基于细菌共现网络的土壤粘细菌分离

Isolation of soil myxobacteria based on bacterial co⁃occurrence network

摘要

粘细菌是一类分布广泛的捕食性细菌，能够产生种类多样、结构新颖、作用机制独特的天然活性物质。但是粘细菌分离纯化困难且耗时，导致其资源匮乏，这已成为粘细菌开发利用的重要瓶颈之一。基于辅助菌的分离方法是当前获得粘细菌资源的重要方法，然而辅助菌多为大肠杆菌（Escherichia coli）等革兰氏阴性菌。为了获得新的辅助菌和粘细菌资源，本研究基于土壤细菌16S rRNA基因高通量测序数据构建细菌共现网络（bacterial co⁃occurrence network），发现粘细菌⁃细菌子网络中有27%的连接节点为放线菌。因此，本研究选择革兰氏阳性菌球形节杆菌（Arthrobacter globiformis）GDMCC 1.1730作为辅助菌，并在捕食培养基上验证其捕食活性。结果表明该辅助菌能够被所有参与测试的粘细菌（12个物种）所捕食。以GDMCC 1.1730作为辅助菌进行粘细菌的分离，共诱导出11种粘细菌子实体，且包括一种仅由GDMCC 1.1730诱导而大肠杆菌未能诱导出的子实体。本研究基于细菌共现网络和捕食活性验证，提供了一株革兰氏阳性菌作为新的粘细菌辅助菌，该辅助菌能够诱导出土壤中的多种粘细菌子实体，为根据细菌共现网络获取未/难培养微生物资源提供了新的证据。

Abstract

Myxobacteria are a kind of widely distributed predatory bacteria，which can produce natural active substances with diverse species， novel structure and unique mechanism of action. However， the screening of myxobacteria has been hampered because of the difficult isolation and purification and time⁃consuming. The prey⁃induction isolation is the traditional method for myxobacteria screening， and Escherichia coli is frequently selected as the prey strain. To obtain new prey bacteria and increase the diversity of myxobacteria， this study constructed bacterial co⁃occurrence network based on 16S rRNA gene sequencing， and we found 27% links of myxobacteria⁃bacteria in subnetwork were with Actinobacteria. An actinobacterial strain Arthrobacter globiformis GDMCC 1.1730 was selected as prey to test the predatory abilities of different myxobacterial species. The results showed that all the selected myxobacterial strains were capable to prey upon this strain. Therefore， we used GDMCC 1.1730 as prey to isolate myxobacteria from soil samples， and baited 11 types of myxobacteria fruiting bodies with one specifically induced by GDMCC 1.1730 but not by E. coli. Based on soil bacterial co⁃occurrence network and the confirmation of predatory ability， this study reports a new Gram positive baiting strain for myxobacterial isolation， which provides new evidence for the effectiveness of using network⁃directed isolation to obtain uncultivated microbial resources.

Graphical abstract

关键词

细菌共现网络 / 捕食 / 辅助菌 / 粘细菌 / 子实体

Key words

bacterial co⁃occurrence network / predation / helper strain / myxobacterium / fruiting body

0 引 言

粘细菌是一类分布广泛的捕食性细菌，是土壤中丰度较高的类群之一，因其复杂的生活史和群体行为而被称为“高等细菌”^［1］。粘细菌通过产生抗菌物质、水解酶等多种策略杀死猎物细胞，并获取营养。粘细菌能够产生丰富多样、结构新颖、作用机制独特的天然活性物质。目前已经从粘细菌中发掘了200多种活性物质，它们能够抗肿瘤、抗病毒、抗真菌，具有抑菌活性，对发掘新药和改善人类健康具有重要意义^［2］。因此，粘细菌成为继放线菌之后的又一大类尚待开发的新型战略药源微生物资源。但是，粘细菌分离纯化困难且耗时，导致可培养资源匮乏，目前世界范围内能够纯培养的粘细菌仅有60多种^［3~5］。当前有限的粘细菌资源现状与其重要的应用价值不相匹配，亟需形成新思路以加速和扩大新资源的开发利用。

