抑制小麦赤霉病生防芽胞杆菌的筛选与相关研究

Screening and related research of Bacillus for the biocontrol of wheat scab

摘要

芽胞杆菌因其具有广谱的抑菌活性，在农业生产上常用于防控植物病害。本研究比较了五种芽胞杆菌发酵上清液对禾谷镰刀菌PH⁃1的抑制作用，结果发现枯草芽胞杆菌SCK6基本没有抑制效果，地衣芽胞杆菌BSK3和多粘芽胞杆菌BSK4有较弱的抑制作用，解淀粉芽胞杆菌TZ01和贝莱斯芽胞杆菌SH06抑制效果明显，其中贝莱斯芽胞杆菌SH06的抑制作用最为显著。进一步从不同培养基、培养时间及渗透剂对SH06菌株发酵条件进行了优化，结果表明在TB培养基中培养24 h并加入0.5% TritonX⁃100的渗透剂时，发酵上清对禾谷镰刀菌PH⁃1的抑制效果最佳。本文为贝莱斯芽胞杆菌作为一种新型生防菌剂奠定了良好的应用基础，不仅丰富了生物防治菌种的菌库，也为小麦赤霉病的防治提供了一种新的选择，对未来菌种联合防治提供了新的方向。

Abstract

Bacillus is widely used in agricultural production to prevent and control plant diseases because of its broad⁃spectrum antibacterial activity. In this study, the inhibitory effects of fermentation supernatants from five common Bacillus on Fusarium graminearum PH⁃1 were investigated, respectively. The results showed that B. subtilis SCK6 had no inhibitory effect, and B. licheniformis BSK3 and B.polymyxa BSK4 had weak inhibition. The inhibitory effects of B. amyloliquefaciens TZ01 and Bacillus velezensis SH06 were obvious, and the inhibition of B.velezensis SH06 was the best.Furthermore, the fermentation parameters including medium composition, culture time and different permeability additives on B.velezensis SH06 were optimized. The inhibitory activity against PH⁃1 reached the highest when cultured SH06 in TB medium for 24 h and supplemented by 0.5% TritonX⁃100. This study lays a foundation that B. velezensis can be used as a biocontrol agent against plant diseases and can play a significant role in the agriculture economy.

Graphical abstract

关键词

贝莱斯芽胞杆菌 / 禾谷镰刀菌 / 抑菌活性 / 发酵条件 / 生物防治

Key words

Bacillus velezensis / Fusarium graminearum / antimicrobial activity / fermentation condition / biological control

0 引 言

小麦赤霉病主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起，是麦类流行病害之一。该病害在潮湿的环境中易发生，在我国主要集中于长江中下游、华南和东北地区^[1]。赤霉病主要在小麦开花期形成侵染，可以造成小麦枯苗、根基腐烂、腐秆、腐穗，同时赤霉菌侵染后会迅速在穗部扩展，在小麦籽粒灌浆成熟过程中不断繁殖生长并在小麦籽粒中产生多种毒素，包括脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、雪腐镰孢菌烯醇(nivalenol, NIV)和玉米赤霉烯酮(zearalenol, ZEN)等，最终造成麦粒变白、干瘪、粒重和营养价值降低^[2~4]。赤霉病不仅导致小麦产量严重下降，而且毒素进入人体或牲畜体内，会造成肌体免疫力下降，致畸致癌，导致孕妇流产，对人畜健康有严重的危害^[5~8]。

为了有针对性地改善小麦赤霉病，目前有以下几种防治措施：①抗病育种；②化学防治；③生物防治；④物理防治；⑤其他防治，如：加强培训，资金支持等^[9~11]。由于小麦赤霉病有效的抗性基因资源匮乏，用于大规模推广种植和生产的抗性品种较少，同时物理防治效果甚微，在我国常用的杀菌剂有多菌灵和戊唑醇等，由于长期的广泛使用，我国很多地区赤霉病对多菌灵和戊唑醇等药剂产生抗药性^[12]。化学杀菌剂作为最重要的防治措施也面临病原菌抗药性、环境污染和安全性等方面的严峻挑战^[13]。因此，利用生物防治对植物病原菌进行控制是一种更安全、更可持续的农业生产战略^[14]。

