广东从化温泉水体原核微生物多样性及其酶活筛选

Biodiversity and enzyme activity screening of aquatic prokaryotes from hot springs of Conghua in Guangdong Province

摘要

为了解广东从化温泉的原核微生物多样性及其产纤维素酶、淀粉酶的能力，选取从化3个地热区的7个温泉样点，现场测量各采样点的水体理化参数，并采集温泉水样品。利用免培养技术对从化温泉环境样品基因组的16S rRNA基因进行扩增，利用高通量测序技术，分析从化温泉环境原核微生物群落结构及多样性。同时，借助纯培养技术，对7个样点的微生物进行分离纯化，并将菌株接种于以微晶纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基中，检测其纤维素酶、淀粉酶活性。免培养结果显示，广东从化温泉环境原核微生物群落以细菌为主，群落结构与总碳含量相关性最大。通过选择性分离培养，共获得71株细菌，分属于17个不同的属，其中有9株属于潜在新分类单元，其中67.61%有纤维素酶活性，18.31%有淀粉酶活性。广东从化温泉中存在丰富多样的原核微生物类群，且蕴藏大量具有产生纤维素酶、淀粉酶活性的菌株，极具进一步发掘和研究的价值。

Abstract

In order to study the biodiversity and enzymes of prokaryotes from hot springs of Conghua District in Guangdong Province， total seven hot spring water samples were collected from three geothermal areas in Conghua District. The physicochemical parameters of water samples were measured in the field or laboratory. The high throughput sequencing technology was used to analyze the prokaryotic community structure and diversity of hot spring water. Bacterial strains were further isolated and cultivated from the seven hot springs. All the isolated strains were further screened for their cellulase and amylase activities. Results from culture⁃independent method showed that the majority of the prokaryotic microbes in these hot springs were bacteria， and the correlation was the largest between community structure and total carbon content. Through the comparative analysis based on 16S rRNA gene sequence similarities， a total of 71 bacterial strains were obtained. These strains were distributed in 17 different genera， of which 9 were potential novel taxa. Among these isolates， some strains had cellulase or amylase activity. The results indicated the prokaryotic communities are quite diverse in the hot springs of Conghua District， and there are a large number of strains with cellulase and amylase activities， which would be useful for further exploration and research.

Graphical abstract

关键词

从化热泉 / 多样性 / 淀粉酶 / 纤维素酶

Key words

hot spring of Conghua / biodiversity / amylase / cellulase

0 引 言

根据环境中微生物最适生长温度的不同可以将其分为：嗜冷微生物（最适温度<20 ℃）、嗜温微生物（最适温度为25~40 ℃）、嗜热微生物（最适温度为40~60 ℃）、极端嗜热微生物（最适温度为60~85 ℃）和超嗜热微生物（最适温度>85 ℃）^［1］。嗜热微生物（thermophiles）是一类古老的生命形式，在生命系统发育进化树上位于根部的位置，广泛存在于高温陆地温泉生态系统和海底热液口附近，微生物在这些环境里可以获得赖以生存的能量（如三价铁、氢气和硫化物等）。地球上存在着多种自然和人工的高温环境，孕育着丰富多样的嗜热微生物。陆地温泉作为自然界中一种独特的生态系统，与地球早期的环境比较接近，是研究生命起源和进化的模式生境，已成为国内外研究的热点之一^［2，3］；目前发现的高温微生物类群主要为细菌和古菌，近年来随着组学技术的不断发展，越来越多的古菌和病毒类群在温泉环境中得以发现，高通量测序分析显示在温泉中也存在着极其丰富、多样的真菌类群^［4］。纤维素是木质纤维素生物质中含量最丰富、最均匀也最难以降解的多糖。将木质纤维素生物质水解成可发酵糖，进而实现高效生产生物乙醇，缓解全球能源危机，是目前正待克服的难题^［5］。研究表明，高温环境迫使热泉生境微生物进化出特殊的生理机制和独特的基因，使其成为各种高温酶、代谢产物，以及新酶、新代谢物的潜在来源，具有重要的科学价值和应用前景^［6，7］。由于上述高温热泉生境来源的酶类具有耐高温等性能，而高温酶具有热稳定性高、反应效率高等优点，因此从热泉生境中分离、收集嗜热原核微生物资源，获得新颖丰富的代谢物，具有巨大的应用潜力，对产耐热纤维素酶的高温菌的发现及深入研究具有一定的工业应用前景。