被捕食细菌能够为粘细菌提供营养、能量和生长因子等，显著促进粘细菌的生长和子实体的形成，有助于粘细菌的分离培养^［6］；这些促进粘细菌生长发育的被捕食细菌也称为辅助菌^［3~6］。近年来，基于粘细菌对细菌的捕食生态关系，采用辅助菌诱导子实体的形成进而进行粘细菌分离成为重要手段之一，即接种辅助菌诱导粘细菌从样品中“爬出”并形成子实体，再挑取子实体进行纯化。该方法促进了粘细菌资源的发掘和全球范围内粘细菌资源库的增加^［7，8］。但是研究人员在利用经典的辅助菌诱导法进行粘细菌分离时，选择的辅助菌往往是模式被捕食菌大肠杆菌（Escherichia coli），或者是根据经验在长期分离过程中发现的常见辅助菌菌种，这就导致分离到的粘细菌多为重复菌株，不易得到新资源。

微生物共现网络（microbial co⁃occurrence network）是研究生态系统中不同类群或个体相互作用关系、辨识生态系统内在和整体属性的一种有效的系统分析方法^［9］。基于随机矩阵理论表征生态系统中所有微生物物种间的关系，为理解复杂的微生物群落潜在的相互作用提供了一种全新的策略^［10~12］。将该方法与高通量测序技术或者基因芯片产生的数据结合起来构建微生物共现网络，为通过免培养技术全面认识微生物相互作用关系提供了解决途径。微生物捕食关系是一种重要的细菌互作关系。粘细菌是土壤中最主要的捕食类群，超过土壤总微生物捕食类群数量的60%，其捕食关系是微生物互作中的一个重要模块^［13］。微生物共现网络为全面认识粘细菌的捕食关系提供了基础解决方案，这对扩大粘细菌资源分离也具有重要意义，可以将通过共现网络预测潜在的被捕食菌作为辅助菌诱导粘细菌子实体的产生。本研究基于高通量测序数据构建的细菌共现网络全面认识粘细菌⁃细菌互作关系，获取潜在的辅助菌；通过共培养手段验证潜在辅助菌作为被捕食菌的可行性；再将获得的被捕食菌用于土壤粘细菌的诱导分离，进一步证实环境中的捕食过程。

1 材料与方法

1.1 土壤样品和菌株

本试验用土壤采自中国科学院鹤山丘陵综合开放试验站林地（112^o54′19″E， 22^o40′20″N），该地覆盖植被几乎全部是芒箕（Dicranopteris dichotoma），于2015年采集试验地0~20 cm土层土壤用于后续试验，土壤的处理和养分含量信息描述见相关研究方法^［14］。在温室中利用采集的土壤种植6种禾本科和豆科植物，包括禾本科植物百喜草（Paspalum natatum Flüggé）、高羊茅（Festuca arundinacea L.）、多年生黑麦草（Lolium perenne L.），豆科植物柱花草（Stylosanthes guianensias （Aubl.） Sw.）、三叶草（Trifolium pratense L.）、紫花苜蓿（Medicago sativa L.）；每种植物设置3个生物学重复，并于植物营养生长旺盛期收集植物根际土壤，新鲜土壤样品过2 mm筛，取约50 g土壤放置于-80 ℃，另取200 g土壤于阴凉处室温下风干备用。

粘细菌分离中的诱导菌球形节杆菌（Arthrobacter globiformis）GDMCC 1.1730和用于对照的大肠杆菌GDMCC 1.707T来自广东省微生物菌种保藏中心。粘细菌捕食球形节杆菌活性验证试验所用粘细菌菌株均来自广东省微生物菌种保藏中心。