芽胞杆菌属（Bacillus）是目前常见的生防菌，其最重要的生物活性分子是非核糖体合成肽和脂肽、聚酮类化合物、细菌素和铁素体等^[15]。已报道的对植物病原菌有拮抗作用的芽胞杆菌有枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）、多粘类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)和苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)等。例如枯草芽胞杆菌JN005可湿性粉剂能够有效防治水稻稻瘟病^[16]；多粘类芽胞杆菌HK18⁃8的发酵液和菌悬液对辣椒炭疽病菌具有显著防治效果^[17]。利用高效低毒的生物制剂防治病害生物，不同培养基成分或培养条件对拮抗菌株的生长及抑菌活性影响较大，使用渗透剂可促进拮抗或抑菌物质的分泌从而提高抑菌效果。因此，对有良好抑菌活性及相关特性的生防微生物进行发酵条件的优化和渗透剂的选择也很有必要。例如，通过对黄曲霉拮抗菌解淀粉芽胞杆菌F1的发酵条件进行优化后，F1发酵上清对黄曲霉抑菌率达到75.2%，提高了60.1%^[18]；优化枯草芽胞杆菌Bs01发酵条件后，对胶孢炭疽菌的抑制作用明显优于条件优化前^[19]。合理的培养基组成和控制条件是优良的菌株性能得以充分发挥的重要基础，芽胞杆菌在生物资源的开发利用和实现可持续发展等方面作用突出。

本研究首先对实验室已有的五种芽胞杆菌发酵上清液对小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌PH⁃1的抑制效果进行了分析比较，发现贝莱斯芽胞杆菌SH06抑制效果最明显。进一步从不同培养基、培养时间及渗透剂等方面优化了SH06的发酵条件，以期为有效利用芽胞杆菌微生物资源生物防治小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及试剂

胰蛋白胨、酵母提取物、山梨醇和甘氨酸采购于英国OXOID公司，琼脂和酶水解酪蛋白采购于Biosharp公司，葡萄糖、氯化钠、氯化镁、硫酸镁、牛肉膏、蔗糖、TritonX⁃100、甘油和SDS等常规试剂采购于国药集团。

1.1.2 微生物培养基

PDA培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L。

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，固体培养基中加入10~15 g/L的琼脂。

NZY培养基：酶水解酪蛋白10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L、氯化镁1 g/L、硫酸镁1.5 g/L、葡萄糖3.6 g/L。

NB培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠5 g/L。

TB培养基：胰蛋白胨12 g/L、酵母提取物24 g/L、磷酸氢二钠9.4 g/L、磷酸氢二钾2.2 g/L。

YPD培养基：酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨20 g/L。

1.1.3 菌株

地衣芽胞杆菌BSK3、多粘芽胞杆菌BSK4、贝莱斯芽胞杆菌SH06均为本实验室分离保藏；解淀粉芽胞杆菌TZ01分离自市售生防菌剂，枯草芽胞杆菌SCK6购自美国，禾谷镰刀菌PH⁃1由南京农业大学侯毅平老师馈赠。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化

将实验室保存在-80 ℃的菌株取出并活化。将枯草芽胞杆菌SCK6、地衣芽胞杆菌BSK3、多粘芽胞杆菌BSK4、贝莱斯芽胞杆菌SH06和解淀粉芽胞杆菌TZ01划线于LB固体培养基上，倒置于37 ℃培养箱中过夜培养。挑取禾谷镰刀菌PH⁃1菌丝接种于PDA培养基中央，倒置于28 ℃培养箱中培养1~2 d。

1.2.2 菌株培养

枯草芽胞杆菌SCK6、地衣芽胞杆菌BSK3、多粘芽胞杆菌BSK4、贝莱斯芽胞杆菌SH06和解淀粉芽胞杆菌TZ01培养：分别挑取芽胞杆菌单菌落，接种至20 mL的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min 振荡培养16 h，作为种子液。

不同培养基芽胞杆菌发酵：按1%接种量接种子液至20 mL的LB、NZY、NB、TB、YPD液体培养基中，相同条件振荡培养24 h后，样品先在600 nm下检测菌体密度（用吸光度值表示菌体密度），然后离心取上清备用。