按温泉分布特点及其地质背景，可将我国地热资源划分为5个最主要的区带：藏南—川西—滇西水热活动密集带、台湾水热活动密集带、东南沿海水热活动密集带、胶辽水热活动密集带和汾渭盆地系边缘水热活动密集带^［8］。广东从化温泉位于东南沿海水热活动密集带，是中国近代最负盛名的疗养胜地之一。本研究首次采用免培养技术手段、微生物纯培养方法以及酶学活性检测法对从化温泉原核微生物展开研究，旨在了解广东从化地区温泉中微生物的多样性及这些微生物产生纤维素酶、淀粉酶的能力，为促进对广东从化温泉微生物多样性的研究奠定一定的基础，同时为开发具有应用潜力的温泉微生物资源提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 样品的采集及地化参数测定

以流溪河温泉总部经济区（GWH）（23.69°N 113.70°E）、广东省干部疗养院（LYY）（23.65°N 113.65°E）、广东温泉宾馆（WQBG）（23.65°N 113.65°E）的7个温泉样点（表1）为研究对象进行样品采集。将样点GWH1、GWH2、GWH3、GWH4、LYY1、LYY2和WQBG1的30 L温泉水样进行过滤，收集微生物于滤膜（0.2 μm， gamma⁃Irradiated， Pall Gelman， America）上采集后放于50 mL无菌离心管中。所有样品分成两份，一份放置于干冰暂时存放，实验室-80℃中保存用于DNA的提取，另一份带回实验室4 ℃存放用于微生物的分离。现场测定样点的温度，pH，同时取适量样品带回实验室，用TOC⁃V总有机碳分析仪（TOC⁃V， SHIMADZU）测定各样点的总有机碳（TOC）、总碳（TC）及无机碳（IC）的含量；用Smartchem200全自动间断化学分析仪测定总氮（TN）、氨氮（NH₄⁺）、磷（P）、硝态氮（NO₃^-）及亚硝态氮（NO₂^-）的含量，每个样品测定3次取平均值。

1.2 DNA提取及扩增子测序

将带有微生物的滤膜剪碎，采用FastDNA® SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals）土壤DNA提取试剂盒提取温泉微生物总DNA，提取完成后，进行电泳检测，根据条带的有无及亮度判断所提DNA的质量，质量合格的进行下一步实验，不合格的重新提取。以20~30 ng DNA为模板，采用针对16S rRNA基因的通用引物扩增V4区（515FB： 5'⁃GTGYCAGCCGCGCTAA⁃3'， 806RB： 5'⁃GGACTACNVGGGTWTCTAAT⁃3'）。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，24循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物送金唯智公司测序，使用QIIME2软件^［9］，对获得的高质量序列，按97%的序列相似度进行归并和OTU （operational taxonomic units， OTU）划分，得到每个OTU对应的物种分类信息；根据OTU划分和分类地位鉴定结果，使用QIIME2软件分析每个样本在各分类水平的群落组成；借助R语言计算香农（Shannon）指数、辛普森（Simpson）指数、Pielou指数、ACE指数等四种α多样性指数、群落β多样性及文库覆盖率（coverage）。同时，根据理化数据，分析环境因子对从化温泉原核微生物群落结构的影响。

1.3 菌株的分离、纯化与保藏

1.3.1 样品的处理和分离

将带有温泉微生物的0.2 μm滤膜剪碎并放入250 mL三角瓶中，加入灭过菌的无菌水20 mL和玻璃珠数粒，将其放入摇床，37 ℃，200 r/min振荡混匀1 h。将混匀处理过的混合液采用梯度稀释法将之稀释到10^-3，各取100 μL的10^-2和10^-3悬浮液涂布于3种分离培养基平板上。根据温泉样点的温度，将涂布好的分离平板在45 ℃和55 ℃下进行倒置培养。

所采用的3种分离培养基成分如下：

R2A （ g/L ）：酵母提取物 0.5 g，蛋白胨 0.5 g，酸水解酪蛋白 0.5 g，葡萄糖 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，丙酮酸钠 0.3 g，K₂HPO₄ 0.3 g，MgSO₄·H₂O 0.05 g，琼脂 11 g。

