规模化养殖条件下生猪肠道微生物资源分离和鉴定

Isolation and identification of intestinal microbial resources of pig in large⁃scale breeding

摘要

肠道微生物作为机体的重要组成部分，与生猪健康密切相关。为了获取生猪肠道微生物资源，本研究同时采用有氧分离和厌氧分离技术，从12份新鲜猪粪便中分离获得174株细菌。通过16S rRNA基因比对分析对菌株进行初步鉴定后发现，有氧分离条件下获取的105株细菌隶属于8个科、13个属和19个种，其中以弗格森埃希氏杆菌（Escherichia fergusonii）居多；厌氧条件下获取的69株细菌隶属于7个科，13个属，20个种，大部分是福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）和弗格森埃希氏杆菌（Escherichia fergusonii）；其中，潜在益生菌株28株，包括粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、河流漫游球菌（Vagococcus fluvialis）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。本研究有助于加深对生猪肠道可培养微生物资源和微生物生态的认识，为肠道微生态和动物益生菌的进一步研究和应用提供优良菌种资源。

Abstract

As an important composition of the animal organisms， intestinal microbes are closely related to pig health. Consequently， in order to explore microbial resources in pig intestines， we isolated 174 bacterial strains from 12 samples of pig feces under aerobic and anaerobic conditions， respectively. The strains were purified and preliminarily identified based on 16S rRNA gene sequence analysis. The 105 strains isolated under aerobic conditions belonged to 8 families， 13 genera and 19 species； and most of them were Escherichia fergusonii. The 69 strains isolated under anaerobic conditions belonged to 7 families， 13 genera and 20 species； and most of them were Shigella flexneri and Escherichia fergusonii. Moreover， 28 potential probiotic strains were obtained， including Enterococcus faecalis， Vagococcus fluvialis and Lactococcus lactis. Our study provides insight into culturable microbes and microbial ecology in pig intestines， and offers bacterial resources for further research and application in the intestinal microecology and animal probiotics.

Graphical abstract

关键词

猪 / 肠道微生物区系 / 益生菌 / 厌氧微生物 / 分离鉴定

Key words

pig / intestinal microbiota / probiotic / anaerobe / isolation and identification

0 引 言

目前，肠道微生物被视为生命机体的重要组成部分，又被认为是“第二基因组”，通过与环境的相互作用和不同的方式影响宿主的健康^［1］。肠道微生物不仅对宿主营养物质的消化吸收有重要影响，同时也在预防病原体定殖、维持和调节宿主肠道正常粘膜免疫及代谢健康等方面起重要作用^［2~4］。因此，动物肠道微生物的研究与应用已成为当今热门研究领域之一。

近年来，随着多组学技术体系的发展，学术界对动物肠道微生物组的认识愈加深入^［5~7］。然而，随着组学数据的指数性增加，以及微生物组学研究从描述性分析转向机制性和应用性研究，研究者们越重视动物肠道微生物菌株分离、鉴定、评价及其基因型、表型与功能研究^{［5，8，9］}。动物肠道微生物资源发掘可为微生物组学研究提供纯培养微生物物质基础和基于试验验证的数据库参考集^{［10，11］}，补充和完善微生物组学技术体系和研究结论，丰富人们对动物肠道微生物群落功能的认识。

目前动物肠道微生物资源发掘工作严重不足，已成为限制组学数据分析和动物肠道微生物组研究的瓶颈之一。因此，本研究采集规模化养殖生猪的新鲜粪便，从中分离、纯化和鉴定生猪肠道微生物菌株，进一步充实动物肠道微生物资源，为动物肠道益生菌与动物健康研究提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源

60日龄长白猪的新鲜粪便12份，采集自江西省上饶市某规模化养殖场。

1.1.2 培养基

① 改良XLD⁃BHI培养基：木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）培养基44.2 g、脑心浸出液（BHI）培养基27.0 g、硫乙醇酸钠0.5 g、L⁃半胱氨酸0.5 g、双蒸水1 L，pH 7.4，1×10⁵ Pa高压湿热灭菌15 min。

② 改良TSN培养基：胰蛋白胨亚硫酸盐新霉素（TSN）培养基40.0 g、硫乙醇酸钠 0.5 g、L⁃半胱氨酸 0.5 g、乳糖10.0 g、中性红 75.0 mg、、双蒸水1 L，pH 7.1，1×10⁵ Pa高压湿热灭菌10 min。