不同培养时间贝莱斯芽胞杆菌发酵：按1%接种量接种子液至20 mL TB液体培养基中，相同条件振荡培养，在4~36 h之间每隔4 h取一次样，之后48、72 h各取一次样，样品先在600 nm下检测菌体密度，然后离心取上清备用。

添加不同渗透剂贝莱斯芽胞杆菌的培养：按1%接种量接种子液至20 mL TB液体培养基中，相同条件振荡培养24 h后，加入并调整不同渗透剂至终浓度，分别为甘油1%、山梨醇0.5%、蔗糖0.5%、Triton⁃X100 0.5%、甘氨酸0.5%、SDS 0.02%，加入以后培养12 h，并在波长为600 nm下检测样品添加渗透剂前后的吸光度值，然后离心取上清备用。

1.2.3 无菌发酵上清液的制备

将不同条件下培养的发酵液离心弃去菌体得到的上清液在无菌条件下用0.22 μm无菌滤膜过滤两次，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.4 发酵上清液对禾谷镰刀菌的抑菌实验

发酵上清液培养基混合法：每25 mL PDA培养基中加入1 mL芽胞杆菌发酵上清液,混合均匀后倒平板。用1 mL蓝色枪头粗端在禾谷镰刀菌PH⁃1的菌落边缘挑取菌块，然后将其置于混有芽胞杆菌发酵上清液的PDA培养基平板中间，即为处理组。使用不含发酵上清液的PDA平板中央仅接种同样大小的禾谷镰刀菌PH⁃1菌块作为对照组。处理组和对照组各做3个重复。28 ℃恒温培养4 d后,观察芽胞杆菌发酵上清液对禾谷镰刀菌PH⁃1的拮抗作用。以不含发酵上清液的PDA平板作为对照，抑菌率计算公式如下：

抑菌率（%）=（对照组真菌菌落直径-处理组真菌菌落直径）/对照组真菌菌落直径×100%

单位细胞抑菌率（%）=抑菌率/OD_{600 nm}

平板对峙法^[20]：用1 mL蓝色枪头粗端在禾谷镰刀菌PH⁃1的菌落边缘挑取菌块，然后将其接种在PDA培养基平板中间，同时在距PH⁃1菌块2.5 cm处等距离的4个位置用1 mL蓝色枪头粗端打孔，2个孔分别加入80 μL的芽胞杆菌发酵上清液作为处理组，另外2个孔分别加入80 μL相应培养基作为对照组。以在平板中央仅接种同样大小的禾谷镰刀菌PH⁃1菌饼作为对照，处理组和对照组各做3个重复。28 ℃恒温培养4 d后，观察芽胞杆菌发酵上清液对禾谷镰刀菌PH⁃1的拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 五种芽胞杆菌对禾谷镰刀菌PH⁃1的抑制效果分析

将枯草芽胞杆菌SCK6、地衣芽胞杆菌BSK3、多粘芽胞杆菌BSK4、解淀粉芽胞杆菌TZ01和贝莱斯芽胞杆菌SH06在LB培养基中培养24 h后，收集发酵上清液，利用发酵上清液培养基混合法分别检测五种发酵液对禾谷镰刀菌PH⁃1的抑制效果，结果见图1A~F。从图中可以看出，在添加芽胞杆菌发酵上清液的平板中，禾谷镰刀菌PH⁃1菌丝生长直径由大到小依次为对照组>枯草芽胞杆菌SCK6发酵上清液>地衣芽胞杆菌BSK3发酵上清液>多粘芽胞杆菌BSK4发酵上清液>解淀粉芽胞杆菌TZ01发酵上清液>贝莱斯芽胞杆菌SH06发酵上清液。可以看出枯草芽胞杆菌SCK6基本没有抑制效果，地衣芽胞杆菌BSK3和多粘芽胞杆菌BSK4有较弱的抑制作用，解淀粉芽胞杆菌TZ01和贝莱斯芽胞杆菌SH06抑制效果明显，其中贝莱斯芽胞杆菌SH06发酵上清液对禾谷镰刀菌PH⁃1的抑制作用最为显著。同样，利用平板对峙法分别检测五种芽胞杆菌的发酵上清液抑制禾谷镰刀菌PH⁃1的效果，结果见图1G~L。五种芽胞杆菌的抑制效果和发酵上清液培养基混合法一致。

