佛斯特拉古菌门（Verstraetearchaeota）研究进展

Research progress of the archaeal phylum Verstraetearchaeota

摘要

产甲烷古菌广泛分布在缺氧环境中，是有机质厌氧降解产甲烷过程中的关键功能微生物。它们在全球碳元素循环、气候变化等方面发挥着十分重要的作用。传统观念认为产甲烷古菌仅分布在广古菌门（Euryarchaeota）中，最新研究发现一系列新的非广古菌门（non⁃Euryarchaeota）产甲烷古菌，推测其不仅具有产甲烷能力，可能还具有发酵复杂有机物的代谢潜力。本文围绕佛斯特拉古菌门（Verstraetearchaeota）产甲烷古菌，系统阐述了它的系统分类、碳代谢机制和生态学分布等方面的研究进展，并展望了未来发展趋势。

Abstract

Methanogenic archaea are widely distributed in anoxic environments and are the key functional micro⁃organisms in the process of anaerobic degradation of organic matter. They play a very important role in the global carbon cycle and climate change. Traditionally， methanogenic archaea are believed to only distribute in the phylum of Euryarchaeota， however， a series of non⁃Euryarchaeota methanogenic archaea have been found in the latest researches. It is speculated that the new archaea not only have methanogenic ability， but also have the metabolic ability of fermenting complex organic matter. This review focuses on methanogens of the archaeal phylum Verstraetearchaeota， summarizes research progresses of its systematic taxonomy， carbon metabolism and ecological distributions， and anticipates the trends of future research directions.

Graphical abstract

关键词

产甲烷古菌 / 佛斯特拉古菌门 / 系统分类 / 碳代谢 / 生态学分布

Key words

methanogen / Verstraetearchaeota / systematic taxonomy / carbon metabolism / ecological distribution

0 引 言

产甲烷古菌进化历程最早能追溯到34.6亿年前，是最古老的生命形式之一^［1］，其甲烷生成途径可能是最古老的代谢机制之一^［2］。产甲烷古菌是一类严格厌氧古菌^［3］，能够通过CO₂还原途径（又称氢营养型）、乙酸发酵途径（又称乙酸营养型）和甲基裂解途径（又称甲基营养型），将厌氧发酵过程产生的C1和C2化合物（例如：CO₂、乙酸盐、甲醇等）转化为甲烷并获取能量^［4］。全球每年进入大气中的甲烷约为500~600 Tg，其中生物成因产生的大气甲烷排放量占比约70%，产甲烷代谢是主要来源，因此它对于气候变化也有着十分显著的影响^［5~7］。产甲烷古菌广泛分布在自然界中的厌氧环境中，包括湿地、水稻农田、反刍动物胃肠道、海洋和淡水沉积物、厌氧消化器、高温热泉等^［6、8］。传统观点认为所有的产甲烷古菌均属于广古菌门（Euryarchaeota），并被划分为8个目，分别为甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷胞菌目（Methanocellales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷马赛球菌目（Methanomassiliicoccales）、甲烷微球目（Methanomicrobiales）、甲烷泡碱目（Methanonatronarchaeales）^［9］、甲烷火菌目（Methanopyrales）、甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）^{［10，11］}。宏基因组学等技术的研究发现了非广古菌门新型产甲烷古菌谱系，包括佛斯特拉古菌门（Verstraetearchaeota）、深古菌门（Bathyarchaeota）等^{［12，13］}。本文重点围绕佛斯特拉古菌门古菌，分别从系统分类、碳代谢机制、生态学分布等方面，介绍非广古菌门产甲烷古菌的研究进展与趋势。