4号：酵母提取物 0.25 g，蛋白胨 0.25 g，胰蛋白胨 0.25 g，酸水解酪蛋白 0.5 g，丙酮酸钠 0.6 g，蔗糖 0.5 g，醋酸钾 0.6 g，硫代硫酸钠 4 g，琼脂 15 g。

T5：葡萄糖 1 g，藕粉 1 g，酵母提取物 2 g，胰蛋白胨 0.5 g，碳酸钙 0.25 g，微量元素 1 ml/L，琼脂 15 g。

1.3.2 菌株的纯化和保藏

分离平板培养4 d后，挑出分离平板上长出的单菌落，去除肉眼明显可见的重复，将之在4号培养基平板上进行纯化，根据分离培养的温度的不同，将平板分别置于45 ℃、55 ℃恒温培养箱中倒置培养，重复上述操作，直至得到较纯的菌株。将纯化好的菌株进一步扩大培养，用于菌体保藏和测序。本研究采用低温冷冻保藏法，将纯化好的新鲜菌体收集于灭过菌的20% （m/V）甘油中，-80 ℃长期保藏。

1.4 菌株基因组DNA的提取

采用Chelex法^［10］对上述分离到的菌株进行基因组DNA的提取。取少量菌体于PCR管中，加入50 μL 10%Chelex⁃100（pH 8.0）溶液，混匀；99 ℃变性25 min，使基因组释放到溶液中；12 000 r/min低温离心10 min，取上清液作为PCR反应的模板。

1.5 菌株的分子生物学鉴定

选用细菌通用引物PA/PB（PA：5'⁃CAGAG⁃TTTGATCCTGGCT⁃3'； PB：5'⁃AGGAGGTGATCCAGCCGCA⁃3'）对上述纯菌的16S rRNA基因进行扩增。引物由上海生工生物公司合成，扩增所用体系为Genstar公司生产，PCR仪为Bio⁃Rad公司生产。PCR扩增产物电泳后，用凝胶成像仪（GEL Logic200）检测电泳结果。选择条带清晰且片段大小符合（约1 500 bp）的样本送金唯智测序。将测序返回的16S rRNA基因序列，利用EzBioCloud （http：//eztaxon⁃e.ezbiocloud.net/） 网站进行相似性比对分析^［11］，初步确定所分离菌株的分类地位。

1.6 酶活筛选

选取菌株的最适生长培养基，去掉培养基中的碳源，分别添加1%微晶纤维素和淀粉于上述培养基中，配制成相应的酶学活性筛选培养基。挑取生长良好的菌株菌体点接于上述筛选培养基中，每株菌做两个重复，在最适温度下进行培养。菌株生长2 d后，在添加了微晶纤维素的平板上加入0.1%（m/V）的刚果红溶液进行染色。1 h后，倒掉平板上多余的刚果红溶液，向平板中加入1 mol/L的NaCl溶液进行反复浸泡洗脱，直到洗脱液不再呈红色为止。对平板进行观察，若菌株周围呈现出透明圈，则表明该菌株能利用微晶纤维素，具有相关的活性，从而筛选出目标菌株。淀粉酶用碘液染色法，经碘液染色后出现透明圈则为淀粉酶阳性，否则为阴性^［10］。

2 结果与分析

2.1 广东从化温泉理化参数

广东从化温泉7个样点的理化参数如表1。样点的pH值介于6.5和7.5之间，为中性温泉；温度介于33~58 ℃之间，相对于滇藏温泉，从化温泉的水温普遍偏低；样点LYY1的总有机碳浓度最高，GWH1的总有机碳浓度最低；7个样点中总碳的浓度和无机碳的浓度大致相近；GWH4的总氮浓度最低；WQBG1未检测到NH₄⁺，GWH2和GWH4未检测到P，LYY2未检测到NO₂^-。

2.2 广东从化温泉原核微生物多样性分析

2.2.1 高通量测序结果

去除不合格序列后，7个温泉样品中共获得有效序列180 530条（表2）。其中从GWH1、GWH2、GWH3、GWH4、WQBG1、LYY1及LYY2中分别获得21 849、45 146、19 314、22 837、18 388、35 717及17 252条有效序列，基于97%相似度其OTUs数量分别为167、267、166、156、143、244和249，样点的原始序列已上传至NCBI数据库，序列号分别为SRR12125261、SRR12125260、SRR12125259、SRR12150684、SRR12150685、SRR12150687、SRR12150686。

