⁃PCR technology, it was found that the expression of some SbSPL genes was induced by drought stress. These results reveal that the SbSPL gene may play an important role in the response of sorghum to environmental abiotic stress.

Graphical abstract

关键词

高粱 / Squamosa启动子结合类蛋白基因 / 转录因子 / 干旱胁迫

Key words

Sorghum bicolor / SPL / transcriptional factor / drought stress

Identification and expression analysis of SPL gene family in Sorghum bicolor L.

0 引 言

高粱（Sorghum bicolor L.）是禾本科（Poaceae）一年生的单子叶草本植物，是仅次于小麦、水稻、玉米、和大麦的全球第五大粮食作物^[1]，高粱对干旱、洪涝、盐碱等非生物胁迫具有良好的抗性，因此广泛分布于亚洲以及非洲。高粱应用广泛，不仅可作为粮食，在饲用、造纸、制糖以及染料制造等方面均具有良好的应用前景^[2,3]。由于全球气候变暖、人类活动等因素，全球粮食需求日益增长，而植物的生长环境逐步恶化，高粱作为效益高、抗性佳、分布广的粮食和能源作物吸引了越来越多的科研工作者的目光。2009年高粱全基因组测序工作顺利完成^[4]，这为从全基因组水平揭示高粱重要基因家族的功能奠定了良好的基础。

Squamosa启动子结合类蛋白（squamosa promoter binding protein⁃like, SPL）基因家族是植物特异性转录因子家族之一，广泛地存在于绿色植物中^[5]。Huijser等^[6]于1992年首次从金鱼草花序中克隆出含有MADS⁃BOX保守结构域的两个基因，并根据其功能将其命名为squamosa启动子结合蛋白(squamosa promoter binding protein, SBP)。四年后Klein等^[7]将这两个基因命名为SPL1和SPL2，并证明了这两个基因能够调控金鱼草的花发育以及开花过程。随后研究学者又陆续从水稻（Oryza sativa）^[8]、拟南芥（Arabidopsis thaliana）^[9,10]、玉米（Zea may）^[11]和番茄（Lycopersicon esculentum）^[12]等植物中鉴定出一些SPL家族基因。目前关于SPL基因的功能研究主要集中在拟南芥、水稻等一些模式植物中，例如AtSPL8能够通过影响GA合成以及花药发育从而调控植物开花^[13]；在拟南芥中过表达AtSPL9可以使植株的叶片数量减少、间隔期延长等^[14~17]；超表达OsSPL16D可调控水稻籽粒的形状和大小，并促进籽粒灌浆、细胞分裂^[18]；超表达OsSPL14可以增加水稻的产量、优化株型^[19,20]。此外也有研究者对其他植物的SPL基因功能进行了研究，如ZmSPB6参与调控玉米叶片的发育^[11]；GmmiR156d可在自然条件下靶向SPLs基因，负调控GmSPLs，从而延缓了大豆开花^[21]；GmSPL3和GmSPL9可以推迟开花时间、缩短生育期以及增加营养生长期^[22]。

目前，已有许多关于植物SPL基因家族的报道。例如，王婷等^[23]对三裂叶薯（Ipomoea triloba）SPL基因家族进行了研究，从甘薯二倍体近缘野生种三裂叶薯全基因组中鉴定得到了26个ItbSPL基因，并发现部分ItbSPL基因可能参与调控三裂叶薯的逆境胁迫、植物开花等过程；毛果杨（Populus trichocarpa）SPL基因家族中含有28个PtSPL基因，并且在PtSPL中发现的各种基序在AtSPL中并未发现，表明了植物SPL基因存在多样性^[24]；丹参（Salvia miltiorrhiza）SPL基因家族共含有15个SmSPL基因，并发现SmSPL，miR156和miR172在调控沙门氏菌发育时间方面具有重要作用^[25]；Zhang等^[26]在陆地棉（Gossypium hirsutum）中鉴定得到了24个GhSPL基因，高于番茄（15个）、拟南芥（16个）等物种中已鉴定的SPL基因家族的数目，并发现GhSPL3和GhSPL18能够对植株开花起促进作用。水稻，作为禾本科基因组和分子生物学研究的模式植物，对其SPL基因家族具有较为深入的研究。如Yang等^[27]在水稻中发现了19个OsSPLs基因，这些基因能够影响不同的发育过程；高表达OsSPL16/GW8能够促进细胞分裂和籽粒灌浆，并对粒形、稻米品质以及产量起到了决定性作用^[28,29]；OsSPL14揭示了调控植物架构的复杂网络^[30,31]，同时提高了谷物产量以及抗病性^[32]；Zhong等^[33]发现OsSPLs可能参与了野生水稻的光响应、植物激素响应和植物生长发育，并揭示了不同的进化速率和重复事件可能导致SPL基因每个谱系的不同进化模式。但目前未见有关于高粱SPL基因家族的鉴定与功能分析。

