珠江口城市段近岸表层水体浮游细菌分离方法比较

Comparison study on the isolation of bacterioplankton from surface water of urban nearshore of Pearl River Estuary

摘要

为了更好地分离珠江口未/难培养的浮游细菌，本研究以珠江河口三个样点的水体为研究对象，同时采用了纯培养和免培养的方法，对不同培养基的分离效果进行了探索。在纯培养实验中，本研究选择了7种不同的分离培养基，共分离获得153株菌；同时，将扩增子分析结果作为分离效果的参考，所有环境样品中共包含3 553个操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）。对三个样点微生物类群的多样性进行比较，纯培养结果显示珠江口下游珠海样点多样性最高，其次为中大和虎门样点；免培养则显示虎门样点多样性最高；对比7种不同的分离培养基，Z7（R₂A）培养基的分离效果最好，分离菌株数和分离类群的α多样性最高，Z1（改良ISP 2）次之；主坐标分析结合韦恩图的结果表明相比其余的培养基，Z1和Z7培养基分离获得的菌群兼具普遍性和特异性，进一步证明了这两种培养基的分离效果较佳；冗余分析结果表明K₂HPO₄、酵母粉、可溶性淀粉、MgSO₄·7H₂O、麦芽膏和葡萄糖与特定类群的分离有相关关系，其中K₂HPO₄的影响最为显著（P<0.05）。本文通过7种不同培养基对河口微生物分离效果的探究，有助于我们在研究未知微生物的营养特性时，选择成分和组成更合理的培养基来提升河口微生物纯培养的分离效率。

Abstract

To efficiently isolate the unculturable bacterioplankton in estuary area， culture⁃dependent and culture⁃independent methods were adopted in this study to assist bacterial isolation from three water samples of the Pearl River Estuary using different media. A total of 153 bacterial strains were isolated by using seven media. On the other side， a total of 3，553 OTUs （operational taxonomic units） were obtained from the samples by using Illumine sequencing. By comparison， the highest diversity of bacterial isolates was observed in the Zhuhai sample， followed by Zhongda and Humen samples using culture⁃dependent method； however， the highest diversity of bacterial community was observed in the Humen sample using culture⁃independent method. Furthermore， among the seven isolation media， Z7 （R₂A） exhibited the best performance on bacterial isolation， followed by Z1 （modified ISP2）. Principal co⁃ordinates analysis and Venn diagram showed that the bacteria isolated from Z1 and Z7 media were both universal and specific， which proved that the two media had better isolation effect. Redundancy analysis demonstrated that particular components including K₂HPO₄， yeast extract， soluble starch， MgSO₄·7H₂O， malt extract， and glucose in the media were closely related to specific bacterial groups， and K₂HPO₄ had the most significant influence （P<0.05）. The results of this study will help to select suitable and efficient media for bacterioplankton isolation in estuary areas， especially when the nutritional characteristics of the targeted microorganisms are unknown.

Graphical abstract

关键词

珠江河口城市段 / 浮游细菌 / 纯培养方法 / 多样性

Key words

urban area of Pearl River Estuary / bacterioplankton / culture⁃dependent method / diversity

0 引 言

河口地貌分布广泛，其共同特征表现为淡水和海水的交汇，这种特征导致了河口系统环境的复杂多变，为不同细菌的生长提供了环境，从而形成了高多样性的河口细菌群落^［1］。细菌是河口生态系统中重要的组成成分，在维持河口生态系统的稳定性中发挥着重要作用。珠江口是我国南方最大的河口，复杂的河网系统使得河流生态系统与海洋生态系统的交互作用十分剧烈且复杂，同时珠江口属于粤港澳大湾区范围，这里经济发达、人口稠密，人类活动极大地影响了生态系统中浮游细菌群落的组成和结构^［2］，因此，对珠江口浮游细菌群落多样性的研究有助于了解河口生态系统质量和功能的转变，从而指导我们对环境的保护以及对资源更好的利用。目前对珠江河口细菌类群和功能的研究主要有免培养和纯培养两种方式。免培养主要通过对样点微生物的宏基因组进行高通量测序，然后进行序列组装、比对，可知整个群落微生物的组成及相对丰度，深入分析序列还可研究相关功能基因^［3］；但是，免培养分析无法对单个细菌的生理生态进行研究和验证，而且分析结果与现实中基因或蛋白的确切功能差距较大^［4］。而纯培养则可以充分挖掘微生物资源，并对目标菌株进行深入的代谢和功能研究，或者验证免培养分析所推测到的信息^［5］，所以分离培养技术依旧是研究环境微生物的重要手段。此外，对河口环境细菌资源的挖掘，有利于进一步研究细菌在河口系统中的生态功能^［6］。

