人体微生物“暗物质”：勘探、培养及应用

Human microbial “dark matter”： mining， culture， and application

摘要

微生物广泛存在于自然界，其代谢活动对环境和人类健康有重要影响。定植于人体表面和内部的微生物无论从细胞还是基因数量上都远超人体，而90%以上的微生物是未培养的，这严重限制了对人体共生微生物功能的研究。因此，鉴定和分离未知或以前无法培养的微生物的必要性是显而易见的。随着各种技术的进步，可培养的微生物数量不断增加，但仍存在不足。本文论述了利用基因组测序探索微生物“暗物质”的效果，以及分离培养未培养微生物和对其进行开发利用的重要性；综述了当前有效的微生物鉴定和培养技术，如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI⁃TOF MS）、基因组信息抗体工程等；阐述了微生物与人体健康的相互作用，揭示了人体微生物“暗物质”的潜力，对人体微生物“暗物质”未来的研究和发展进行了讨论。

Abstract

The existence of microorganisms on Earth is ubiquitous， and their metabolic activities have a significant impact on the environment and human health. The number of cells and genes of microbes colonized on the surface and interior of the human body is much higher than that of the body itself， and more than 90% of the microbes are uncultured， which seriously limits the study of symbiotic microorganisms in the human body. Therefore， the necessity of identifying and isolating the unknown or previously uncultured microbes is apparent. The number of culturable microbes is increasing with the improvement of various technologies， but there are still insufficient. This paper states the efficacy of utilizing metagenomics to discover the “dark matter” in the human microbiome， and the importance of isolating and culturing uncultured microorganisms and developing them； reviews current efficient microbial identification and cultivation techniques， such as MALDI⁃TOF MS and genome informed antibody engineering； finally，some examples of microbes⁃human interactions are expounded to reveal the potential of human microbial “dark matter”， and the future research and development of human microbial “dark matter” are discussed.

Graphical abstract

关键词

未培养微生物 / 微生物“暗物质” / 培养组学 / 宏基因组学

Key words

uncultured microorganism / microbial “dark matter” / culturomics / metagenomics

0 引 言

微生物，包括细菌、真菌和病毒等，与环境和人类或非人类动物关系密切。微生物代谢对维持环境稳定起着至关重要的作用，而微生物的致病机制会对其他生物体造成疾病或功能障碍等负面影响^［1，2］。此外，通过利用微生物快速生长与复杂多变的特性，能够从微生物代谢物中快速高效地研制出具有抗肿瘤、治疗干预免疫等效果的新型生物制剂^［3，4］。微生物学家花费大量时间试图剖析微生物与人类和环境之间的各种关系，如利用各类显微镜进行形态检查、调整各种生长条件（液体或固体营养补充剂）以及开发先进的“组学”（omics）技术等，以期进一步了解微生物与人类/环境之间的相互作用^［5］。然而，实验室的微生物生长条件是有限的，这导致迄今为止培养微生物的占比远低于未培养的微生物^［6］。目前，超过80%的人类微生物群缺乏调查和适当的培养方法^［6］。微生物的代谢网络十分复杂，一旦新的微生态参与者被识别和研究，特别是人类微生物组，该网络的复杂性可能会被进一步梳理清晰。因此，不断发展和完善微生物的培养技术是必不可少的。