1.2 土壤细菌共现网络的构建

基于土壤16S rRNA基因高通量测序数据进行土壤细菌共现网络分析。高通量测序试验和生物信息学分析见相关研究结果^［14］，测序数据已上传至NCBI SRA，登录号为SRX2589894 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/？term=SRX2589894）。土壤16S rRNA基因测序下机原始数据在QIIME2平台上进行生物信息学分析以获得OTU丰度表和物种注释信息^［15］，主要的生物信息学分析包括：根据标记条码（barcode）序列用“demutiple”命令拆分为不同样品的数据，用“cutadapt”命令截去标记条码序列和引物序列、“joining reads”命令将双端序列进行拼接，用“sequence quality control”命令初步质控过滤掉低质量序列；再用Deblur插件进行OTU聚类分析，序列经“dereplicate”、“remove artifacts sequences”、“multiple sequence alignment”、“deblurring”和“remove chimeras”命令生成代表性序列；再用“filter⁃features”命令过滤掉序列总条数小于10的OTU和那些仅出现在一个样品中的OTU；用经Deblur处理后得到的代表性序列构建系统发育树；代表性序列使用数据库Silva进行物种注释^［16］，用“metdata tabulate”命令获取代表性序列的注释结果，再用“taxa barplot”命令生成并输出各分类水平物种丰度表。

利用高通量测序数据生物信息学分析获得的OTU丰度表和物种注释信息，基于随机矩阵理论构建细菌共现网络。网络构建和网络拓扑结构参数获取均在molecular ecological network analysis pipeline （MENA） （http：//ieg4.rccc.ou.edu/mena/）网站上完成^［9~11］。网络构建主要包括数据处理、相似性矩阵构建和基于随机矩阵理论的邻接矩阵转换，主要步骤如下：①过滤掉仅出现在少于9个样品的OTU（9为样品总数目的一半），以及相对丰度小于0.01%的OTU，即选取出现在多数样品中的高丰度OTU用于网络分析；②计算任意两个OTU之间的Spearman相关性后构建相关性矩阵，再根据默认阈值将相关性矩阵转化为邻接矩阵（阈值选择如下：r为0.75，χ² 值为74.825，P值为0.094），计算节点之间的连接强度；③在不改变原有网络节点和连线数的前提下，利用Maslov⁃Sneppen方法重新连接原网络中不同位置的节点，构建100个随机网络，然后比较构建的共现网络和随机网络之间的差别；④将MENA输出的网络文件和节点数据文件作为输入数据，在软件Cytoscape对网络进行可视化处理。此外，我们从MENA平台输出并比较构建的共现网络和随机网络的拓扑结构参数^［17］（路径长度、聚集系数、模块性等），以评价构建网络的可靠性。

1.3 粘细菌对球形节杆菌的捕食潜力评价

通过对粘细菌⁃细菌共现子网络各节点OTUs的分析，发现多个粘细菌OTU与放线菌的OTU之间存在连线，但是这些与粘细菌有连线的节点均为未培养细菌。通过文献调查，发现研究学者通过同位素标记的方法证实，被标记的球形节杆菌DSM 2012属于放线菌门（Actinobacteria）放线菌纲（Actinobacteria）微球菌目（Micrococcales）微球菌科（Micrococcaceae）节杆菌属（Arthrobacter），该菌中的¹³C能够在多种粘细菌中检测到^［13］。因此，我们选择球形节杆菌作为诱导菌进行粘细菌的分离。然而，有研究结果显示，并不能排除粘细菌通过次生生长间接获得¹³C，粘细菌对球形节杆菌的实际捕食能力仍需验证^［13］。因此，我们选择了14株不同种的粘细菌，测试其对球形节杆菌的捕食情况。