③ 麦康凯琼脂培养基：胰酶解明胶17.0 g、蛋白胨3.0 g、乳糖10.0 g、氯化钠5.0 g、混合胆盐1.5 g、中性红30.0 mg、结晶紫1.0 mg、琼脂15.0 g、双蒸水1 L，pH 7.1，1×10⁵ Pa高压湿热灭菌15 min。

1.2 仪器与试剂

仪器设备：高压蒸汽灭菌器HVE⁃50（Hirayama，日本）；洁净工作台SW⁃CJ⁃2FD（苏州安泰空气技术有限公司，苏州）；PHS⁃3C型pH计（上海雷磁仪器厂，上海）；梯度PCR仪GSX1、离心机5424（Eppendorf，德国）；超纯水机（湖州先河仪器仪表有限公司，湖州）；电泳仪（北京六一生物科技有限公司六一，北京）；超低温保存箱MDF⁃682（Panasonic，日本）；生化培养箱LRH⁃250（上海浦东荣丰科学仪器有限公司，上海）；紫外可见分光光度计Ultrospec 6300 Pro（GE Healthcare，英国）；凝胶成像系统（BIO⁃RAD，美国）；显微镜DM6（Leica，德国）；厌氧产气袋C⁃1、厌氧培养袋C⁃43（三菱瓦斯化学株式会社，日本）；厌氧工作箱AEP（Electrotek，英国）。

主要试剂：2×Taq Master Mix即用型PCR预混液（Microanalysis，美国）；细菌16S rRNA基因通用引物（上游引物27F：5'⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3'，下游引物1492R：5'⁃TACGGCTACCTTGTTACGACTT⁃3'）。引物由上海美吉生物医药科技有限公司合成；乳糖、石蜡等购自广东广试试剂科技有限公司；XLD培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，BHI培养基购自青岛海博生物技术有限公司；其他常规试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株分离

在猪场采集新鲜猪粪便。在现场，使用灭菌竹签拨开粪便，使其内部暴露，立即使用无菌接种环蘸取粪便中心部位样品，采用四区划线法分别接种于TSN培养基和XLD培养基平板上；每份样品在每种培养基平板上重复接种2次（各2块平板）。立即将其中1组接种平板放入装有厌氧产气包的厌氧培养罐中密封，并尽快带回实验室；后续厌氧菌株分离、纯化和鉴定等操作在实验室厌氧工作站中进行。另1组平行的接种平板在有氧条件下培养，以分离纯化好氧微生物。待平板上长出不同形态的菌落后，根据菌落形态、颜色及大小，挑取不同类型单菌落，并转接到新的平板上进行纯化。对于在平板上出现扩张生长现象的菌落，划线转接于麦康凯平板上进行分离纯化。

1.3.2 菌株初步鉴定

采用Chelex⁃100快速提取待鉴定菌株的基因组DNA。采用16S rRNA基因通用引物27F和1492R进行PCR扩增。扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司测序。将测序结果提交EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）进行同源序列比对分析。将与模式菌16S rRNA基因同源性低于98.65%的菌株定义为疑似新种^［12］。利用Probio（http：//bidd2.nus.edu.sg/probio/homepage.htm）数据库初步鉴定益生菌。

1.3.3 菌株保存

挑取有氧条件下分离纯化得到的菌株接种于BHI液体培养基中进行扩增培养；至OD_600nm达0.8左右时，取600 μL菌液转移到装有等体积60%甘油的冻存管中；混匀后保存于-80 ℃超低温冰箱。对于厌氧条件下分离纯化获得的菌株，接种到含BHI液体培养基的厌氧培养试管中（试管和培养基提前24 h放于厌氧工作站中脱氧处理）；试管内BHI培养基液面高度为5~7 cm，上覆无菌石蜡油；厌氧菌株培养至OD_600nm达0.8左右时，同样转移600 μL菌液至装有600 μL 60%甘油的2 mL冻存管中；混匀后在冻存管内液面上方加入300 μL无菌石蜡油（用以隔绝空气）后保存于-80 ℃超低温冰箱。此外，收集扩增培养的菌体（包括有氧和厌氧条件下分离纯化的菌株），制作冻干安瓿管。最后，分别采取-80 ℃条件下甘油管保藏和4 ℃条件下冻干管（10%牛奶作为保护剂）保藏两种方式，将分离获得的菌株保存于广东省微生物菌种保藏中心（Guangdong microbial culture collection center，GDMCC）。