1 佛斯特拉古菌门的系统分类研究

自从产甲烷古菌被发现存在于非广古菌门中之后，产甲烷古菌的系统发育地位也变得越来越丰富。其中佛斯特拉古菌门古菌就是Vanwonterghem等最早发现并命名的，他们在2016年报道，从缺氧环境中拼接获得的基因组（metagenomic assembled genome， MAG），发现了与之前研究有差异的甲基辅酶M还原酶（methyl⁃coenzyme M reductase， Mcr）基因，其中5个MAGs（V1~V5）的系统发育分析表明它们不属于之前划分的任何产甲烷谱系，所以将其划分到佛斯特拉古菌门^［14］。这5个MAGs属于新纲（Candidatus Methanomethylia）新目（Ca. Methanomethyliales）和新科（Ca. Methanomethyliaceae），V1~V3属于Ca. Methanomethylicus，V4~V5属于另一个新属Ca. Methanosuratus。来自纤维素厌氧降解反应器的V1和棕榈油厌氧降解反应器的V2，属于Ca. Methanomethylicus mesodigestum。来自尾矿池异构烷烃降解产甲烷富集培养物的V3代表生物划分到Ca. Methanomethylicus oleusabulum。来自煤层水CD⁃8和PK⁃28的V4和V5代表生物划分到Ca. Methanosuratus petracarbonis。自从Ca. Verstraetearchaeota古菌被发现以后，又陆续从其他环境中发现了此类古菌。2019年，有学者从俄罗斯西西伯利亚地热水中发现了佛斯特拉古菌门新成员的完整基因组Ch88^［15］。系统发育分析表明它与Vanwonterghem等^［14］在2016年发现的V4~V5来自相同的属Ca. Methanosuratus，并最后将其命名为Ca. Methanosuratus subterraneum。同年，研究者从美国黄石国家公园热泉沉积物中获得两个佛斯特拉古菌门的MAG：OP bin 008和OP bin 054，属于佛斯特拉古菌门的一个新目Ca. Methanohydrogenales，并将其命名为Ca. Methanohydrogenicus​ thermophilus^［16］。他们又分析了Eloe⁃Fadrosh等^［17］上传的基因组，发现了JZ bin 30属于佛斯特拉古菌门的一个新目Ca. Methanomediales，将其命名为Ca. Methanomedium jinzeense。此外，还发现了Ca. Methanohydrogenales的两个新成员JZ bin 37和JZ bin 38，并分别将其命名为Ca. Methanohydrogenicus jinzeense和 Ca. Methanohydrogenicus ​thermophilus。此外，上海交通大学王风平团队和法国巴斯德研究所Borrel等国际团队联合在Nature Microbiology同期发表文章^{［18，19］}，前者从美国沃什伯恩热泉中获得WYZ⁃LMO10和WYZ⁃LMO11基因组，后者从美国黄石公园热泉中获得Verst⁃YHS基因组，系统发育分析显示它们均属于佛斯特拉古菌门。中山大学李文均教授等带领的国际团队^［20］从中国腾冲热泉也获得5个佛斯特拉古菌门基因组（JZ⁃2 bin_200、JZ⁃3 bin_106、JZ⁃3 bin_107、GMQP bin_44和DRTY⁃6 bin_144），并将其划分到了泉古菌门（Crenarchaeota），并将JZ⁃2 bin_200、JZ⁃3 bin_106、JZ⁃3 bin_107和DRTY⁃6 bin_144命名为Ca. Methanomethylovorus thermophilus，将GMQP bin_44命名为Ca. Methanomethyloarchaeum antiquum。综上所述，目前已发表佛斯特拉古菌门古菌主要分为两大类^［14~21］：Ca. Verstraetearchaeota和unclassified Ca. Verstraetearchaeota。在Ca. Verstraetearchaeota中主要分为五个目Ca. Methanomethyliales，Ca. Methanohydrogenales，Ca. Methanomediales，Ca. Methanomethylovorales和Ca. Methanomethyloarchaeales；五个科Ca. Methanomethyliaceae，Ca. Methanohydrogenicaceae，Ca. Methanomediaceae，Ca. Methanomethylovoraceae和Ca. Methanomethyloarchaeceae；六个属Ca. Methanomethylicus，Ca. Methanosuratus，Ca. Methanohydrogenicus，Ca. Methanomedium，Ca. Methanomethylovorus和Ca. Methanomethyloarchaeum；九个种Ca. Methanomethylicus mesodigestum，Ca. Methanomethylicus oleusabulum，Ca. Methanosuratus petracarbonis，Ca. Methanosuratus subterraneum，Ca. Methanohydrogenicus thermophilus，Ca. Methanohydrogenicus ​jinzeense，Ca. Methanomedium jinzeense，Ca. Methanomethylovorus thermophilus和Ca. Methanomethyloarchaeum antiquum，详情见图1和表1。