近年来，科学家们对微生物的关注一直在增长。美国国立卫生院（National Institution of Health， NIH）所支持的人类微生物组计划（Human Microbiome Project， HMP）及其综合分析（iHMP），旨在描述与人体相关的微生物组成，阐明健康条件和疾病条件下微生物与宿主的相互作用^［7］。在多项针对人体各部位的微生物区系调查中，肠道菌群（gut microbiota）在人体中的作用越来越受到关注，因为它能导致包括疾病在内的各种后果^［8］。例如，细菌多样性的动态变化可提示疾病的前期征兆，如作为前驱糖尿病的特征之一^［9］；人体胃肠道主要由胃、小肠和大肠组成，它们的微生物组成相对依赖于参与消化活动的微生物，饮食习惯对肠道微生物群落的丰度和多样性有着重要影响^［8，10］；肠道微生物群，尤其是共生菌群可帮助人体预防病原体入侵和维持代谢稳态，而各种炎症性疾病或结直肠癌被认为与肠道微生物失调（microbial dysbiosis）有关^{［6，8，11］}；幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的定植是胃癌中微生物相关因素的典型代表^［12］，其他身体部位的许多感染性疾病也有微生物参与，例如由肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia）引起的肺炎^［8］。与培养相关的宏基因组有助于更详细地研究人类肠道菌群。研究者通过使用高通量16S rDNA扩增子测序分析，对管腔中的细菌进行量化和表征，展示了口腔、空肠和结肠的微生物多样性和密度差异^［13］。从胃肠道不同部位采集样本，利用培养组学与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI⁃TOF MS）综合分析表明，不同部位的细菌组成和多样性存在显著差异^［14］。此外，研究者基于宏基因组分析和培养组学从其他哺乳动物粪便样本中分离出新细菌，例如绒猴的新型双歧杆菌（novel bifidobacteria）^［15］。基于多“组学”联合分析遗传和代谢信息为优化培养条件提供线索，在很大程度上有助于对人类微生物群的探索^［5，16］。

1 基因组测序揭示了微生物“暗物质”

微生物“暗物质”（microbial “dark matter”）或未培养微生物（uncultured microbes）通常指目前无法在实验室通过人工培育以获得纯培养的微生物。一些微生物的生长需要非常严格的环境，例如温度、pH值、是否含氧、氧气浓度以及特定营养素等，其中任何误差都可能导致培养失败^［17］。此外，实验室培养不同于自然环境，即使科学家们尽最大努力模仿原始条件，仍有许多不确定因素或可成为微生物生长的不利因素。例如，在营养丰富的培养基中混合培养样品时，特定菌株的生长可通过产生特定代谢物或消耗营养物质从而影响其他物种的繁殖^［17］。幸运的是，随着基因组序列的完善和多种“组学”技术的发展，逐渐认识培养微生物的必需要素是可行的。例如，贝氏柯克西拉菌（Coxiella burnetii）的全基因组序列提示了培养这些致病细菌所需的条件^［18］。微生物的鉴定有助于微生物组数据库的丰富与完善。16S rDNA及相关扩增子序列分析作为细菌物种分析的常用方法，揭示了自然环境和人体中存在大量未培养的微生物，激发了人们探索这些微生物“暗物质”的作用和意义的热情^［8］。16S rRNA基因存在于所有细菌基因组中，并且高度保守，用PCR扩增高变区的一段片段，对获得序列进行分析和比对，这一方法被广泛应用于细菌鉴定，其分辨率和准确性高度依赖于读长（reading length）和引物的选择^［5，8］。使用一种新的算法分析16S rRNA基因，通过将系统发育、丰度和群落功能联系在一起，可以深入了解未培养微生物^［19］。另外，18S rRNA基因测序可用于真核生物的鉴定。单细胞扩增基因组（single⁃cell amplified genomes， SAG）和宏基因组组装基因组（metagenome⁃assembled genomes， MAGs）的运用增加了发现新细菌的机会，优化内部转录间隔区（internal transcribed spacer， ITS）等更完善的分析研究正在进行中^{［20，21］}。未培养微生物的生存、定植、潜在致病机理或其他对人类有益的物种特异性特征都需要通过纯培养菌株来验证，因此分离出被测微生物的纯培养物是开发其有益效果或发现其潜在危害的关键步骤。