1.3.4 alpha多样性分析

通过alpha多样性指数的6个指标（ACE指数，Chao1指数，Shannon均匀度，Gini⁃Simpson均匀度，Shannon指数和Ginin⁃Simpson指数）评估生猪肠道可培养细菌群落的丰富度和多样性。

测序获取的有效序列按分离条件分为厌氧和有氧两组，利用在线分析平台（http：//mem.rcees.ac.cn：8080/）对有效序列以100%的相似性聚类成操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs），以65为抽样参数（低于厌氧条件获得菌株数）进行重新取样（http：//mem.rcees.ac.cn：8080/）。同时通过t检验分析2组数据之间的显著性。Alaph多样性指数、箱式图及t检验使用R软件（3.5.3版本）进行分析。

2 结果与分析

2.1 生猪肠道细菌分离与纯化

直接蘸取新鲜猪粪便中间部位样品，采用四区划线法接种于TSN和XLD平板上，分别在有氧条件和厌氧条件下进行培养。挑选不同形态的单菌落转接纯化后，共获得细菌174株，其中有氧条件获得105株，厌氧条件获得69株。

2.2 生猪肠道可培养细菌物种组成

采用16S rRNA基因扩增测序法对上述174株细菌进行初步鉴定。结果表明，有氧条件获得的105株细菌，隶属于3个门，9个科，13个属，19个种。其中肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌居多，共81株；肠球菌科（Enterococcaceae）细菌次之，共13株（表1）。在属水平上，埃希氏菌属（Escherichia）居多，占比达31%；其次为变形菌属（Proteus）26%，志贺氏菌属（Shigella）14%，肠球菌属（Enterococcus）8%。除此之外，还发现了少量属于类香味菌属（Myroides）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、摩根菌属（Morganella）等类群的菌株（图1）。

厌氧条件下分离获得的69株细菌，隶属于2个门，7个科，13个属，20个种；其中同样以肠杆菌科细菌居多，共40株；肠球菌科细菌其次，共18株（表2）。在属水平上，埃希氏菌属居多，占比达29%；其次为志贺氏菌属14%，肠球菌属20%。除此之外，还发现了少量菌株分别属于梭菌属（Clostridium）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、摩根菌属等（图2）。其中，隶属于梭菌属、丁酸弧菌属、Faecalicatena及消化链球菌属的8株细菌，均为严格厌氧菌。此外，本研究还获得了2株疑似新种，场球菌（Enterococcus sp.）BLTAN11⁃2，与模式菌蒂莫内肠球菌（Enterococcus timonensis Marseille）P2817的16S rRNA基因序列相似性为97.39%；链状粪杆菌（Faecalicatena sp.）BLTAN31⁃1，与模式菌乳清酸链状粪杆菌（Faecalicatena orotica）DSM 1287的16S rRNA基因序列相似性为97.43%。

2.3 生猪肠道可培养细菌群落alpha多样性分析

基于ACE指数和Chao1指数评估生猪肠道可培养细菌群落的丰富度。厌氧条件下和有氧条件下细菌群落的ACE指数分别为46.62和18.73；Chao1指数分别为30.53和15.42；厌氧条件下细菌群落ACE指数和Chao1指数明显高于有氧条件下分离得到的细菌群落（图3）。厌氧条件下生猪肠道可培养细菌群落的Shannon均匀度（0.66）和Gini⁃Simpson均匀度（0.19）低于有氧条件下分离得到的可培养细菌群落（Shannon均匀度和Gini⁃Simpson均匀度分别为0.69和0.29）。厌氧条件下和有氧条件下生猪肠道可培养细菌群落的Shannon指数分别为1.88和1.75，可见厌氧条件下分离得到的可培养群落的Shannon多样性更高。然而，由于Gini⁃Simpson多样性指数受均匀度影响更大，所以厌氧条件下生猪肠道可培养细菌群落的Gini⁃Simpson多样性指数（0.70）显著低于有氧条件下可培养细菌群落（Gini⁃Simpson多样性指数为0.73）。

2.4 生猪肠道益生菌菌株

通过Probio（http：//bidd2.nus.edu.sg/probio/homepage.htm）数据库分析，174株细菌中有28株为益生菌，隶属于2个科3个属3个种，分别为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）（占比68%）、河流漫游球菌（Vagococcusfluvialis）（占比29%）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）（占比3%）（图4）。