用于捕食活性验证的粘细菌菌株包括原囊菌（Archangium gephyra）GDMCC 801141，孢囊杆菌（Cystobacter sp.）13、孢囊杆菌（Cystobacter violaceus）14、弱小珊瑚球菌（Corallococcus exiguus） GDMCC 801193、过渡原囊菌（Archangium disciforme） NL04M2、珊瑚球菌（Corallococcus sp.） M34、橙色粘球菌（Myxococcus fulvus） GDMCC 801131，大孢粘球菌（Myxococcus macrosporus） GDMCC 801140、匣状粘球菌（Pyxidicoccus fallax） GDMCC 80112、珊瑚球菌（Corallococcus carmarthensis）M7、叶柄粘球菌（Myxococcus stipitatus）M56、变绿粘球菌（Myxococcus virescens）M3、侵蚀侏囊菌（Nannocystis exedens）M113、黄色粘球菌（Myxococcus xanthus） M116⁃1。收集处于对数生长期的球形节杆菌GDMCC 1.1730菌体，用无菌水清洗3次后接种150 μL菌液于TPM琼脂平板（10 mmol/L pH 7.6 Tris，1 mmol/L pH 7.6 KH₂PO₄⁃K₂HPO₄缓冲液，8 mmol/L MgSO4），待菌斑吹干后，倒置200 μL移液吸头，用打孔法取长有粘细菌的琼脂块接种于球形节杆菌GDMCC 1.1730菌斑中央。将平板置于30 ℃环境中培养，每天观察粘细菌的捕食和生长情况，并在体式显微镜下拍照。

1.4 球形节杆菌作为诱导菌进行粘细菌的分离

收集处于对数生长期的球形节杆菌GDMCC 1.1730菌体，用无菌水清洗3次后接种200 μL菌液于WCX固体培养基（CaCl₂·2H₂O 0.1%，3⁃吗啉丙磺酸 2.093 g/L，琼脂 1.5%，pH 7.2），待菌斑吹干后用于粘细菌的分离。土壤样品加缓冲液和放线菌酮（100 μg/mL，抑制霉菌生长），充分混匀后静置过夜。离心弃上清，取约黄豆大小的土壤接种于WCX培养基的菌斑中央，置于30 ℃培养，并设置大肠杆菌作为辅助菌的传统方法作为对照。接种7 d后，在体式显微镜下观察子实体，并挑取子实体转接到VY/2培养基（酵母0.5%，CaCl₂·2H₂O 0.1%，琼脂1.5%，pH 7.2，灭菌后加入终浓度为50 μg/mL VB₁₂）进行纯化，之后反复转接子实体或菌膜进行纯化。挑取肉眼辨别已纯化的菌落转接到营养肉汤液体培养基（蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.2）培养过夜验纯。已纯化的粘细菌用细菌通用引物27F/1492R扩增16S rRNA基因进行鉴定，并在MEGA软件中利用本研究测定的16S rRNA基因和已知的孢囊杆菌亚目粘细菌16S rRNA基因分别用邻接法（neighbor⁃joining， NJ）、最大似然法（maximum likelihood， ML）和最小进化法（minimum evolution， ME）构建系统发育树，系统发育树构建均进行1 000次重复，并展示自展值大于70%的分支。系统发育树构建选择厌氧粘细菌（Anaeromyxobacter dehalogenans） 2CP⁃1T作为外围内群，其16S rRNA基因在NCBI中的登录号为CP001359。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌共现网络

通过构建土壤细菌共现网络分析细菌间的共发生关系，以及粘细菌⁃细菌子网络共现关系，以获得土壤中与粘细菌有显著相关关系的细菌，作为潜在的辅助菌。基于随机矩阵理论构建的土壤细菌共现网络可视化见图1，展示了不同细菌之间的共现关系，并在门水平上以不同颜色进行区分。网络图包含366个节点（OTU）和783条边（不同OTU之间的相互作用），其中包括11个注释为粘细菌目的节点。构建的共现网络的平均聚集系数（average clustering coefficient）、平均路径长度（average path distance）和模块性（modularity）均大于随机网络的拓扑结构参数，并且构建的网络符合幂律分布。这些参数说明构建的网络符合无标度（scale free）、小世界（small world）和模块化（modular）等网络特征（表1），表明构建的共现网络真实可靠，可用于随后粘细菌⁃细菌共发生关系的研究。