微生物无法被培养的原因主要有以下几个方面：首先，共培养（co⁃cultivation）是共生（commensalism）和互利共生（mutualism）所需要的，快速和慢速生长的微生物之间的竞争可能导致群落中某一些成员被忽视或无法生长。从环境角度看，培养的随机性表明存在尚未被注意到的因素。Buerger团队的Scout假说提出了细菌缓慢生长的一个可能原因，即休眠细胞的唤醒取决于随机的机会，即有多少“Scouts”似乎能为整个群落产生生长诱导因子^［22］。其次，需要额外的化合物来调节标准培养基。丰富的营养条件固然重要，但模拟自然条件可以使微生物生长在有合适浓度的生长因子中，因此使用天然培养基可提高微生物培养的成功率。如枯草芽胞杆菌产生的环二肽，已被证明能够刺激有益于肠道的双歧杆菌的生长^［23］。最后，导致自然环境和实验室环境差异的空气流通状态（ventilation）或代谢途径中的酶，也可能影响微生物在实验室培养期间的存活率^［17］。另外，生物膜的形成对培养微生物也存在影响（有些微生物只在生物膜中存活）^［17］。

2 宏基因组学是探索微生物“暗物质”的有力工具

宏基因组学（metagenomics）能够直接从复杂样本中研究其中生物的遗传物质组成，利用可靠的高通量测序技术，计算微生物组成并获得其特定生长条件下的代谢线索^［6，16］。宏基因组测序通过将微生物基因组DNA随机分成500 bp的小片段，随后在片段两端添加引物进行PCR扩增和测序，通过组装将小片段拼接成较长的序列进行分析比对^［24］。侧重于研究微生物种群的结构、某些基因的功能活性、微生物之间的相互作用以及微生物与环境的关系。宏基因组同样可以评估样本是否适合用于分离某种微生物，允许对目标微生物进行分析，以找出物种特定代谢途径用于设计培养条件^［5］。宏基因组学分析突破了单纯培养微生物的限制，拓展了微生物资源的利用空间，为各种环境微生物群落的研究提供了有效的工具。此外，高通量DNA测序（如next⁃generation sequencing，NGS）和全基因组shotgun测序可应用于选择性细菌属，作为分离新物种或菌株和丰富参考数据库的基础^{［14，15，25］}。对血液样本中微生物释放的无细胞DNA（cell⁃free DNA）的测序表明，人类微生物群落的多样性比我们过去预期的要丰富得多^［26］。因此，宏基因组学研究表明微生物的发现和培养还有许多有待探明的空间。

宏基因组学的基础之一是建立一个可靠的、巨大的基因组数据库，以便对感兴趣的物种进行初步搜索。2019年，Poyet等^［27］报道了一个名为BIO⁃ML（Broad Institute OpenBiome Microbiome Library）的人体肠道菌群生物库，对于研究肠道菌群的动态变化和机制有重要意义。它包含7 758株肠道细菌，其中3 632株获得全基因组序列，大多数人肠道细菌的多样性得到了覆盖。BIO⁃ML通过收集80个个体的宏基因组和代谢组学数据，揭示了肠道菌群代谢物的时间依赖性变化和粪便代谢物的差异^［27］。他们发现，使用多日样本的平均值可以提高数据的可靠性，同时，通过对个体内部细菌基因组变化的分析，可以推断生态进化动力学（eco⁃evolutionary dynamics）和在生物体内的选择压力（in vivo selection pressures）^［27］。欧洲生物信息学研究所（EMBL⁃EBI）的研究团队为人类肠道微生物群建立了204 938个参考基因组的统一目录，提供了一个统一的人类胃肠基因组（unified human gastrointestinal genome， UHGG）集合，其中包含4 644个肠道原核生物的20万个基因组^［28］。这些基因组编码超过1.7亿个蛋白质序列，研究人员还将这些序列收集到统一的人类胃肠蛋白质（unified human gastrointestinal protein， UHGP）目录中^［28］。超过70%的UHGG物种缺乏纯培养菌株，40%的UHGP缺乏功能注释。对种内基因组变异的分析显示了大量的辅助基因和单核苷酸变异，其中许多属于特定个体^［28］。对UHGG和UHGP的收集有助于研究人类肠道微生物组中基因型和表型之间的关系。超过20万种肠道原核生物的参考基因组及其编码的蛋白质已经被编目，为微生物研究人员提供了一个较全面的资源^［28］。全面且高质量的参考基因组对于人类肠道菌群的功能鉴定和分类至关重要。针对健康人群的肠道微生物进行培养是目前研究的主要趋势，但是，目前仍缺乏更完善的与疾病相关的调查，而宏基因组数据集的完整性在反映更多生理功能方面具有良好的潜力^［29］。本团队针对重要疾病如肺癌、糖尿病等开展肠道微生物组、代谢组等多组学联合分析，已发现一些重要的标志菌和代谢物；同时通过对长寿家族生活环境、人体微生物组进行深入研究，发现长寿老人肠道微生物具有独特的生物学功能（数据尚未发表），为后期靶标菌株的分离和应用研究奠定了基础。