3 讨论与结论

生猪不仅是畜禽养殖行业的主要品种，同时也是研究动物生理功能和疾病的重要模式物种^{［13， 14］}。近年来，随着高通量测序技术的发展，研究者们对生猪肠道菌群的物种组成、多样性与功能基因进行了大量研究^［14~18］，发现肠道微生物菌群与生猪的健康、免疫力和生长性能等息息相关^［19~21］。因此，生猪肠道微生物研究日益引起关注^{［22，23］}。然而，高通量测序技术研究微生物菌群也有一定的局限性，包括只能识别已知的微生物种类、无法获得纯培养的微生物资源、难以对菌群或纯菌的功能和作用机制进行深入研究等^{［24，25］}。因此，近来肠道微生物的分离培养日益受到重视^{［26，27］}。本研究从生猪粪便样品中分离纯化获得174株纯菌菌株，隶属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，以肠杆菌科和肠球菌科居多，其中包括2株疑似新种、8株严格厌氧菌和28株动物益生菌。在门的水平上，本研究在有氧条件下主要获得了变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门的菌株，其中变形菌门和后壁菌门分别占到了82%和15%，总占比达到了97%；厌氧条件下获得了变形菌门和拟杆菌门的菌株，其中变形菌门和后壁菌门分别占到了61%和39%。研究表明，生猪不同生长阶段肠道微生物组成有明显差别，总体而言变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门较多^［28］，在成年猪肠道微生物中变形菌门和厚壁菌门占比可达90%以上^{［29，30］}。在科水平上，以肠杆菌科和肠球菌科居多，有氧条件下肠杆菌科和肠球菌科分别占到了77%和12%；厌氧条件下肠杆菌科和肠球菌科分别占比58%和26%。黄锦卿等^［31］调查研究发现商品生猪粪便中含有较多的链球菌科和乳酸菌科，本研究获得的分离菌株含有较多的肠杆菌科和肠球菌科。基于门和科的水平，本研究生猪肠道微生物组成与之前的研究一致。基于属水平，本研究埃希氏菌属居多，与之前的研究生猪肠道微生物大肠杆菌属和普雷沃菌属（Prevotella）存在不同，可能与研究手段有直接关系^［30］。通过进一步研究，这些菌株资源可以为细菌分类学提供新的分类单元，为菌株表型和功能研究提供材料，为微生物组学数据分析提供参比信息，为功能菌剂的开发和利用提供物质基础^{［10，26］}。

严格厌氧菌对氧气非常敏感，在样品采集和菌株分离纯化过程中必须严格控制氧气的影响^［32］。本研究使用接种环蘸取新鲜猪粪中间部分的样品，直接划线接种于固体培养基上。这种现场接种的方式减少了样品采集、运输和稀释涂布等多个操作步骤，减少了厌氧菌与空气的接触时间，可能有利于获得严格厌氧菌。

本研究分离获得8株益生菌，分别为粪肠球菌、河流漫游球菌和乳酸乳球菌。粪肠球菌是农业部批准的用于饲料添加剂的益生菌，目前主要用于动物养殖中。研究发现粪肠球菌用于断奶仔猪养殖可提高仔猪的采食量、平均日增重，降低仔猪腹泻率^［33~35］，减少仔猪粪便中有害菌的数量^［36］，提高免疫力，降低死亡率^［37］；蛋鸡日料中添加粪肠球菌可提高产蛋量^{［38，39］}。河流漫游球菌属于革兰氏阳性菌，通过欧洲鲈鱼体内体外实验证明河流漫游球菌对鱼类具有益生作用^{［40，41］}。乳酸菌能调节肠道微环境，预防肠胃疾病，在食品工业中应用广泛。例如，乳酸乳球菌长期应用于食品发酵和奶制品制备中^［42］。同时，作为一种安全的基因工程菌，乳酸乳球菌还能用于生产疫苗^［43］。研究发现，益生菌作为饲料添加剂，可以抑制动物肠道病原菌，调节动物肠道菌群动态平衡。自2020年7月1日起，畜禽饲料“禁抗令”将全面施行。因此，动物益生菌成为养殖业“替抗”产品研发领域的热点。本研究获得的8株益生菌在养殖业和饲料产业中的作用机制和应用潜力值得后续深入研究。

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基金资助

广东省科学院研究所绩效考核引导专项(2020GDASYL-20200302002)

广东省科技计划项目(2019B030316009)

广州市科技计划项目珠江科技新星项目(201806010065)