2 佛斯特拉古菌门的碳代谢机制及储能方式研究

传统上，将产甲烷途径分为三大类^［22］。①CO₂还原途径也称为氢营养型产甲烷途径，代谢底物主要是H₂和CO₂，其中H₂作为主要的电子供体，CO₂作为被还原底物^［10］。这种途径在广古菌门六个产甲烷古菌目（甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷微球目、甲烷八叠球菌目、甲烷火菌目和甲烷胞菌目）中都有报道^{［3，6，22，23］}。②甲基裂解途径又称为甲基营养产甲烷途径，甲醇、甲胺和甲硫醇等化合物中的甲基首先通过甲基转移酶1转移到类咕啉蛋白中，再通过甲基转移酶2转移到辅酶M中，最终被还原为甲烷。在甲烷八叠球菌目、甲烷马赛球菌目和甲烷泡碱目中也分布着甲基营养型产甲烷古菌^{［9，11，22］}。根据产甲烷古菌是否含有细胞色素，可将其分为H₂依赖性甲基营养型（无细胞色素）和非H₂依赖性甲基营养型（含细胞色素）^［24］。H₂依赖性甲基营养型是以H₂作为电子供体提供电子，直接还原甲基类化合物产生甲烷，该机制在已培养的Methanofastidiosa和甲烷马赛球菌目，以及未培养的深古菌门和佛斯特拉古菌门中都有报道^［23］。非H₂依赖性甲基营养型是通过膜结合电子传输链将甲基氧化为CO₂，提供电子再还原甲基产生甲烷。③乙酸发酵途径又称为乙酸营养型产甲烷途径，其中羧基被氧化为CO₂，甲基被还原为CH₄，目前被发现存在于甲烷八叠球菌目^［7］。以上三种主要的产甲烷途径的共同点是甲烷生成的最后一步都需要甲基辅酶M还原酶的催化。

2.1 佛斯特拉古菌门产甲烷代谢

2.1.1 甲基营养型产甲烷代谢

Ca. Methanomethylicus和Ca. Methanosuratus的MAG中发现许多与甲基营养型产甲烷有关的关键基因，而缺少氢营养型和乙酸营养型产甲烷的基因，推测其代谢与H₂依赖性甲基营养型产甲烷相关^［14］。该代谢主要涉及完整的甲基辅酶M还原酶基因（mcrABG和辅助基因mcrCD），具有保守的辅酶M（CoM⁃HS）、辅酶B（CoB⁃HS）和F₄₃₀辅助因子的结合位点，mtaA、mtsA、mtbA和mtmB等一系列参与甲醇、甲硫醇以及甲胺类化合物甲基裂解的相关基因，以及四氢甲基蝶呤S⁃甲基转移酶H亚基基因（mtrH）等。然而，对于产甲烷的最后一步异二硫键（CoM⁃S⁃S⁃CoB）的还原似乎存在三种可能的机制^［14］：①在HdrABC/MvhADGB复合体存在条件下，MvhADGB将2份H₂氧化为4份H⁺并产生电子，其中一部分电子传递给HdrABC用来使CoM⁃S⁃S⁃CoB断裂，另一部分电子被用于还原铁氧还蛋白将Fd_ox变为Fd_red，之后膜上的F₄₂₀⁃甲烷吩嗪氧化还原酶类似物（Fpo⁃like）或储能氢酶（Ehb）能将还原型Fd_red氧化并泵出H⁺/Na⁺形成跨膜离子梯度，通过V/A型ATPase产生ATP；②异二硫键还原酶D亚基（HdrD）直接与Fpo⁃like相互作用，能还原CoM⁃S⁃S⁃CoB，并泵出H⁺/Na⁺形成跨膜离子梯度，通过V/A型ATPase产生ATP；③可能是由编码胞质黄素腺嘌呤二核苷酸脱氢酶基因（glcD，其编码基因与乳酸脱氢酶编码基因序列相似）与hdrD共定位而实现的一种CoM⁃S⁃S⁃CoB还原与乳酸利用相耦合的机制，此机制不泵出H⁺/Na⁺用于形成跨膜离子梯度。