多项研究已经揭示了人体微生物群在生理和疾病中的作用，但所涉及的微生物区系分子和相关机制仍然未知^{［29，30］}。宏基因组学揭示了微生物具有产生大量有用化学物质的能力，可能对有效治疗传染病或改善人类健康状况产生积极影响^{［31，32］}。生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters， BGCs）是该研究的主要目标，BGCs通常位于可移动基因元件（mobile genetic elements， MGEs）和菌株特异性特征中，然而，Donia等^［31］的研究无法揭示未培养微生物的生物合成潜力。一种名为BGCs的宏基因组标识符（MetaBGC）的新型计算机算法通过构建识别酶同源物的模型（MetaBGC⁃build）、从人类宏基因组学数据库中识别生物合成基因（MetaBGC⁃identify）、识别量化基因并基于丰度分布进行聚类（MetaBGC quantify and MetaBGC cluster），从而可以从宏基因组测序中读取数据并识别人类微生物组中的小分子BGC^［32］。对从肠道、口腔等人类主要微生物群定植点采集的2 544份人类宏基因组样品进行分析，发现近半数菌群中存在Ⅱ型聚酮合酶（polyketosynthase TⅡ⁃PKS）BGC，其中13个属于新发现，由微生物区系的不同成员编码和表达^［32］。在NCBI和微生物基因组和微生物组（Integrated Microbial Genomes and Microbiomes， IMG）中搜索已鉴定的13个BGC，已测序和尚未测序的微生物都有以菌株特异性（strain⁃specific）方式编码的目标BGC基因组，这表明，无论地理差异和饮食特性如何，TⅡ⁃PKS⁃BGC广泛存在于人体微生物群落中^［32］。该算法使小分子BGCs可以直接从人类微生物组中提取的宏基因组测序数据中被识别出来，而不需要细菌培养。新发现的TⅡ⁃PKS BGC产物被转入实验室细菌（如链霉菌属）中进行异源表达，以测试、纯化和鉴定某些化学物质^［32］。同时，对化合物结构进行解析，发现这些分子具有抗菌活性，推测其在生态位竞争和宿主防御中发挥作用。跳过微生物培养的工作量，但能有效地找到可利用的分子^［32］。总地来说，将MetaBGC与合成生物学相结合可以从人类宏基因组数据中识别有生物活性的微生物分子，为系统研究生物活性分子介导的微生物⁃宿主和微生物相互作用提供了有力的手段。因此，宏基因组学和多种“组学”技术为挖掘人类微生物群的潜力提供了一个有效的选择。