目前已得到纯培养的微生物不及总数的0.1%^［7］。其中，浮游细菌的纯培养高度集中在少数优势类群，而其余则被划分为未/难培养微生物^［8］。由于对未培养细菌的营养需求以及细菌之间的相互作用缺乏研究^［9］，如何分离培养环境中的未培养细菌是当前微生物资源发掘的重点和难点。其中，选择合适的分离培养基是纯培养技术的主要发展方向之一，尤其是利用改良培养基模拟原生环境中的营养成分及浓度^［7］。但分离培养基种类繁多，效果各异，且缺乏分离珠江河口环境微生物的针对性研究，十分不利于河口微生物资源的挖掘。

本文重点研究了7种不同培养基的分离效果，通过利用不同培养基对珠江口水样的细菌进行了分离培养和鉴定，并与同一样品的免培养结果进行比较，旨在评估纯培养的分离效果，评价这7种分离培养基的优劣，包括分离微生物的菌株数和多样性；此外，还对不同分离培养基成分与特定微生物类群的相关关系进行了初步探索，从而为更好地分离培养河口微生物提供指导。

1 材料和方法

1.1 样品来源及样点信息

本研究所用样品为2016年5月采集于中国珠江河口流域上⁃中⁃下游的中大（ZD）、虎门（HM）、珠海（ZH）三个样点。详细记录采集样点的经、纬度等信息（表1），将采集得到的样品置于4 ℃冰箱保存。

1.2 现场理化参数测定

采样现场用哈希水质分析仪（HACH 2100Q）和便携式浊度计（HACH 2100Q）测量水温（temperature，T）、盐度（salinity，S）、导电率（conductivity，Cond）、溶解氧（dissolved Oxygen，DO）、酸碱度（pH）、浊度（turbidity，TU）、氧化还原电位（oxidation reduction potential，ORP）等现场参数（表1）。

1.3 样品预处理

在无菌条件下量取5 mL水样与45 mL无菌水于250 mL无菌三角瓶中稀释至原浓度的1/10，并在28 ℃、180 r/min条件下震荡1 h，再用无菌水继续梯度稀释至原浓度的百分之一和千分之一，最后吸取100 μL涂布于分离培养基上，在28 ℃培养箱中倒置培养2 wk，观察菌株生长状况，并进行后续的菌株鉴定及统计。

1.4 分离培养基

本研究使用7种培养基对珠江河口水体样品的细菌进行分离（表2），并在每种培养基中加入制霉菌素抑制真菌的生长，使其最终浓度达到50 mg/L。

1.5 菌株纯化与保藏

从分离平板上挑取单菌落，采用平板划线法将其接种于另一新鲜R₂A培养基上，置于28 ℃培养箱至菌落长出，定期观察并判断菌落的生长情况，对不纯的菌株继续纯化，重复这一步骤直至得到纯化的单菌落。使用甘油管及R₂A斜面两种保藏方法对纯化的已生长成熟的菌株进行保藏，以待备用。

1.6 菌株基因组DNA的提取、扩增和测序

根据平板上菌株菌落生长情况和形态，对分离纯化后的菌株进行初步的鉴定及去重复，并对去重复后余下的菌株进行基因组DNA的提取纯化：从平板上挑取50 mg新鲜菌体于EP管中，加入溶菌酶及TE 缓冲溶液，在37 ℃摇床反应7 h，再加入SDS溶液和蛋白酶K，55 ℃水浴锅加热60 min。加酚氯仿（体积比25∶24∶1）抽提两次，然后加入乙醇和醋酸钠洗涤。在55 ℃烘箱彻底干燥后，加入TE缓冲液溶解DNA，并置于-20 ℃低温保存备用。

对纯化的DNA进行16S rRNA基因的扩增和测序。扩增体系根据常用细菌PCR扩增的反应体系和反应条件进行。PCR所用的dNTPS和Taq酶购于广州擎科生物技术公司。PCR 扩增采用通用引物PA/PB作为正反向引物（正向引物PA：5’⁃CAGAGTTTGATCCTGGCT⁃3’，反向引物PB：5’⁃AGGAGGTGATCCAGCCGCA⁃3’）。PCR反应产物采用凝胶电泳的方法来检测。检测实验使用8 g/L琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，上样量为2 μL，电压120 V电泳20 min。对照为DL2000 DNA Marker，使用凝胶成像仪检测结果，目的条带位于1 500 bp左右，送广州擎科生物技术公司有限公司测序。