在本研究中，运用生物信息学的方法共鉴定出19个高粱SbSPL基因家族成员，并进行系统性的分析，包括基因结构，染色体定位，顺式作用元件分析和表达模式分析等，这些数据为高粱SbSPL基因家族的进化关系和生物学功能研究提供了有用信息。

1 材料和方法

1.1 高粱SbSPL家族基因序列的获得

水稻和拟南芥SPL蛋白的序列分别来源于RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)和TAIR(https://www.arabidopsis.org/)。利用隐马尔可夫模型（hidden Markov models，HMM）程序文件，构建了5个HMM文件，分别为：SPL_1、SPL_2、SPL_3、SPL_4和SPL_5。利用这些文件去检索从Phytozome(http://www.phytozome.net/sorghum)数据库下载的高粱基因组蛋白数据。然后，利用Pfam (http://pfam.xfam.org)数据库鉴定初筛结果中含有各分组特征结构域的蛋白序列，并将其确定为高粱SPL基因家族成员之一。利用ProtParam tool预测蛋白质的分子量(molecular weight, MW)、等电点(isoelectric point, pI)等。利用Map Gene 2 Chromosome (http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0)网站和GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)网站分别进行染色体定位和基因结构作图。

1.2 高粱SbSPL基因家族进化树分析

通过ClustalW软件对高粱、拟南芥和水稻SPL蛋白进行多序列比对，参数为默认值。用MEGA7.0软件采用邻接（neighbor⁃joining）法构建系统进化树，bootstrap重复值设置为1 000。

1.3 高粱SbSPL家族基因启动子分析

选取SbSPL家族基因起始密码子上游2 000 bp作为启动子候选序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/)网站进行分析，筛选并保留与干旱、热胁迫、冷胁迫和激素等相关的顺式作用元件，并导出数据加以分析。

1.4 高粱ABA响应基因的获得与表达分析

通过同源序列法，搜索获得高粱基因组中与ABA响应相关基因，然后在MOROKOSHI:Sorghum transcriptome database（http://sorghum.riken.jp/）中搜索并下载这些ABA相应基因的表达数据，并用TBtools生成热图。

1.5 高粱种植与干旱处理

本研究中所用高粱品种为Btx623，由重庆农科院特色作物研究所提供。选取大小一致、饱满新鲜的高粱种子，用8%的次氯酸钠消毒10 min后，用去离子水清洗3次，放在灭好菌的1/2 MS固体培养基上，放入培养箱中发芽，温度为28 ℃，光照强度为 20 000 lx。待高粱幼苗萌发成苗后，移取长势相当的幼苗到营养基质（m_营养土∶m_蛭石为1∶2）中，温室环境下（28 ℃）继续生长至高粱三叶期。

将10%的聚乙二醇6000（PEG6000）和水分别作为模拟干旱处理的实验组和对照组对高粱幼苗进行浇灌处理，分别于处理后的0、4、6和8 d取高粱叶片，每次取3株不同植株，实验重复3次，所取叶片利用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.6 RNA提取、反转录和qRT⁃PCR分析