2.2.2 从化温泉原核微生物群落α多样性

本次研究中，香农指数和辛普森指数均显示样点GWH2的微生物多样性最高，LYY1的其次，7个样点中，样点WQBG1的物种多样性最低。ACE指数反映样点内物种的丰富度，用来估计物种OTU数目，值越大时，其对应样点的物种越丰富，分析显示，GWH2样点的物种最丰富，LYY1的其次，WQBG1的物种丰富度最小。Coverage是指文库的覆盖率，其数值越高，则样品中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低，7个样品的覆盖率值均大于99%，说明样本中的序列基本完全被测出，测序结果一定程度上反映了样本中微生物的真实情况。

2.2.3 从化温泉原核微生物群落β多样性

对三个温泉细菌群落在OTU水平上进行基于Bray⁃Curtis距离算法的主坐标分析（图1），结果表明：细菌群落距离均较远，且完全分开，群落差异显著。LYY的两个样点和GWH的两个样点（GWH2、GWH3）分别聚集在一起，而其他三个样品的聚类关系不明显，说明地理限制不是影响微生物群落的主要因素。

2.2.4 从化温泉原核微生物群落结构分析

利用Greengenes13⁃8分类器对OTU分别进行门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）及属（Genus）水平上的物种分类注释。从门水平进行分析，从化7个温泉中共检测到40多个门类（图2），其中3个为古菌门。细菌主要包括变形菌门（Proteobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、绿菌门（Chlorobi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和绿弯菌门（Chloroflexi），其所占比例分别为43.1%、8.48%、5.46%、4.71%、4.57%和4.06%。3个古菌门分别为5.01%的广古菌门（Euryarchaeota）、2.44%的泉古菌门（Crenarchaeota）及少量的微古菌门（Parvarchaeota）。7个样点中，变形菌门的微生物都为优势类群，其次是硝化螺旋菌门。同时，未知的细菌门类在7个样点中所占比例较高，为8.25%。GWH1的优势菌属为假单胞菌属、神奇甲基菌（Candidatus methylomirabilis）；GWH2的优势菌属为不动细菌属（Acinetobacter）、假单胞菌属、甲基球菌属（Methylococcus）、交替单胞菌属（Alteromonas）、小红卵菌属（Rhodovulum）、黑杆菌属（Phaeobacter）、热醋酸菌（Candidatus acetothermum）、神奇甲基菌；GWH3的优势菌属为黑杆菌属、不动杆菌属（Oleibacter）、不动细菌属、假单胞菌属（Pseudomonas）；GWH4的优势菌属为硝化螺菌属（Nitrospira）；LYY1的优势菌属为硝化螺菌属（Nitrospira）、热醋酸菌不动细菌属、亚栖热菌属（Meiothermus）、栖热菌属（Thermus）；LYY2的优势菌属为栖热菌属（Thermus）、热醋酸菌；WQBG1的优势菌属为嗜热芽胞杆菌属（Anoxybacillus） 不动细菌属、假单胞菌属。上述研究结果表明在广东从化温泉环境中蕴藏着极其丰富多样的微生物类群，且未知类群较多。

2.2.5 环境因子与群落结构之间的关系

环境因子在塑造微生物群落结构时起着重要的作用^［12］。为阐明微生物群落结构与环境因子的关系，本研究进行了典范对应分析（canonical correspondence analysis， CCA）。环境因子的箭头的长度代表相应的环境因子与研究对象 （ 样品， 微生物 ） 相关程度的大小，越长代表其对所研究对象 （样品， 微生物） 的分布影响越大。箭头连线与排序轴夹角的大小表示环境因子与排序轴相关性的大小，夹角小说明关系密切，箭头所处的象限表示环境因子与排序轴之间的正负相关性。如图3，在6个环境因子中，总碳（TC），总氮（TN），总有机碳（TOC），无机碳（IC）与轴1呈正相关；NH₄⁺和磷（P）与轴1呈负相关；P和TN，IC与轴2呈正相关；TOC与轴2呈负相关；TC和NH₄⁺对轴2几乎没有贡献度。TC对微生物群落的影响最大，相比较于其它几个理化指标，IC和TOC与微生物群落结构关联度较小。GWH1主要受P和NH₄⁺影响，GWH2主要受TC和TOC的影响，GWH3的微生物主要受TN和IC影响，而LYY1，LYY2，和WQBG1和GWH4这四个样点的微生物群落结构主要受水体中NH₄⁺浓度的影响。