Ca. Methanosuratus subterraneum Ch88基因组中发现了甲基辅酶M还原酶复合物编码基因（mcrABG与辅助成分C和A2）和利用甲醇作为甲基供体产甲烷的甲基转移酶基因的存在，所以推测其具有甲基营养型产甲烷作用^［15］。甲醇作为甲基供体能够在Mta的催化下和CoM⁃HS形成CH₃⁃S⁃CoM，再在Mcr的催化下与CoB⁃HS形成CH₄和CoM⁃S⁃S⁃CoB。对于CoM⁃S⁃S⁃CoB的还原可能存在两种机制：①该机制与Vanwonterghem等^［14］提出的第一种机制类似，即在HdrABC/MvhADGB复合体存在条件下，氧化H₂并将释放的电子进行还原铁氧还蛋白和CoM⁃S⁃S⁃CoB，之后储能氢酶（Ehb）将还原型Fd_red氧化和产生H₂并泵出H⁺/Na⁺形成H⁺/Na⁺跨膜梯度，通过V型ATPase产生ATP；②通过HdrD和NADH脱氢酶类似膜复合物（NDH）的结合物还原CoM⁃S⁃S⁃CoB，并将还原型Fd_red氧化和泵出H⁺/Na⁺，最后通过V型ATPase产生ATP。

前述报道中来自中国腾冲的JZ⁃2 bin_200、JZ⁃3 bin_106、JZ⁃3 bin_107、GMQP bin_44和DRTY⁃6 bin_144，缺少二氧化碳还原途径，但是存在甲基转移酶/冠状蛋白编码基因、fpo基因以及核心产甲烷基因（mcrABGCD，hdrD，glcD，mtsA，mtaA，mttBC），推测它们具有H₂依赖性甲基营养型产甲烷的潜力^［20］。由于佛斯特拉古菌门的MAGs中不存在hdrABC，但存在hdrD和glcD，所以推测CoM⁃HS和CoB⁃HS再生机制可能通过HdrD⁃GlcD复合体完成。它也可以通过Methanomassiliicoccales^{［24， 25］}和Methanofastidiosales^［26］类似的能量储存策略，即存在Fpo⁃like和HdrD⁃like能够再生CoM⁃HS和CoB⁃HS，同时会伴随质子的跨膜最终生成ATP。类似的，Wang等^［18］也发现了H₂依赖性甲基营养型产甲烷途径相关的编码基因。

2.1.2 氢营养型产甲烷代谢

与Ca. Methanomethyliales的甲基营养型产甲烷相比，Ca. Methanohydrogenales具有三个产甲烷基因簇：①mcrABGCD、mtrABCDEGH和hdrABCD；②具有构成WLP（Wood⁃Ljungdahl Pathway）^［2］的基因：cdhABGDE、甲酰甲基呋喃脱氢酶基因（fwdABCDE）；③还原辅酶F₄₂₀脱氢酶基因（frhABDG）^［16］。Ca. Methanohydrogenales存在WLP和产甲烷关键的三个基因簇，这表明Ca. Methanohydrogenales具有潜在的氢营养型产甲烷潜力。对于产甲烷最后一步产生的CoM⁃S⁃S⁃CoB还原过程，Ca. Methanohydrogenales中存在共位的hdrABC基因和［Ni，Fe］氢化酶mvhADG同系物基因并且同区域还有甲酸脱氢酶基因存在，推测HdrABC/MvhADG复合体能够将代谢甲酸产生的H₂转变为H⁺释放电子，一部分电子用于还原CoM⁃S⁃S⁃CoB，另一部分用于产生还原铁氧还蛋白Fd_red。膜蛋白氧化Fd_red，并伴随着H⁺的泵出形成质子梯度，再经过V型ATPase质子内流产生ATP。进一步研究预测了氢营养型产甲烷可能是最古老的能量代谢途径之一，并推测甲基营养型产甲烷途径可能是氢营养型产甲烷菌为适应某些特定生境所进化形成的^［16］。Borrel等^［19］发现的Verst⁃YHS（Ca. Methanomethyliales/Verstraetearchaeota）MAG产甲烷途径预测为甲基依赖性氢营养型产甲烷，具体代谢功能尚不清楚。