根据粘细菌⁃细菌共现网络，大部分粘细菌在网络图中属于外围节点，表现出与其他细菌较低的连通性，但是粘细菌节点OTU 96和OTU 400具有较高的连通度（图2）。在与粘细菌节点有连线的其他细菌节点中，大多数都是革兰氏阴性细菌，但是也有约27%的连接为革兰氏阳性菌（图2，表2）。由于传统的粘细菌分离方法中，大肠杆菌等革兰氏阴性菌作为诱导菌，但是分离出来的多为粘球菌属和珊瑚球菌属等常见种。因此，本研究利用网络分析中与粘细菌有较多联系的放线菌作为潜在的诱导菌进行后续粘细菌的分离。然而，共现网络中与粘细菌有联系的放线菌OTU均为未培养细菌类群。经过进一步的文献检索发现，有研究人员利用稳定性同位素标记技术，将¹³C标记的球形节杆菌接种于根际，最终在许多粘细菌中检测到¹³C，证实了该放线菌菌株可能被粘细菌捕食^［13］。多序列比对结果表明，球形节杆菌V4区序列与细菌⁃粘细菌共现网络的放线菌OTU测序序列相似度范围为78.3%~88.9%，具有一定的关联性。因此，我们选择球形节杆菌作为粘细菌的潜在诱导菌，将其用于后续粘细菌的分离。

2.2 可培养粘细菌对球形节杆菌的捕食活性

为了确保球形节杆菌作为辅助菌能够被粘细菌捕食利用，本研究选用菌株GDMCC 1.1730，验证已知粘细菌对该菌株的捕食情况。结果表明，测试的14株粘细菌均表现出对菌株球形节杆菌GDMCC 1.1730不同程度的捕食能力。变绿粘球菌XJ16、叶柄粘球菌M56、孢囊杆菌13、孢囊杆菌14、原囊菌GDMCC 801141和大孢粘球菌GDMCC 801140对球形节杆菌具有较强的捕食活性，可以观察到粘细菌菌落的生长和扩展，以及球形节杆菌菌体的消失和透明圈的出现（图3）。一些粘细菌甚至在捕食初期阶段（5 d以内）就有明显的子实体形成，例如，叶柄粘球菌M56和孢囊杆菌13。而橙色粘球菌H5M2、侵蚀侏囊菌M113和过渡原囊菌NL04M2对球形节杆菌的捕食较为缓慢，但是也可以观察到接种粘细菌周围由于球形节杆菌被裂解开始出现透明圈（图3），并在后续过程中观察到这些粘细菌对球形节杆菌裂解透明圈的扩大。球形节杆菌可以被多种粘细菌捕食，说明该菌株可以作为“食物”供给粘细菌生长和子实体形成过程中需要的各类营养物质，可以将其作为辅助诱导菌用于粘细菌的分离。

2.3 基于球形节杆菌的辅助菌诱导法进行粘细菌的分离

以球形节杆菌作为辅助菌能够诱导土壤样品中粘细菌子实体的形成。本研究用18份森林土壤的混合样品共诱导出11种形态不同的粘细菌子实体，包括4株成功纯化的粘细菌和7种未能成功纯化的子实体（图4）。4株成功纯化的粘细菌经16S rRNA基因序列鉴定为粘球菌属、珊瑚球菌属、匣状菌属和原囊菌属（图5）。粘球菌属子实体单生、具柄，呈球形或卵球形隆起，颜色为橙色、黄色、粉红色，菌落呈薄膜状扩展，有明显辐射状波纹（图4A）；珊瑚球菌属子实体形状不规则，形成嵴状突起，有珊瑚状分支，呈粉红色、浅黄色，菌落呈薄膜状扩展（图4B）；匣状菌属子实体形体不规则，呈团粒状或波浪状，表面光滑，颜色较浅，密集分布，菌落不规则扩展，边缘较薄（图4C）；原囊菌属子实体具柄，呈球形或团粒状，成簇聚集生长，颜色为黄色、橙红色、浅褐色，菌落呈薄膜状扩展，形成辐射线状（图4D）。此外，球形节杆菌还诱导出7种不同类型的子实体，但是由于杂菌污染未能成功纯化或者还在转接纯化中，这些子实体呈纯白色脑状或肠状、聚集生长（unknown 1，图4E），不规则形、黄绿色（unknown 2，图4F）、透明状白色（unknown 6，图4J）、橙色或浅褐色（unknown 7，图4K），波浪状的橙色或粉红色子实体（unknown 3，图4G），球形或卵球形、黄绿色、密集生长的子实体（unknown 4，图4H），球形或近球状不规则形褐色子实体、链状排列聚集（unknown 5，图4I）。