1.7 菌株的系统发育分析

测得的序列利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）工具在NCBI（美国国家生物技术信息中心）数据库和EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net）网站上进行比对^{［10，11］}，判定序列之间的相似度，选取相似度最高的模式菌株的16S rRNA基因序列作为参考序列，使用MEGA 7.0（molecular evolutionary genetics analysis）^［12］进行系统发育树的构建与分析。

1.8 环境DNA提取、测序和分析

将每个样点的水样用0.2 μm孔径膜过滤，总RNA提取采用PowerSoil总RNA分离试剂盒（MO BIO），同时保留RNA捕获柱，利用PowerSoil DNA洗脱附件试剂盒（MO BIO）进一步提取DNA。提取的RNA经M⁃MLV第一链cDNA合成试剂盒（Omega Bio⁃Tek）逆转录成cDNA。参考Fierer等^［13］的方法，对16S rRNA基因的V4~V5区域进行扩增，然后使用Illumina测序平台进行16S rRNA基因扩增子双端（2×300 bp）测序。测序后的原始reads在Mothur（版本1.36.1）软件中基于重叠区域进行组装拼接^［14］，保留长度在360 bp以上的序列进行序列注释。使用USEARCH version 8.0软件（USPARCE算法）将组装好的原始序列以97%的相似阈值聚成操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs），同时删除嵌合序列。利用RDP分类器^［15］确定OTUs的分类隶属关系，置信阈值为0.8。最后合并DNA与cDNA得到的OTU列表。

1.9 统计分析

使用R软件的vegan和spaa包对三个样点的纯培养和免培养结果进行物种多样性分析，包括Shannon index、Simpson index和Chao 1 index的计算^［16］。

主坐标分析（Principal Co⁃ordinates Analysis，PCoA）使用R的vegan包，计算Bray⁃curtis距离，最终结果用ggplot2包绘图；同样利用vegan包进行冗余分析（redundancy analysis，RDA），使用ggplot2绘图，然后用方差分析的anova函数对RDA的变量进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 纯培养分离与免培养分析的比较

珠江河口水体环境的3份样品通过纯培养分离共获得153株菌。测定16S rRNA基因序列并与数据库比对后发现，这153株菌隶属于5门9纲18目29科4属。

所有分离菌株在门和纲水平上的分布如表3所示，其中变形杆菌门（Proteobacteria）的α⁃变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β⁃变形菌纲（Betaproteobacteria）、γ⁃变形菌纲（Gammaproteobacteria）为主要类群，占所有菌株的74.5%。

在属水平上，寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）占主要优势，共分离到29株菌，占全部分离菌株的19.0%，其次依次为苍白杆菌属（Ochrobactrum）、无色杆菌属（Achromobacter）、新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）和微杆菌属（Microbacterium），所占比例依次为9.2%、8.5%、7.2%和5.2%。另外，本次也分离到短单胞杆菌属（Brachymonas）、嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）和戴尔福特菌属（Delftia）等稀有菌属。

除此之外，将本次分离到的菌株16S rRNA基因序列与EzBioCloud数据库^［11］比对后发现，有22株菌的序列相似度低于98.7%，属于潜在新种或潜在更高分类单元^［17］，占所有菌株总数的14.4%。这个结果展示了珠江河口水体环境未培养细菌资源丰富，所用培养基整体上也具备良好的分离效果。

免培养的结果显示，三个环境样点中一共包括3 553个OTUs，来自53门130纲257目462科852属。与之相比，纯培养分离到属的数量仅为免培养分析结果的5.05%（图1）。同纯培养的结果相一致，占比为43.8%的变形杆菌门（Proteobacteria）是该环境中最丰富的微生物类群。

免培养中所得OTUs在门水平上分布的主要类群见表4。在免培养结果中，浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、酸杆菌门（Acidobacteria）和俭菌总门（Parcubacteria）的OTU数目均多于异常球菌⁃栖热菌门（Deinococcus⁃Thermus），但在纯培养过程中并未分离到上述门类中的任何菌株。在纲水平上，优势类群主要为γ⁃变形菌纲（Gammaproteobacteria）（21.6%）、β⁃变形菌纲（Betaproteobacteria）（15.5%）、黄杆菌纲（Flavobacteriia）（10.1%）、蓝细菌纲（Cyanobacteria）（8.1%）和放线菌纲（Actinobacteria）（7.8%），其中，纯培养并未分离到蓝细菌纲的菌株。