3 培养组学技术助推人体微生物的分离培养

培养组学（culturomics）通常被定义为微生物培养的方法学。利用多种培养条件，结合基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI⁃TOF MS）和16S rDNA测序，鉴定了许多新型人类肠道细菌 ^［33］。培养组学实现了新型细菌的分离，如Phoenicibacter congonensis，通过大量的基因组和生化方法使得相应的鉴定更加方便，同时也有助于完善已有的物种数据库 ^［34］。MALDI⁃TOF MS在培养组学中的重要作用是显而易见的，菌落的单克隆需要使用基体化合物溶液进行制备，然后加载到靶板上，将强脉冲激光束引入样品中形成短离子脉冲。电离分析物分子的m/z决定了带电离子在飞行管中飞行的时间，随后探测器测量肽段的m/z，导出蛋白质图谱，随后与相应数据库的比较确定蛋白质特征^［6，33］。MALDI⁃TOF MS不仅广泛应用于细菌检测，而且也普遍应用于疾病诊断，例如在糖尿病足感染（diabetic food infection， DFI）治疗过程中，微生物群在组成和丰富度方面的变化^［35］。通过分析用于肠病毒性脑膜炎诊断的脑脊液蛋白质谱，证实了MALDI⁃TOF MS在病毒识别中的适用性^［36］。此外，使用MALDI⁃TOF MS检测真菌也是可行的^［37］。尽管如此，随着该技术的应用越来越普遍，一些局限性和缺陷也逐渐显现出来。对数据库的依赖性可能导致错误识别和对未纳入参考或密切关联物种的微生物的敏感性降低^{［37，38］}。近期，Ghimire等^［39］利用培养组学技术从健康人粪便中筛选出102种肠道细菌，并通过全基因组测序预测其细菌特性。体外共培养鉴定出66种对艰难梭菌（Clostridioides difficile）有较强拮抗作用的细菌，主要特征包括乙酸或丁酸的生产、快速生长以及与艰难梭菌对碳源的竞争^［39］。在256种抑制菌组合的共培养实验中，发现混合菌对艰难梭菌生长的影响取决于其组成和比例。有些组合可以抑制艰难梭菌的生长，而另一些组合则可以促进艰难梭菌的生长^［39］。用肠道共生菌的特定组合抑制艰难梭菌可能是一种更安全和可控的治疗方法。结合培养组学和表型分析方法，鉴定出多种体外抑制艰难梭菌生长的人肠道共生菌，但是，这些抑制菌的不同组合对艰难梭菌的生长有不同的作用，说明与特定细菌组合可能影响整个群落的功能和特性^［39］。这些发现对多菌种微生态治疗（multi⁃species microbial therapies）的研究具有重要意义^［39］。

宏基因组学结合培养组学的方法在细菌鉴定方面做出了不少贡献^{［11，14，33］}。涉及MALDI⁃TOF MS的培养组学的可用性已应用于不同的研究，并从人类中分离出许多新的细菌种，例如小类杆菌属的Dialister massiliensis sp. nov.，瘤胃菌科的Pseudoruminococcus massiliensis gen. nov.， sp. nov.，梭菌科的Haloimpatiens massiliensis sp. nov.，以及拟杆菌目的Parabacteroides bouchesdurhonensis sp. nov.， P. pacaensis sp. nov.，P. provencensis sp. nov.^［40~44］。最近，通过培养组学从健康人粪便样本中获得了338种1 520份高质量的单菌基因组草图，极大地丰富了现有的人类肠道细菌参考基因组和人类基因组学的相关应用^［45］。在该研究中，通过培养组学分离出6 000多株人类粪便菌株，建立了一个可培养基因组参考（culturable genome reference，CGR）数据集，它包含了人类肠道的主要细菌，包括至少264个新的参考基因组（不属于现存数据库），并且存在大量低丰度细菌^［45］。值得一提的是，该团队在片段比和SNP分析方面提高了宏基因组分析的分辨率，CGR的功能注释加深了对肠道细菌功能的认识。此外，对38种重要细菌的全基因组分析揭示了其核心基因组和非核心基因组的不同功能^［45］。结合16S rRNA基因测序和宏基因组测序以及平板富集培养，Whelan等^［46］开发了一种平板覆盖算法（plate coverage algorithm，PLCA），直接或在富集培养后收集肺囊性纤维化痰样本并测序，以分析囊性纤维化的肺菌群。结果表明，培养富集和直接测序相结合可以增加观察到的微生物区系的分类学多样性，包括直接测序无法检测到的微生物区系多样性，微生物的功能注释更加全面^［46］。将PLCA应用于先前发表的培养和富集肠道菌群的数据，证明该算法不局限于肺部微生物群或特定的培养条件。这项研究提供了更好地了解人体微生物在健康和疾病中作用的方法。对于未鉴定的OTU，富集培养后再进行测序的检出率高于直接测序^［46］。结果表明，培养基类型和氧利用率对OTU数的增加有一定的影响。与直接测序分析相比，富集后培养的宏基因组分析显示出更丰富的分类学多样性、更好的元基因组组装、更长的重叠群和更全面的功能注释^［46］。因此，培养组学结合功能注释和基因组分析，加深了我们对人体肠道微生物组的功能和特点的认识，通过对该类数据的分析和探索，或许可以将精准的营养物质提供给难培养的微生物，从而提高获得纯培养物的效率（图1）。在自然环境和临床环境中，随着鉴定和分析工具的不断发展，传染病致病机制的复杂性可能会变得更加清楚。