取0.5 g叶片样品抽提RNA，本实验使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab, Beijing, China, RN09)提取高粱叶片总RNA。RNA含量使用Nanodrop2000超微量分光光度计进行测定。每个样品取2 μg RNA，首先用不含RNase的DNase⁃I处理以除去基因组DNA，然后使用重组M⁃MLV逆转录酶(Takara, Da⁃lian, China)来反转录获得相应cDNA。采用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(Vazyme, Nan⁃jing, China)来进行实时荧光定量PCR (qRT⁃PCR)分析，实时荧光定量PCR在CFX96 Thermo⁃cycler(BIO⁃RAD，USA)上进行，反应在含有5 μL稀释的cDNA，200 nM基因特异性引物和10 μL hamQ SYBR Color qPCR Master Mix的20 μL体积中进行。反应条件如下：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，共40个循环。实验以高粱肌动蛋白基因（Actin）作为内参，每个样品进行3次重复。用于SbSPL基因的qRT⁃PCR分析的引物对见表1。

1.7 统计分析

使用Excel 2013和SPSS软件处理所有数据，结果为3次重复实验的平均值，并依据数据计算相应标准差和显著分析。

2 结果与分析

2.1 高粱SbSPL基因家族成员鉴定和保守域检测

为了获得潜在的高粱SbSPL基因家族成员，我们根据已分组的拟南芥的16个SPL蛋白序列分别构建了5个隐马尔可夫模型（HMM）文件，并利用这些HMM文件去检索高粱基因组蛋白数据库sorghum bicolor V3.1.1（protein_primary），后续利用Pfam数据库对初步检索出的结果进行保守结构域的确定，从而在高粱基因组中鉴定出19个SbSPL基因,根据保守结构域的不同将其分为5组，分别为SPL_1、SPL_2、SPL_3、SPL_4和SPL_5，并结合SbSPL基因染色体位置信息依次命名（表2）。分析发现，SbSPL蛋白等电点（pI）的范围从10.05到5.29；蛋白分子量从21.47×10³到122.21×10³（表2），最长的SbSPL15含有1 119个氨基酸，而最短的SbSPL4只有215个氨基酸。

2.2 高粱SbSPL基因家族的结构特征

为了探索高粱SbSPL基因结构的多样性，我们分析了19个高粱SbSPL基因的外显子与内含子的结构分布情况（图1）。结果显示，高粱SbSPL基因家族外显子数量有2、3、4、10和11五种类型，其中SbSPL4和SbSPL5只含有2个外显子；SbSPL2、SbSPL3、SbSPL7、SbSPL10、SbSPL11、SbSPL12、SbSPL13、SbSPL14、SbSPL16、SbSPL18则具有3个外显子；SbSPL8、SbSPL9、SbSPL19是4个外显子，SbSPL15、SbSPL17则有10个外显子，而SbSPL1和SbSPL6是11个外显子。这也揭示了这些SPL基因在进化或者基因起源上可能有一定的同源性，为后续SPL基因功能的研究提供了基础。

2.3 高粱SbSPL基因家族基本特征

为了研究不同高粱SbSPL基因的可能相关性，以及与其他植物物种SPL基因在进化上的关系，我们构建了系统进化树。利用拟南芥和水稻的SPL蛋白与高粱SbSPL蛋白的序列，通过MEGA软件（v5.1）生成了系统进化树。系统进化树包含了54个SPL蛋白序列，16个来自拟南芥，19个来自于水稻，19个来自高粱。系统进化树显示，预测的SPL蛋白聚集成5组，分别为SPL_1、SPL_2、SPL_3、SPL_4和SPL_5（图2）。依据系统发育树进行的分组与根据保守结构域进行的分组结果完全一致，除了SPL_3包含3个SbSPL成员，其余4组均包含4个SbSPL成员，高粱SbSPL蛋白的各个成员较为均匀的对应于进化树的不同分支，表明了SbSPL蛋白在不同植物中的的高度结构保守性（图2）。与此同时，在整个系统发育进化树中，我们发现高粱SbSPL与水稻OsSPL蛋白序列表现出更近的亲缘关系，而与拟南芥AtSPL蛋白的关系较为疏远，这或许与高粱和水稻同为单子叶植物相关。