此外，16S rRNA基因扩增子结果还呈现了163个古菌OTUs，分属8门15纲23目32科38属，说明珠江口水样同样含有丰富的待挖掘的古菌资源。

进一步对纯培养和免培养的结果分样点分析，纯培养结果显示，处于下游的珠海样品分离到的菌株数量和α多样性最高（图2），其分离到的91株菌来自5门9纲12目19科28属；处于上游的中大样点分离菌株的数量和多样性仅次于珠海样点，来自5门8纲14目18科23属；菌株数量和多样性最低是处于中游的虎门样点，分离得到的16株菌来自3门5纲8目10科11属。

然而，对三个样点免培养结果的α多样性分析却与纯培养呈现不一致的结果。由图2可知，16S rRNA基因扩增子测序的结果表明，处于中游的虎门样点多样性最高，而处于下游的珠海样点的多样性最低，由于分离条件的限制，此多样性大小顺序与纯培养并未呈现一致性。

2.2 不同分离培养基分离获得的菌株多样性

除了不同样点分离的菌株差异显著外，不同培养基也具有不同的分离效果。本研究共选用了7种不同的分离培养基，每种培养基的分离菌株数、属的数量及α多样性指数如图3所示。由图3可知，Z7培养基分离效果最佳，分离菌株数和三种多样性指数均最高，Z1也具备较好的分离效果，虽然分离菌株总数不及Z7培养基，但分离菌株多样性仅略低于Z7，而其余5种培养基的分离效果欠佳。

2.3 不同培养基分离获得菌株的类群比较

在7种培养基分离菌株总数和多样性各异的情况下，本研究进一步对属水平上的微生物类群进行了PCoA分析，比较不同培养基分离出的微生物种类差异。分析结果以主坐标PC1和PC2为坐标轴，绘制PCoA二轴排序图（图4）。结果显示，7种培养基分离出的微生物类群在属水平上差异较大。图中距离较为相近的有左下角的Z4和Z6，以及右侧的Z1和Z7。结合7种培养基分离微生物类群的韦恩图（图5），Z4是唯一未分离到独有类群的培养基，而且总体微生物类群与Z6相似，说明Z4在这7种培养基中的可替代性最高。Z1和Z7作为分离菌株数最多的两种培养基，共有菌株也相对较多，所以两者在PCoA图中距离较近，根据韦恩图结果，Z1和Z7也与其它5种培养基有较多共有类群，尤其是Z3和Z5（在PCoA图中的距离也更为相近），而且分离到的独有属数量也最多，进一步证明了这两种培养基相较于其它5种培养基的分离效果最好，分离的菌株兼具普遍性和特异性。

2.4 培养基成分与分离菌株类群之间的相关性

本研究中选用了7种不同的分离培养基，分离效果各异。为了探究培养基成分对其分离效果有何影响，本研究将培养基成分作为环境因子，在属水平上对纯培养菌株进行了冗余分析。结果显示：前两个轴响应变量的总方差的累积解释率为49.35%，即RDA1和RDA2轴的解释量分别为28.21%和21.14%。然后，利用ANOVA进行显著性检验，可得培养基各成分对方差的贡献率及显著性水平。结果显示，对分离菌株有影响的培养基成分依次为K₂HPO₄、酵母粉、可溶性淀粉、MgSO₄·7H₂O、麦芽膏和葡萄糖（图6），但方差分析的结果显示，只有K₂HPO₄的影响较为显著（P<0.05）。

结合不同属在图中的分布，RDA分析的结果表明：图6右部，鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、微球菌属（Micrococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）都与葡萄糖和K₂HPO₄都有较明显的正相关关系；图上半部分，无色杆菌属（Achromobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）与MgSO₄·7H₂O有较强正相关关系；图左下部分，新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、微杆菌属（Microbacterium）和丛毛单胞菌属（Comamonas）与可溶性淀粉和麦芽膏有一定正相关关系，而与酵母粉、K₂HPO₄和葡萄糖成显著负相关。而其余集中于原点和根部的类群与图中所示培养基成分相关关系较微弱或不明显。

3 讨 论

本研究主要选取了7种不同的培养基，对珠江口水样的细菌进行了分离培养和鉴定，并与同一样品的免培养结果进行比较，重点评估不同培养基的分离效果，并初步探究了影响较大的培养基成分。