2.2.6 纯培养结果

对流溪河温泉总部经济区、广东省干部疗养院、广东温泉宾馆7个温泉样点进行微生物分离后，共分离纯化出124株纯菌株，根据测序结果，对同一样点、同一分离培养基下分离纯化的菌株去重复，并除去未测序成功菌株后，共整理得到71株纯化菌株（序列号为：MT648573⁃MT648583， MT648559⁃MT648565， MT645307， MT645296⁃MT645303， MT645234⁃MT645242， MT397034⁃MT397044， MT397016⁃MT397020， MT394462⁃MT394476）。这些菌株在属间的分布情况见图4。

如图4，分离得到的71株菌分布于厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门、异常球菌⁃栖热菌门（Deinococcus⁃Thermus）和放线菌门（Actinobacteria）下的17个不同的属中。这些属分别为异常球菌属（Deinococcus）、亚栖热菌属（Meiothermus）、栖热菌属（Thermus）、厌氧芽胞菌属（Anoxybacillus）、硫杆菌属（Thiobacter）、固氮螺菌属（Azospirillum）、施莱格尔氏菌属（Schlegelella）、新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）、嗜氢菌属（Hydrogenophaga）、地芽胞杆菌属（Geobacillus）、假单胞菌属、温单胞菌属（Tepidimonas）、芽胞杆菌属（Bacillus）、热单胞菌属（Caldimonas）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、微杆

菌属（Microbacterium）和短芽胞菌属（Brevibacillus）。在不同样点中，种属的分布差异较大。其中芽胞杆菌属、假单胞菌属、温单胞菌属和地芽胞杆菌属在多个样点均可分离得到，为优势类群。以16S rRNA基因相似度98.7%为界^{［13⁃14］}在这71株菌中有9株为潜在新分类单元，其中3株属于温单胞菌属，2株属于栖热菌属，2株为嗜氢菌属，1株为施莱格尔氏菌属，1株为异常球菌属。

2.3 纤维素酶、淀粉酶活性筛选

选取分离到的71株细菌菌株进行纤维素酶、淀粉酶活性的筛选。有48株菌可以降解微晶纤维素，占筛选总数的67.61%（图5）。其中，地芽胞杆菌属12株、短芽胞菌属8株、施莱格尔氏菌属5株、芽胞杆菌属4株、亚栖热菌属4株、热单胞菌属4株、嗜氢菌属2株、微小杆菌属2株、微杆菌属2株、温单胞菌属2株、硫杆菌属1株、固氮螺菌属1株、异常球菌属1株，分别占筛选总数的16.90%、11.27%、7.04%、5.63%、5.63%、5.63%、2.82%、2.82%、2.82%、2.82%、1.41%、1.41%、1.41%。

有13株菌可以进行淀粉降解，占筛选总数的18.31%（图6），其中，芽胞杆菌属3株，嗜氢菌属2株，温单胞菌属2株，短芽胞菌属1株，热单胞菌属1株，微杆菌属1株，微小杆菌属1株，施莱格尔氏菌属1株，假单胞菌属1株，分别占筛选总数的4.23%、2.82%、2.82%、1.41%、1.41、1.41%、1.41%、1.41%、1.41%。

3 讨 论

前人研究发现，热泉微生物群落结构受控因素众多，如温度、pH、DOC、TOC含量等水化学条件以及空间因子（如地理距离），均对热泉微生物群落组成有显著影响^［15］。温度是控制温泉生境中微生物群落结构的关键因子^［16~18］。在从化温泉中，除GWH1的温度为33 ℃以外，其他样点的温度均在50 ℃左右，西藏热泉大多在70 ℃以上^［17］，云南热泉温度分布在66~96 ℃之间^［19］，总体上，云南和西藏热泉的温度高于广东从化温泉。云南热泉的pH分布在4.3~9.0之间，酸性热泉、中性热泉和碱性热泉均有分布^［20］；西藏热泉的pH分布在2.8~7.5^［21］，酸性或近中性，而广东从化温泉的pH分布在6.5~7.5之间，近中性。