基于对长寿家族宏基因组和泛基因组等大数据分析，本团队针对重要菌种资源设计特异选择性培养基，搭建多目标菌株的靶向培养组学平台，已经分离获得包括双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属、链球菌属等益生菌，同时也分离获得了大量的具有开发前景的下一代益生菌如肠球菌属、芽胞杆菌等。利用宏基因组指导的培养组学研究，通过对采集自多个国家的上万份样本进行微生物分离获得纯培养物，并利用16S rDNA基因测序和MALDI⁃TOF MS快速鉴定微生物菌株，目前广东省微生物研究所已建立了我国最大和国际上具有重要影响的食源性致病微生物资源库，保藏菌种30 000株以上。初步建立中国食源性致病菌风险识别数据库，初步构建微生物安全与健康的全基因组学、转录组学、蛋白质学和代谢组学等科学大数据库。本团队已建立20 000株以上的益生微生物菌种资源库，测序获得了1 000株以上的益生菌菌株全基因组，通过高通量活性筛选平台和动物实验等挖掘出多株具有特殊生理功能的益生微生物，为临床、应用研究奠定了良好的基础。

将微生物从混合培养中分离出来是很重要的，开发新的培养体系应该有助于微生物的培养。Cross等^［47］于2019年开发了基因组信息抗体工程（genome informed antibody engineering），该方法使用反向基因组（reverse genome）以获得特异性抗体，从而将特定微生物从复杂环境中培养出来。Cross团队通过分析大量的序列数据，获得未培养微生物专有的膜蛋白（肽段）作为抗体靶点，通过抗体的荧光染色来选择特定的微生物进行培养。反向基因组的使用相对地解除了遗传信息和培养条件之间的障碍，从而选择性地培养出感兴趣的微生物。自16S rRNA基因测序被运用以来，人类口腔糖化细菌（TM7）不断被发现。通过对靶向微生物的筛选和培养，揭示了TM7与放线菌（Actinobacteria）之间的相互作用或共生关系，证实了该方法的可行^［47］。另外，应针对不同的微生物进行培养条件的优化。例如，针对沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）开发的无细胞（无菌）培养体系培养人类病原体，设计培养基时应注意微生物生理和代谢的必要性^［18］。在缺氧⁃好氧界面芯片（AOI⁃chip）上观察到了青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）和霍氏真杆菌（Eubacterium hallii）的稳定活性^［48］。微生物培养可用的微流控装置的开发对一些新型微生物有很好的检测效果^［49］。微流控条纹板（microfluidic streak plate， MSP）是一种高效、经济的细胞分离装置，其中含有的单个微生物细胞的样本液滴被转移到培养皿上的微空间（microspaces）进行初始培养，然后收集以进行进一步表征^［50］。利用MSP从土壤中发现的未知物种如芽生球菌（Blastococcus）证明了其实用性^［50］。多孔氧化铝（PAO）芯片提供了以培养为基础的人类肠道中耐药细菌的筛选^［51］。Watterson等^［52］开发的基于液滴的微流控平台（droplet⁃based microfluidic platform）是一种高通量、厌氧的培养装置，其适用性已通过筛选人类粪便样本而得到认可。针对不同的环境开发出各种各样有针对性的培养工具或方法，如集中在土壤和海洋/水细菌上，有助于开发更多的可培养人类微生物及其衍生物。例如，稀释培养计数（most probable number， MPN）和iChip提供了从水或土壤样本中分离出新微生物的方法，与此类似的概念或可应用于人类微生物群落的探索^{［50，53］}。MPN适用于鉴定微生物群中的非优势或亚优势菌株，它要求使用高度稀释的样品，使得琼脂平板上的每一滴样品只有一个菌落供进一步生长和鉴定，从而消除了其他快速生长的优势物种的影响，允许对目标菌株进行研究和确认^［54］。此外，以自然环境来培养的iChip会将稀释的目标微生物暴露到原生栖息地，使其能够顺利生长，从而消除物种间的竞争^［53］。iChip可以用于从环境中的未培养细菌中发现活性分子（如抗生素），同时也可以用来拓展细菌培养的更多路径^［55］。以上几种方法都是相对随机的微生物培养方法，这些方法依赖于微生物的丰度和适宜的环境因素，没有选择性培养微生物的能力。从上述培养技术的多样性可以看出，科学家们正在寻找和完善研究微生物“暗物质”的实验室工具。根据表型、生理学和代谢能力，在成功培养后可通过各类生化试验（如IMViC、CAMP）快速鉴定新物种。生化测试可以显示细菌在代谢某些基质上的特异性，并结合适当的指标来识别细菌的属和种^［56］。