2.4 高粱SbSPL基因家族成员在染色体上的分布

我们在高粱基因组数据库中获取了高粱19个SbSPL基因的染色体位置信息，通过MapGene 2 Chromosome绘制染色体定位图谱（图3）。高粱SbSPL基因家族的染色体定位的结果显示19个SbSPL基因不均匀地分布在除8号染色体外的其余9条染色体上，其中2号染色体含有4个SbSPL基因；4号和7号染色体含有3个SbSPL基因；3号、6号和10号染色体含有2个SbSPL基因；1号、5号以及9号仅含有1个SbSPL基因。不同染色体上SbSPL基因的分布部位也不同，如在1号和4号染色体上SbSPL基因多集中在上部；在2号、5号、6号、7号、9号以及10号染色体上多集中于下部；在3号染色体上位于中部。总体而言,19个高粱SbSPL基因在高粱染色体上分布不均匀，且大多分布在稀疏位置（图3）。

2.5 高粱SbSPL基因家族启动子特征分析

早期研究表明，SPL基因对干旱等非生物胁迫存在响应机制，为了探索非生物胁迫条件下可能的高粱SbSPL响应基因，我们选取SbSPL基因家族成员起始密码子上游的2 000 bp，作为可能的启动子区域来并对其分析（图4）。通过PlantCARE数据库，在选取的启动子区域发现了大量的顺式作用元件，其中低温响应元件（low temperature responsive, LTR）、脱落酸响应元件（ABA response element，ABRE）和禽骨髓细胞瘤作用元件(Myelo Cytomatosis, MYC)是我们的重点关注，这三个元件被认为是植物响应ABA、低温和干旱胁迫的主要开关。分析结果显示，所有的高粱 SbSPL基因的启动子区域都含有ABRE、LTRE或者MYC，其中100%(19/19)含有ABRE顺式作用元件，78.95%(15/19)含有MYC顺式作用元件，31.58%(6/19)含有LTR顺式作用元件。这些结果说明SbSPL基因家族成员很可能能够被干旱、低温、ABA等非生物胁迫诱导表达。此外，我们还发现高粱SbSPL基因的顺式作用元件不均匀的分布在启动子区域，顺式作用元件在数量和分布上存在显著差异，这可能会影响SbSPL基因的表达，从而导致SbSPL蛋白功能的分化。

2.6 高粱ABA响应基因的表达分析

通过对高粱SbSPL基因启动子的分析，发现SbSPL基因均含有ABRE顺式作用元件。该元件能够响应外界ABA的刺激，在植物相应ABA的反应过程中起到重要作用。因此，首先找到了19个ABA反应相关基因，通过对这些基因的表达量的分析，发现不同基因的表达量在不同的组织是不一致的，如RCAR3基因在全生育期表达量相对于其他18个基因都较高，在胚乳的表达量最高；ABA⁃responsive protein⁃like protein以及HAI3基因的表达量相对较低（图5）。本结果证明，含有ABRE顺式作用元件的基因在高粱中对ABA反应敏感，而ABA在干旱胁迫中起到主要的调节作用，因此我们推测SPL基因在高粱干旱胁迫中可能起到重要作用。

2.7 高粱SbSPL基因在干旱胁迫下的表达分析

为了深入了解高粱SbSPL基因对干旱胁迫的响应，我们通过实时荧光定量PCR技术对干旱胁迫下高粱SbSPL基因的表达模式进行分析。根据高粱 SbSPL基因家族的分组，我们在五组SbSPL基因中各随机挑选1个基因（SbSPL1、SbSPL4、SbSPL7、SbSPL9和SbSPL10），对这5个基因在干旱胁迫下的表达进行分析。在干旱胁迫下，与对照组相比，SbSPL1和SbSPL9基因会快速响应干旱胁迫从而抑制表达，并在9 h时诱导上升表达并逐渐升高；而SbSPL7和SbSPL10基因，则受干旱胁迫快速诱导上升表达，并在9 h后达到较高表达（图6）；SbSPL4则在受干旱胁迫诱导后快速诱导表达，并在12 h后恢复正常水平。这些结果表明，SbSPL基因很有可能通过调节ABA相关基因的表达，从而参与高粱干旱胁迫反应过程。