2.2 佛斯特拉古菌门非产甲烷代谢

在佛斯特拉古菌门的MAG研究中，发现除了产甲烷代谢途径外，还存在潜在的厌氧发酵产能代谢途径。Ca. Methanomethylicus和Ca. Methanosuratus可能存在三种厌氧发酵产能代谢途径：糖发酵代谢、核苷酸补救途径、多肽和氨基酸降解代谢^［14］。Ca. Methanohydrogenales OP bin 008和Ca. Methanosuratus Ch88也发现了蛋白质和/或糖代谢的相关途径^{［15，16］}。由于检测到EMP途径的两个关键酶（烯醇酶和磷酸甘油酸变位酶），但未发现糖转运系统，所以推测Ch88具有细胞内糖代谢功能。还在Ch88中发现了蛋白质发酵生长所需的代谢途径，具有编码肽转运蛋白的基因，以及细胞内代谢产酮酸的细胞内肽酶、谷氨酸脱氢酶和氨基转移酶的编码基因。在JZ⁃2 bin_200、JZ⁃3 bin_106、JZ⁃3 bin_107和GMQP bin_44中发现存在核糖⁃1，5⁃二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCOs），其中GMQP bin_44具有Ⅲ⁃b RuBisCOs，可能具有核苷酸补救途径，剩下三个JZ⁃2 bin_200、JZ⁃3 bin_106和JZ⁃3 bin_107被归类为Ⅲ⁃a RuBisCOs，它可能具有潜在的还原性己糖磷酸途径^［20］。

综上所述，佛斯特拉古菌门可能具有的厌氧发酵代谢产能途径为：①糖代谢：能够利用糖作为碳源通过EMP途径和丙酮酸⁃铁氧还蛋白氧化还原酶（Por）生成乙酰辅酶A；②核苷酸补救途径：通过编码核糖⁃1，5⁃二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）在核苷酸补救途径中由AMP生成3⁃磷酸甘油酸，再进入EMP途径产生乙酰辅酶A；③蛋白质降解途径：具有潜在的肽和氨基酸降解能力，通过各种酶将其降解为酮酸，再通过铁氧还蛋白氧化还原酶（Kor、Ior、Por和Vor）和醛/铁氧还蛋白氧化还原酶（Aor）将酮酸转化为乙酰辅酶A。上述三种代谢产生的乙酰辅酶A可以通过ADP形成的乙酸合酶（Acd）转化为乙酸盐，并通过底物水平磷酸化产生ATP^［14］。

3 佛斯特拉古菌门的生态学分布

Vanwonterghem等^［14］根据16S rRNA基因和mcrA基因比对，发现佛斯特拉古菌门古菌主要分布在产甲烷颗粒污泥反应器、淡水湖深层沉积物、地下油藏及热泉中。根据测序数据库（sequence read archive， SRA）检索相关序列分析发现，佛斯特拉古菌门古菌在湿地、湖泊和河口沉积物、土壤和富烃环境等均被检出^［14］。在地下沉积环境（如热泉、地下水和油藏）发现了Ca. Methanosuratus⁃like的16S rRNA基因^［15］。关于已发表文献中佛斯特拉古菌门古菌的具体分布信息详见表1。此外，我们通过IMNGS数据库（https：//www.imngs.org/）也同样检索到与佛斯特拉古菌门古菌同源性超过99%的相关16S rRNA基因序列，并筛选了五个相对丰度大于1%的样品信息（表2）^［27］。这些独立研究表明，佛斯特拉古菌门古菌在全球厌氧环境中广泛分布，可能在元素生物地球化学循环中发挥着尚未认知的作用^［4］。

4 总结与展望

这些新型产甲烷古菌尚未获得纯培养物，对该类古菌的代谢及储能机制研究还处在基因组预测阶段。目前，本课题组运用实验室较为完善的厌氧培养操作技术及各种检测设备，经过多年的努力已经从油藏环境中获得了佛斯特拉古菌门古菌的富集培养物，并建立了特异性监测佛斯特拉古菌门古菌的分子生态学方法。为后期深入探究佛斯特拉古菌门古菌的生理生态功能奠定了基础。未来可能需要朝着以下几个方向开展研究：①定向分离这类未培养的产甲烷古菌：结合组学技术、传统和新型微生物培养方法，获得含有高丰度未培养产甲烷古菌的富集培养物，并进一步分离纯化获得纯培养物，从而通过实验验证其产甲烷代谢和非产甲烷代谢的分子机制；②产甲烷古菌的系统分类与进化研究：随着非广古菌门产甲烷古菌的不断发现，我们可能也会发现新的产甲烷代谢机制和划分出新的系统发育地位，这需要我们不断地研究和完善产甲烷古菌谱系；③产甲烷古菌的生态学分布特征：不同产甲烷古菌的生态学分布特征，以及对全球碳循环的贡献。

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基金资助

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