利用非培养（culture⁃independent）的方法，旨在为相关特性的研究提供更好的未培养细菌的探索能力，而分离和培养新的细菌的必要性无疑是对发病机理的澄清，各类相互作用和新疗法的发现取决于分离培养的有效性。细菌的某些复杂功能和某些酶不能仅从基因组推断，例如自养生长和光合能力^［57］。添加特定的生长因子/刺激剂可对培养细菌产生积极影响，如双歧杆菌利用果聚糖、双歧杆菌和拟杆菌共培养，可通过在共培养条件下添加低聚糖或环肽来实现对益生菌生长的刺激，这可能有助于培育慢生长菌株^{［23，58］}。

4 开发利用人体微生物“暗物质”前景广阔

人体微生物组在健康、临床诊断和治疗方面起着重要作用^［59］。Sugimoto等^［32］利用计算和合成生物学发现，微生物编码的小分子，如芳香族聚酮类化合物，具有抗菌作用，这意味着微生物基因组中储存了大量可能用于治疗传染病或其他疾病的药物或分子。另一研究表明假长双歧杆菌（Bifidobacterium pseudolongum）产生的肌苷（inosine）与T细胞相互作用，增强了免疫治疗的效率以摧毁结肠肿瘤^［4］。此外，粪菌移植（fecal microbiota transplantation， FMT）在一定时期内被认为是治疗慢性胃肠道感染或其他微生物相关疾病的潜在疗法，尤其是艰难梭菌感染（CDI）^{［60，61］}。由于粪便微生物的成分中不仅含有益生菌，还含有病原体（致病菌），这可能是治疗过程中的危险因素之一。因此，值得通过培养组学进行研究，从而分离出有益细菌，最大限度地提高治疗效果并消除潜在的发病机制^{［60，62］}。同时，粪菌移植可引起微生态的变化，或许会对宿主的生理状态产生影响，因此对整个微生物群落的调查至关重要^［62］。新型益生菌的分离和对人类微生物群的深入探索暗示治愈疾病和改善健康的更多可能性^［15］。另外，遗传信息作为研究更多微生物“暗物质”的入口，可以揭示特定的代谢途径从而有助于进行适当培养^［6］。