3 讨 论

SPL基因家族是高等植物中重要的转录因子，随着基因组测序技术的发展以及多种植物全基因组测序的完成，SPL基因家族的鉴定与研究已陆续展开，禾本科是种子植物中的大科，具有重要的经济价值，因此针对禾本科物种的SPL基因家族的研究较为广泛，例如Gardon^[34]揭示了12个拟南芥SPL基因家族成员的特征；Wang等^[35]的研究证明SPL家族基因调节水稻植株的结构，同时SPL基因能以最佳水平促进穗分枝以增加籽粒数；Mao等^[36]对玉米SPL基因家族进行了全面概述，并确定了ZmSPL基因可能参与了玉米对非生物胁迫的响应；Pan等^[37]全面分析了毛竹的SPL基因家族，发现PeSPL基因在植物生长发育以及胁迫响应中起重要作用。通过这些物种的SPL基因家族的研究能够指导高粱SPL基因的研究，但是目前并未有高粱SPL基因家族的相关报道。本文在高粱中对SbSPL基因家族成员进行了鉴定和系统分析，在高粱全基因组中共鉴定出19个SbSPL基因，根据保守结构域的不同，将其分为5组，并对鉴定出的SbSPL基因的结构、染色体位置、顺式作用元件等进行了生物信息学分析。同时，从5个SbSPL分组中分别各选取一个SbSPL基因，对干旱胁迫下的表达模式进行了分析。根据以上结果，我们推测SbSPL基因除了影响植物生长和花发育以外，还在高粱响应干旱、低温等非生物胁迫过程中起到了重要作用。大量研究表明SPL基因能够响应干旱、低温等非生物胁迫的信号转导^[38~40]。例如，白桦树BpSPL8基因的异源过表达能够降低拟南芥的耐旱性^[41]；异源过表达的苜蓿MsSPL8基因使苜蓿对盐和干旱的耐受性降低^[42]；此外通过沉默MsSPL13和miR156可以提高苜蓿的耐旱性^[43]；Peng等^[44]对31个玉米SPL基因的研究发现有13个被预测为miR156s的靶标并参与干旱胁迫响应；这都证明了高粱SbSPL基因很有可能参与高粱逆境胁迫过程的推测。

本研究发现高粱SPL蛋白较为均匀的对应于进化树的一个分支，表明高粱SbSPL各组蛋白的结构保守性。因此，高粱SbSPL基因很可能与亲缘关系接近的植物SPL基因具有相似的功能，高粱是禾本科的经济作物，因此对禾本科SPL基因功能的研究能够在一定程度上指导高粱的研究。例如OsSPL13能够控制栽培水稻的颗粒大小^[45]；miR529a可以通过调控OsSPL2、OsSPL14、OsSPL17及其通路和下游基因所形成的复杂网络，在调控穗系结构中发挥重要作用^[46]；在OsmiR156k转基因株系中OsmiR156k的靶基因SPL3，SPL14和SPL17的表达下调，并且过表达OsmiR156k能够降低水稻对冷胁迫的耐受性^[47]。水稻与高粱具有很高的同源性，通过这些研究，我们可以很快地确定高粱SPL基因的研究方向，有针对性地开展高粱SPL基因功能的研究。

早期研究表明，植物物种存在多种能够响应外界胁迫的顺式作用元件，本研究针对此方面对高粱SPL基因的顺式作用元件进行了分析，得到大量的此类顺式作用元件，其中也包含了许多与干旱等逆境胁迫相关的元件。分析发现SbSPL基因中有78.95%在上游启动子区域中均含有与干旱相关顺式作用元件MYC。Aliakbari等^[48]的研究证明具有顺式作用元件的启动子在干旱等逆境胁迫的早期应答过程中起到重要作用。

最后，本研究发现干旱胁迫能够诱导SbSPL10和SbSPL7基因的表达。这也证明这两个基因很可能直接参与高粱干旱胁迫的生理过程。因此，在后续研究中，我们将选取候选基因进行克隆，导入模式植物中对其功能进行探究和验证。而本研究针对高粱基因组，分离获得19个SbSPL基因及其相关结构、序列信息，将为后续SbSPL基因功能研究及高粱干旱胁迫机理研究提供理论基础。

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基金资助

三峡大学高层次人才科研启动基金(2016GCRC02)