随着免培养技术的快速发展，测序技术的应用为全面认识温泉环境微生物多样性提供了新的途径^［17~19］。从广东从化温泉7个样品中共获得509 413条有效序列，检测到40多个门，235个属，以变形菌门、拟杆菌门、硝化螺旋菌门为优势门。与其它研究相比较，广东从化温泉微生物群落组成多样性远远高于云南腾冲等地区，且未知类群所占比例较高。云南腾冲热海热泉中鼓鸣泉（GMQ）、蛤蟆嘴（HMZ）、黄瓜箐（HGQ）3处热泉中共获得578 061条有效序列，包括19个门，66个属，均以泉古菌门和厚壁菌门为主^［20］。这可能是由于广东从化温泉与云南腾冲热泉在温度、pH等理化因子方面有显著差异。在门分类水平上，广东从化温泉微生物群落与云南腾冲以及西藏温泉相似。云南热泉系统的微生物主要存在于蓝细菌（Cyanobacteria），绿弯菌门（Chloroflexi），硝化螺旋菌门，异常球菌⁃栖热菌门，变形菌门，厚壁菌门，拟杆菌门和放线菌门^［22］。西藏热泉微生物主要存在于厚壁菌门，变形菌门，蓝细菌和绿弯菌门中^［23］。

本研究基于已有的温泉微生物资源研究基础，针对温泉这一特殊的极端环境中可培养原核微生物资源多样性进行观察，通过多种分离培养基首次分离了广东从化的原核微生物。广东从化温泉已分离微生物主要分布于厚壁菌门、变形菌门、异常球菌⁃栖热菌门和放线菌门，与云南腾冲以及西藏温泉相似。从纯培养结果来看，云南腾冲热泉中分离培养出了大量微生物，分属于细菌域下的 6 个门（厚壁菌门、奇异球菌⁃栖热菌门、变形杆菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和放线菌门）和古菌域下的泉古菌门，可培养好氧类群以栖热菌属、亚栖热菌属、地芽胞杆菌属和厌氧芽胞菌属为主，厌氧类群主要为高温厌氧杆菌（Thermoanaerobacter）；其中有近30 %的可培养菌株与已描述菌种16S rRNA基因相似性低于97 %，为潜在的新分类单元^［20~27］。西藏样本纯培养结果显示，亚栖热菌属，栖热菌属，地芽胞杆菌属，伪芽胞杆菌属（Fictibacillus），厌氧芽胞杆菌属，芽胞杆菌属这6个属分离得到的菌株最多，所占比例较高^［23］。

本研究分别以微晶纤维素和淀粉为唯一碳源共筛选得到48株纤维素降解菌和13株淀粉降解菌，分别占总分离株数的67.61%和18.31%。通过16S rRNA 序列分析，分离到的纤维素降解菌分属13个属。其中，地芽胞杆菌属和短芽胞菌属为主要菌属。施莱格尔氏菌属曾多次被发现存在于富含纤维和淀粉环境中^{［28⁃30］}，但未有发现具有降解纤维素的能力，此为首次发现具有降解微晶纤维素能力的施莱格尔氏菌存在于热泉水体环境中。分离到的淀粉降解菌分属9个属。其中，芽胞杆菌属、嗜氢菌属和温单胞菌属为主要菌属。根据16S rRNA数据，得到的9个潜在新分类单元中，编号为67、120、80的既可以分解分解微晶纤维素，也可以分解淀粉。编号为55⁃1、63的可以分解微晶纤维素，不能分解淀粉。编号为33的可以分解淀粉，不能分解微晶纤维素。编号为27⁃2、150、157的没有分解微晶纤维素和淀粉的活性。有关这些潜在新分类单元的性质有待进一步的研究。