未经培养的土壤细菌生产新型抗生素的现象引发了科学家的极大兴趣^［55］。微生物相互作用触发具有抗生素活性的次生代谢物的产生^［63］，不同微生物的共同培养是产生对应代谢物的基础，例如，小单孢菌属（Micromonospora sp.）和红球菌属（Rhodococcus sp.）共同产生抗生素分子，称为keyicin，靶向革兰氏阳性菌^［64］。这些基于非人类微生物的研究表明，增加可培养的人类微生物有可能导向产生抗菌药物或阐明耐药机制的新策略。非人类微生物群培养暗示可以发现更多的功能分子 ^［65］。宏基因组在识别新微生物和利用肠道微生物组寻找小分子代谢物方面提供了一个切入点^{［32，66］}。健康个体和患者的肠道菌群组成可能不同，如糖尿病和自闭症患者^［9，67］。在治疗和疾病发展过程中观察肠道微生物群的变化意味着微生物活动的重要性^［62］。因此，鉴定和分离更多的肠道未知微生物是阐明复杂的微生物群落变化的基础。

益生菌通过肠道微生物群的改变或恢复，在影响许多胃肠疾病甚至自闭症方面显示出了很好的改善效果^{［68，69］}。基于宏基因组和生物信息学分析，更多的抗生素或抗菌分子得以被发现^［66］。在大量未经培养的微生物中寻找更多的益生菌，以配合现存的治疗方法。探索新的肠道微生物群也可能会带来新的治疗方法。综上所述，无论是依赖培养还是非依赖培养途径，都会有越来越多的新微生物被发现和认识。

5 讨 论

微生物学家在寻找和研究人类和其相关微生物组的关系上花费了大量精力，首先是为了探索人类微生物群的复杂性及其与健康/疾病的关系，因此需要了解或阐明微生物的功能和特征；其次，要想获得新的疾病治疗方法或使之与现有的治疗方法相结合，可能需要找到更多的方式修复相应的缺陷和进行有效的培养；最后，扩展人类微生物数据库可以增加我们对了解不深的微生物，如古生菌的认识。

探索微生物世界中的“暗物质”一直是科学家们的目标。隐藏在未知微生物中的巨大潜力激发了人们对未培养微生物的探索热情。本团队通过对世界长寿乡蕉岭县长寿家族的人体微生物样本（体表，唾液，血液，粪便等）进行大规模的宏基因组测序分析，发现长寿人群存在特异微生物菌群，并利用宏基因组数据结合选择性培养技术分离获得大批量具有特殊功能的人体健康微生物（数据尚未发表）。本团队前期研究表明，通过结合宏基因组分析的选择性分离方法、培养组学和高通量精准仪器技术，可以提高微生物精准培养，建立人体健康功能微生物菌种资源库和科学大数据库，从而更全面地对人体微生物进行探索和开发。此外，对微生物“暗物质”进行增亮和扩展，有助于解析微生物之间、微生物与宿主之间相互作用的网络，从而丰富应对疾病和有益健康的工具，如开发特异性微生态制剂、粪菌移植等。在未来的研究工作中，充分利用现有的各类“组学”技术和人体健康功能微生物科学大数据库，挖掘人体未培养微生物某些特定的代谢通路，对样品中菌相的代谢变化进行分析，或可针对目标微生物的生长需求给予相应的营养物质和培养环境，降低培养的随机性并有效获取目标纯培养物以供后续研究，从而有助于阐明更多微生物⁃宿主相互作用的分子机制，为发展新型治疗方法和平衡人体菌群提供条件（图2）。传统微生物培养系统有效地支持了后续与微生物遗传相关的分子机制的发掘，我们相信宏基因组学等其他相关分子技术的发展同样可以辅助培养组学的进一步完善，使得我们可以从人体微生物“暗物质”中获取到更多可利用的物质。总而言之，挖掘人类未经培养的微生物菌群是一个挑战，但同时意味着巨大的机遇。

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基金资助

国家自然科学基金(21977020)

广东省重点研发专项(2018B020205002)

广东省科学院创新驱动发展专项(2020GDASYL-20200301002)