与传统的用大肠杆菌作为辅助菌方法相比，利用革兰氏阳性菌球形节杆菌作为辅助菌诱导出子实体unknown 3，表明这种子实体可能是由球形节杆菌特异性诱导产生的。由于该子实体和菌落生长呈粘细菌典型的扩展式滑动生长，菌落或者粘液易携带杂菌，所以纯化非常困难耗时。

我们发现平板捕食体系中粘细菌对球形节杆菌GDMCC 1.1730捕食过程中菌落的生长、扩展特征和子实体，与以球形节杆菌GDMCC 1.1730作为诱导菌进行粘细菌分离中粘细菌的生长和子实体形态相似，说明基于细菌共现网络和平板捕食验证实验可以获得新的辅助菌用于粘细菌的分离。获得子实体后的纯化过程仍需改良，以获得更多粘细菌新资源。

3 讨 论

环境中的绝大部分微生物目前未能实现实验室条件下的纯培养，实际环境中微生物之间复杂的相互作用关系未能在实验室条件下得到满足是其中的一个重要原因。前人研究报道了细菌之间的营养缺陷互补是塑造微生物群落的重要因子，也证实了微生物之间的互作关系对维持其正常生长繁殖的重要性^［18］。然而，微生物之间的相互作用关系在很长一段时间内并未受到微生物分离培养的重视，这是因为微生物之间的相互作用关系复杂多变，并且高度依赖于环境条件，目前仍然缺乏有效的方法表征这些相互作用关系，这也给利用微生物互作关系进行难培养微生物的分离工作带来了挑战。粘细菌是一类捕食性细菌，与环境中的其他细菌（被捕食菌）之间存在强烈互作关系；一方面，粘细菌能够捕食细菌；另一方面，一些被捕食细菌能够采取应激和防御措施应对粘细菌的捕食^［5］。同时，粘细菌也是一类难培养微生物，利用其对细菌的捕食关系进行分离是获取粘细菌资源的重要方法^［6，7］。本研究基于细菌共现网络，发现了放线菌与粘细菌之间密切的联系。大肠杆菌是目前常用的辅助菌，尚无研究报道利用革兰氏阳性菌或者放线菌作为辅助菌用于粘细菌的分离。因此，本研究基于共现网络中粘细菌⁃放线菌的密切联系，选择了一株易得的放线菌球形节杆菌GDMCC 1.1730作为辅助菌进行粘细菌的分离。

本研究基于细菌16S rRNA基因高通量测序数据构建根际土壤细菌共现网络，通过免培养的方法避免了纯培养方法对未培养微生物的遗漏，分析过程中对OTU丰度、出现频次和相关系数阈值的严格控制能够保证共现网络的真实性，为筛选与粘细菌有互作关系的OTU提供了良好的前提。在粘细菌⁃细菌互作子网络中，我们发现约27%的粘细菌OTU连接节点为放线菌，这些结果表明放线菌可能作为潜在的辅助菌。然而，这些OTU代表的潜在辅助菌全部为未培养类群。Zhang和Lueders^［13］通过同位素标记的方法证实，被标记的一株放线菌球形节杆菌DSM 2012中的¹³C能够在多种粘细菌的rRNA基因中被检测到，表明这些粘细菌在土壤中可能通过捕食利用了来自于球形节杆菌的碳源，表明该菌可能被粘细菌捕食，但该技术并不能排除次生生长的可能。然而，这些结果能够证实土壤环境中的可培养放线菌球形节杆菌与粘细菌的密切关系。该菌株与网络中与粘细菌有联系的OTU节点最高相似度为88.9%，考虑到可培养菌株可获取程度的难易，我们在本研究中选择该菌株作为一株潜在辅助菌。在未来的研究中，我们将尝试在相同的土壤样品中分离放线菌，尝试获得与共现网络中亲缘关系更近的菌株，并根据共现网络中的连线关系尝试“定向”获取某个粘细菌类群；例如，共现网络中Haliangiaceae与放线菌细菌，如土壤杆菌目（Solirubrobacterales）、酸微菌目（Acidimicrobiales）之间存在多条连线；而目前粘细菌Haliangiaceae仅有2个来自海洋环境的可培养类群，但是基于免培养方法证实该粘细菌类群在多种陆地环境中均具有较高的相对丰度；因此，在未来的工作中将研究利用共现网络中该类群与放线菌之间的关联，期望获得陆地环境中Haliangiaceae粘细菌的新类群。