本文首次采用高通量测序技术和纯培养技术分析了广东从化地区原核微生物的多样性，发现其温泉中含有丰富的微生物资源。高通量测序技术显示：变形菌门、拟杆菌门、硝化螺旋菌门为优势门，所研究的温泉样点间的优势菌门和优势菌属相似。纯培养结果显示：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门、异常球菌⁃栖热菌门和放线菌门为主要菌门。从化温泉细菌群落α多样性分析显示：GWH2样点的物种最丰富，LYY1的其次，WQBG1的物种丰度最小；β多样性分析显示：地理限制不是影响微生物群落的主要因素。环境因子分析表明：总碳对微生物群落的影响最大，无机碳和总有机碳与微生物群落结构关联度较小。将纯培养得到的71株菌分别以微晶纤维素和淀粉为唯一碳源进行酶活筛选，共筛选得到48株纤维素降解菌和13株淀粉降解菌，分别占总分离株数的67.61%和18.31%。部分潜在新分类单元具有微晶纤维素酶或淀粉降解活性，有进一步探究的价值。

参考文献

[1] Satyanarayana T, Littlechild J, Kawarabayasi Y. Thermophilic microbes in environmental and industrial biotechnology [M]. Netherlands: Springer, 2013: 3⁃60.

[2] 孙盼, 顾淳, 任菲, 等. 云南洱源牛街热泉原核微生物多样性分析[J]. 微生物学报, 2010, 50(11): 1510⁃1518.

[3] Sun P, Gu C, Ren F, et al. Prokaryotic microbial phylogenetic diversity of “Eryuan Niujie” hot spring in Yunnan province, China [J]. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(11): 1510⁃1518.

[4] 王尚. 滇藏热泉微生物群落分布及其控制因素研究[D]. 北京:中国地质大学, 2015.

[5] Wang S. Study on distribution and control factors of microbial community in hot springs of Yunnan and Tibet[D]. Beijing: China University of Geosciences, 2015.

[6] 刘开辉, 丁小维, 张波,等. 高通量测序分析云南腾冲热海热泉真菌多样性[J]. 微生物学报, 2017, 57(9): 1314⁃1322.

[7] Liu K H, Ding X W, Zhang B, et al. High throughput sequencing analysis of the diversity of fungi in the thermal spring of the thermal sea of Tengchong, Yunnan province[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2017, 57(9): 1314⁃1322.

[8] Barbosa F C, Silvello M A, Goldbeck R. Cellulase and oxidative enzymes: new approaches, challenges and perspectives on cellulose degradation for bioethanol production [J]. Biotechnol Lett, 2020, 42(6): 875⁃884.

[9] Melendrez M C, Lange P K, Cohan F M, et al. Influence of molecular resolution on sequence⁃based discovery of ecological diversity among Synechococcus populations in an alkaline siliceous hot spring microbial mat [J]. Appl Environ Microbiol, 2011, 77(4): 1359⁃1367.

[10] Vick T J, Dodsworth J A, Costa K C, et al. Microbiology and geochemistry of Little Hot Creek, a hot spring environment in the Long Valley Caldera [J]. Geobiology, 2010, 8(2): 140⁃154.

[11] 陈墨香. 中国地热资源的分布及其开发利用[J]. 自然资源, 1991(5): 40⁃46, 58.

[12] Chen M X. Distribution and utilization of geothermal resources in China [J]. Resources Science, 1991(5): 40⁃46, 58.

[13] Bolyen E, Rideout J R, Dillon M R, et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2 [J]. Nat Biotechnol, 2019(37): 852⁃857.

[14] 鲜文东. 西藏塔格架地热区可培养高温菌多样性及纤维素、半纤维素降解菌研究[D]. 昆明: 云南大学生命科学学院(云南省微生物研究所),2016.

[15] Xian W D. Study on the diversity of high⁃temperature bacteria and cellulose and hemicellulose degrading bacteria in the geothermal area of Tibet [D]. Kunming: Yunnan University (Yunnan Institute of Microbiology), 2016.

[16] Kim OS, Cho YJ, Lee K, et al. Introducing EzTaxon⁃e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2012(62): 716⁃721.

[17] 吴鹏, 王友绍, 张建东. 珠江口萘双加氧酶基因多样性及其与环境因子相关性分析[J]. 生态科学. 2014, 33(2): 262⁃268.

[18] Wu P, Wang Y S, Zhang J D. Diversity of ndo genes in sediments of the Pearl River estuary in relation to environmental variables [J]. Ecological Science, 2014, 33(2): 262⁃268.

[19] Kim M, Oh H S, Park S C, et al. Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2014, 64: 346⁃351.