2.2 不同培养基对贝莱斯芽胞杆菌SH06发酵抑菌能力的影响

贝莱斯芽胞杆菌发酵上清液对禾谷镰刀菌PH⁃1的抑制作用明显比其他四种芽胞杆菌作用强，故对贝莱斯芽胞杆菌SH06菌株进行发酵条件的优化，提高发酵上清的抑菌能力。根据碳源和氮源对芽胞杆菌脂肽产生的影响^[21]，选择LB、NB、NZY、TB和YPD五种常见培养基培养贝莱斯芽胞杆菌SH06，取发酵上清液进行抑菌实验。如图2所示，五种培养基24 h的发酵上清液均能够有效抑制禾谷镰刀菌PH⁃1的生长，抑菌率分别为62.68%（TB）、57.42%（YPD）、49.76%（LB）、37.32%（NZY）及35.41%（NB），其中采用TB培养基培养得到的发酵上清液抑菌效果最好；同时也测定了不同培养基的菌体密度，分别为6.1（TB）、5.5（YPD）、6.7（LB）、7.9（NZY）和4.2（NB）。根据抑菌率和菌体密度计算单位细胞的抑菌率，结果分别为10.35%（YPD）、10.34%（TB）、8.46%（NB）、7.39%（LB）及4.72%（NZY），表明抑菌效果和菌体密度并不呈线性关系，说明抑菌效果的不同不是由菌体量不同引起的，可能是培养基成份影响菌体抗菌成份的分泌。和其他四种培养基相比，TB培养基含有的离子浓度适中，另有研究表明K⁺可促进抗菌脂肽类物质的分泌^[22]，故TB培养基抑菌效果最好。

2.3 发酵时间对贝莱斯芽胞杆菌SH06发酵抑菌能力的影响

在TB培养基中培养贝莱斯芽胞杆菌SH06，每隔4 h取样测定菌体密度和抑菌能力，绘制SH06的生长曲线，计算抑菌率，结果见图3。从图中可以看出SH06菌株在0~8 h生长缓慢，8~16 h迅速生长进入对数期，16~36 h生长稳定，36 h后进入衰亡期。菌株在8~16 h之间，代谢旺盛，繁殖速度快，因此可选取16 h的菌液作为种子液（图3）。SH06发酵上清液抑菌活性随着发酵时间延长而增加，在36 h达到最大。其中在16~20 h抑菌活性略有下降，可能是此阶段营养物质多用于菌株自身生长，故产生次生代谢物质较少，从而影响了抑菌活性。36 h之后，抑菌活性随时间延长而有所下降，这可能是细菌进入衰亡期，细胞破裂释放了部分降解或转化抑菌成份的酶所致。考虑到简化发酵工艺和降低成本等因素，在24~36 h之间贝莱斯芽胞杆菌SH06发酵液抑菌活性相差不大，因此确定贝莱斯芽胞杆菌SH06最佳发酵时间为24 h。

2.4 不同渗透剂对贝莱斯芽胞杆菌SH06产生抑菌成份的影响

前述结果表明，菌株SH06产生的抑制禾谷镰刀菌PH⁃1的抑菌物质是分泌到发酵上清液中，在发酵培养过程中添加适量的渗透剂可促进抑菌物质分泌到胞外从而提高抑菌效果。有研究表明添加渗透剂能促进几丁质酶CSN的分泌，其中甘氨酸和TritonX⁃100对胞外酶活性改善最大^[23]。根据上述文献，在TB培养基中分别添加甘油、山梨醇、蔗糖、TritonX⁃100、甘氨酸和SDS六种常见的发酵渗透剂，检测发酵上清液对禾谷镰刀菌的抑制效果。结果显示（表1），添加0.5%的TritonX⁃100后，发酵上清液的抑菌效果最明显，其次是添加1%的甘油和0.5%的甘氨酸，添加0.02%的SDS抑菌效果最差。