纯培养分离到的主要类群依次为变形杆菌门（Proteobacteria）的α⁃变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β⁃变形菌纲（Betaproteobacteria）和γ⁃变形菌纲（Gammaproteobacteria），占所有菌株的74.5%，与免培养结果基本一致。有研究用额外添加海水成分的Z4和Z7培养基对南海深海海水进行了分离^［18］，优势类群依次为α⁃变形菌纲和γ⁃变形菌纲，占比68.1%，与本研究结果相似，黄莹等^［19］也利用Z4培养基对马里亚纳海沟水样的分离也呈现了同样的结果，其中变形菌门占比67.8%。而刘玉娟等^［20］利用改良的Z4培养基分离南海沉积物，主要分离到的是浮霉菌门，其次才为变形菌门，后者占比为28.3%。在本次免培养结果中，浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）和疣微菌门（Verrucomicrobia）的OTU数目较多，但在本次纯培养过程中并未分离到任何属于这些门的菌株，所以推测本研究中选择的培养基总的来说更适用于对变形杆菌的分离。并且，基于我们所获得的潜在新分类单元，成功发现了一株变形菌门新属新种Aestuariisphingobium litorale gen. nov. sp. nov.^［21］和一株变形菌门新种Roseibium aestuarii sp. nov.^［22］。

微生物的生长需要碳源、氮源、无机盐和生长因子^{［9，23~25］}，在环境中细菌的营养需求未知的条件下，分离培养需要选择涵盖不同营养元素的培养基，以满足微生物的生长需求。本研究所选择的7种培养基，比较其成分发现，分离效果较差的Z2和Z4培养基，虽然营养充足，但是额外的海盐成分（30 g/L）和多种无机盐（约20 g/L）使得培养基的盐浓度偏高，而其中细菌原始生活条件更倾向于较低盐浓度（表1），从而使得分离结果的多样性极低。而Z3、Z5和Z6培养基分离效果差的原因可能在于Z5含有营养丰富的牛肉膏成分、Z3和Z6的营养物质浓度过高（约20 g/L），而海洋中的微生物多为寡营养型微生物^［26］，培养基中高浓度的营养物质可能会使寡营养型微生物产生大量的、超出自身调节阈值的“毒性氧物质”，此类物质的快速积累会对细胞结构造成损伤，严重时会导致细胞死亡^［8］，并且高浓度的营养物质还会使得优势种群生长过快，同时还会释放出大量过氧化物、超氧化物和自由基等抑制其他类群的生长或者造成其氧化损伤^［27］。相比之下，Z1和Z7培养基的营养成分浓度低但种类丰富，这种寡营养环境在为细菌提供较为全面的营养物质的同时又不会因为高浓度的营养物质使得优势类群生长过快，从而使得Z1和Z7培养基分离到细菌的多样性在这7种培养基中最高。

因此，河口环境的分离培养基选择的关键有以下几点：首先是盐度、温度、pH等理化参数，以接近样品环境最佳（在筛选特殊功能，如耐盐、耐高温等情况除外）^{［8，9，28］}；其次碳氮源的种类要多，并且能够提供生长因子，但终浓度要低，如有必要，可稀释培养基达到寡营养的目的，即采用“稀释培养法”^［29］；最后添加少量多种的无机盐，以满足各种微生物的需求。此外，还可加入其它选择性成分，对目标类群进行定向分离，如在分离海洋放线菌时，可加入抑制细菌、真菌等生长的放线菌酮、利福霉素^［30］或细菌噬菌体^［31］；或者通过添加一些环境中原有的物质，来最大程度还原河口环境，如加入灭菌的海水^［32］和固体海绵组织^［33］，前者可能提供了未知的生长因子和无机盐，后者则可以为营附着型微生物提供物理支撑；还可利用装置直接进行原位培养，如Berdy等^［34］设计的原位分离微芯片技术，分离效果相比常规方法增强了5~300倍，在分离未/难培养微生物上具有非常广阔的应用前景。

冗余分析结果显示对分离菌株影响较大的培养基成分依次为K₂HPO₄、酵母粉、可溶性淀粉、MgSO₄·7H₂O、麦芽膏和葡萄糖，其中，鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、微球菌属（Micrococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）都与葡萄糖和K₂HPO₄都有较明显的正相关关系，推测原因是这些类群的代谢方式与这两种营养成分相关。前人研究胶州湾河口的研究也发现异养细菌数量分布与磷酸盐成显著正相关^［35］。本研究深入分析了培养基成分对河口微生物分离培养的选择性，研究结果有助于我们选择成分更合理的培养基来提升纯培养的分离效率。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31528001)

博士后科研基金项目(2018M643294)

广东省基础与应用基础研究基金(2020A1515011139)