[20] Stackebrandt E, Goebel B M. Taxonomic note: aplace for DNA⁃DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 1994, 44(4): 846⁃849.

[21] 张艳敏. 西藏热泉微生物群落构成与功能及高温铁循环微生物作用研究[D]. 武汉:中国地质大学,2018.

[22] Zhang Y M. Microbial community composition and function in Tibet hot springs and microbial action of high⁃temperature iron cycle [D]. Wuhan: China University of Geosciences, 2018.

[23] Hou W G, Wang S, Dong H L, et al. A comprehensive census of microbial diversity in hot springs of Tengchong, Yunnan Province China using 16S rRNA gene pyrosequencing [J]. PLoS One, 2013, 8(1): 1⁃14.

[24] Wang S, Hou W, Dong H, et al. Control of temperature on microbial community structure in hot springs of the Tibetan plateau [J]. PLoS One, 2013, 8(5): e62901.

[25] Saxena R, Dhakan D B, Mittal P, et al. Metagenomic analysis of hot springs in central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments [J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 7: 2123.

[26] Song Z Q, Chen J Q, Jiang H C, et al. Diversity of Crenarchaeota in terrestrial hot springs in Tengchong, China [J]. Extremophiles, 2010, 14(3): 287⁃296.

[27] Song Z Q, Li W, Wang F P, et al. Abundance and diversity of archaeal accA gene in hot springs in Yunnan Province, China [J]. Extremophiles, 2013, 17(5): 871⁃879.

[28] Song Z Q, Wang F P, Zhi X Y, et al. Bacterial and archaeal diversities in Yunnan and Tibetan hot springs. China [J]. Environ Microbiol, 2013, 15(4): 1160⁃1175.

[29] 秦亚玲, 梁宗, 林宋阳, 等. 高通量测序分析云南腾冲热海热泉微生物多样性[J]. 微生物学通报, 2019, 10: 2482⁃2493.

[30] Qin Y L, Liang Z, Lin S Y, et al. High⁃throughput sequencing analysis of microbial diversity in Tengchong hot spring, Yunnan [J]. Microbiology China, 2019, 46 (10): 2482⁃2493.

[31] Huang Q, Dong C Z, Dong R M, et al. Archaeal and bacterial diversity in hot springs on the Tibetan plateau, China [J]. Extremophiles, 2011,15(5): 549⁃563.

[32] Pagaling E, Grant W D, Cowan D A, et al. Bacterial and archaeal diversity in two hot spring microbial mats from the geothermal region of Tengchong, China [J]. Extremophiles, 2012, 16(4): 607⁃618.

[33] Hedlund B P, Cole J K, Williams A J, et al. A review of the microbiology of the Rehai geothermal field in Tengchong, Yunnan Province, China [J]. Geosci Front, 2012, 3(3): 273⁃288.

[34] Yu T T, Zhang B H, Yao J C, et al. Lihuaxuella thermophila gen. nov., sp nov., isolated from a geothermal soil sample in Tengchong, Yunnan, south⁃west China [J]. Antonie van Leeuwenhoek. 2012, 102(4): 711⁃718.

[35] Zhou E M, Xian W D, Jiao J Y, et al. Physiological and genomic properties of Thermus tenuipuniceus sp. nov., a novel slight reddish color member isolated from a terrestrial geothermal spring [J]. Syst Appl Microbiol, 2018, 41(6): 611⁃618.

[36] Disnard J, Beaulieu C, Villemur R. Composition of the bacterial biota in slime developed in two machines at a Canadian paper mill [J]. Can J Microbiol, 2011, 57(2): 91⁃104.

[37] Prince V, Simao⁃Beaunoir A M, Beaulieu C. Amplified ribosomal DNA restriction analysis of free⁃living bacteria present in the headbox of a Canadian paper machine [J]. Can J Microbiol, 2009, 55(7): 810⁃817.

[38] 吴芳芳, 程强, 时留新. 造纸白水中的细菌多样性及系统发育树分析[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2014, 38(2): 123⁃127.

[39] Wu F F, Cheng Q, Shi L X. Bacterial diversity and phylogenetic analysis of whitewater in papermaking process [J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition), 2014, 38(2): 123⁃127.

基金资助

广东省基础与应用基础研究基金联合基金(2019A1515110227)