3 讨 论

从现有植物病害生物防治的研究报道来看，采用的微生物种类有细菌、真菌、放线菌、病毒等微生物。其中细菌，特别是芽胞杆菌显示出很大潜力和前景^[24~26]。孙光忠等^[27]用5×10⁹ CFU/g多粘类芽胞杆菌悬浮剂在小麦抽穗期以每亩400~600 mL进行2次施药，对小麦赤霉病的防治效果达到80%以上。余桂容等^[28]从小麦叶片和穗部筛选出2株小麦赤霉病拮抗菌株——枯草芽胞杆菌B4和B6，其对禾谷镰刀菌的防治效果均可以达到68%左右，接近多菌灵的效果(70.4%)。刘伟成等^[29]从叶面和穗部分离出了8株拮抗性的芽胞杆菌，其中枯草芽胞杆菌B08的综合抑菌活性最强，其无菌发酵液对禾谷镰刀菌的防治效果可以达到66.2%。作为一种广谱生物抑制活性的贝莱斯芽胞杆菌，于2005年被Ruiz⁃Garcia等^[30]发现并命名，随后Wang等^[31]确定其为解淀粉芽胞杆菌的后期异型体。与一般用于生物防治的芽胞杆菌类似，贝莱斯芽胞杆菌能够产生抗菌蛋白、分泌脂肽类抗生素、非核糖体多肽合成酶和聚酮化合物合成抗生素、分泌IAA、嗜铁素和NH₃，具有诱导系统抗性等抗菌机理^[23]。在芽胞杆菌中产生的具有抑菌活性的次级代谢产物主要受培养基和发酵条件等环境因素的影响，不同培养基和不同培养条件产生的抑菌活性物质含量会有较大变化，从而会产生不同的抑菌效果。贝莱斯杆菌和其他杆菌联合使用的抑菌效果具有很好的防治前景。余桂容等^[32]探究了温度、pH和培养基成分的不同，枯草芽胞杆菌B4和B6抑菌物质对禾谷镰刀菌的抑制活性也不一样，最终发现最适抑菌条件为：YPS培养基、pH 7.0、28 ℃和充足的氧。韩旭东等^[33]探究了芽胞杆菌ZYCHH⁃01的发酵条件对大肠杆菌抑菌活性的影响，发现最佳发酵条件为接种量为3%，发酵温度为36 ℃，培养pH为7.8，培养时间为27.5 h。因此，生物防治菌剂的培养环境对小麦赤霉病的防治效果有着很大的影响。

本文探究了枯草芽胞杆菌SCK6、地衣芽胞杆菌BSK3、多粘芽胞杆菌BSK4、贝莱斯芽胞杆菌SH06和解淀粉芽胞杆菌ZT01对禾谷镰刀菌PH⁃1的抑制效果，首次发现贝莱斯芽胞杆菌SH06抑菌效果更明显，明显优于商品化的解淀粉芽胞杆菌ZT01。随后，为了进一步提高贝莱斯芽胞杆菌芽胞杆菌对禾谷镰刀菌的抑菌效果，对其生长培养基、培养时间及添加渗透剂的种类进行了探索，确定了抑菌效果最好的最优培养条件，在TB培养基中添加0.5% TritonX⁃100的渗透剂培养24 h效果最好，最佳抑制活性可以达到65.2%，接近多菌灵的效果(70.4%)。本研究首次报道贝莱斯芽胞杆菌SH06对引起小麦赤霉病的禾谷镰刀菌有强抑制效果，并且通过优化菌剂的抑菌生长发酵条件，使最终的生物抑制活性接近多菌灵的抑菌效果，虽然没有超过目前报道的最高80%抑菌活性，但是其超过了目前商品化的解淀粉芽胞杆菌ZT01，可以在未来作为一种新型的生物防治菌种对小麦赤霉病进行生物防治，这不仅丰富了生物防治的菌种库，也对小麦赤霉病的防治提供了一种新的选择，这对于不同地域因环境因素引起的病害具有一定的参考意义。同时，贝莱斯芽胞杆菌SH06作为一种新型生物防治菌剂，填补了贝莱斯芽胞杆菌对小麦赤霉病防治的空白，为赤霉病生物制剂的开发利用奠定了良好基础，在微生物资源可持续发展应用方面具有广阔的前景。

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基金资助

苏垦农发农业科技项目(苏垦农发种[2019]125号)

武汉市黄鹤英才（2016）