基于微生物群落中各类群丰度建立的共现网络可以为群落水平的互作研究提供全面的认识^［9］。但是研究者很难将预测的互作关系与实际的生物学过程联系起来，也就是说，预测的网络关系还需要实际的验证才能指导基于微生物互作的研究。因此，本研究先验证了多种粘细菌对球形节杆菌的捕食活性，确定将其作为辅助菌进行粘细菌分离的可行性。平板捕食实验证实了粘细菌对球形节杆菌的捕食，并且能够在较短时间内诱导叶柄粘球菌和孢囊杆菌形成子实体，说明基于细菌共现网络和平板捕食验证实验可以获得新的辅助菌用于粘细菌的分离。近年来，基于培养组学的多种策略被用于未/难培养细菌的分离，例如，Xian等^［19］将共现网络应用于绿弯菌的分离，获得了36个潜在的绿弯菌门新物种。

粘细菌中的溶细菌类群能捕食革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌^［5］。基于细菌共现网络和平板捕食验证实验，本研究以革兰氏阳性菌球形节杆菌作为诱导菌分离粘细菌，与传统的辅助菌大肠杆菌相比，二者均能诱导出包括原囊菌属、珊瑚球菌属、粘球菌属和匣状菌属在内的多种子实体，这一结果与李百元等^［6］的研究结果相似。本研究还发现了仅由球形节杆菌诱导的子实体。革兰氏阴性细菌和阳性细菌细胞壁结构的差异，以及不同被捕食菌应激和防御响应的差异、胞外黏蛋白的分泌和胁迫耐受性结构的形成等细菌特性上的差异，可能是不同类型辅助菌诱导的粘细菌子实体有差异的原因^［5］。这些结果表明，增加高效辅助菌的种类有助于获取粘细菌新资源。本研究提供的一株革兰氏阳性菌球形节杆菌细胞壁成分不同于E. coli，支链氨基酸合成缺陷是许多捕食性细菌的普遍特征^［20］，丰富的肽聚糖为粘细菌生长提供了良好的营养，这可能是其诱导出多种粘细菌子实体的原因。此外，被捕食菌可能也提供了一些微量成分供特殊类群的粘细菌生长，这一点还有待深入研究。

此外，由于粘细菌子实体在纯化培养基上萌发后表现出典型的S运动（social motility）特性，即细胞的群体滑动运动形成扩展的菌落，这极易引起杂菌的共同生长，因而给纯化工作带来困难。因此，未来的研究还应关注改良粘细菌纯化方法以获得粘细菌新资源，例如，在纯化培养基中增加放线菌或者其他辅助菌细胞裂解液为特定粘细菌类群的生长提供微量营养。总之，本研究基于细菌共现网络和平板捕食验证实验，获得了一株新的粘细菌辅助菌，该辅助菌能够诱导出土壤中的多种粘细菌子实体，为根据微生物共现网络获取未/难培养微生物资源提供了新证据。

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基金资助

国家自然科学基金(31900084)

广东省科技计划项目(2019B030316010)