柑橘园土壤中解磷细菌多样性及其功能潜力分析

Diversity of phosphate solubilizing bacteria in citrus orchard soil and their functional potential analysis

摘要

解磷细菌（phosphate solubilizing bacteria，PSB）是重要的农业微生物资源，能够促进柑橘根系对土壤磷的吸收，但是目前对柑橘园土壤中PSB资源的研究不多。本研究以有效磷含量低的华南柑橘园土壤为对象，利用平板培养分离技术调查了PSB的资源和多样性，并测定了PSB菌株的解磷活性。研究结果表明，柑橘园土壤中PSB资源丰富，分离到20个属的54个PSB菌株，其中链霉菌（Streptomyces）、北里孢菌（Kitasatospora）、副伯克氏菌（Paraburkholderia）、伯克氏菌（Burkholderia）、芽胞杆菌（Bacillus）和类芽胞杆菌（Paenibacillus）6个属的菌株分离频率较高；PSB菌株对磷酸钙的解磷活性高、对磷酸铁的解磷活性低，而卵磷脂的解磷活性介于二者中间；北里孢菌和类芽胞杆菌对三种磷源的解磷活性均高于均值，可能是潜在的高活性PSB；溶磷圈大小可以筛选帮助PSB，但是不能用于评价解磷活性大小。这些研究结果为从红壤柑橘园中分离PSB资源并应用PSB提高柑橘植株的磷营养提供了依据。

Abstract

Phosphate solubilizing bacteria （PSB） are important agricultural microbial resources， and can promote the absorption of soil phosphorus by the roots of citrus plants. However， studies focusing on PSB resource in citrus orchard soils are scarce presently. This study took the citrus orchard soil with low content of available phosphorus in southern China as target to investigate PSB resources and diversity with plate culture and isolating methods， and phosphate solubilizing activity of PSB isolates was also measured. The results indicate that the citrus orchard soil harbors abundant PSB resources. 54 strains from 20 genera were isolated， and they were mainly distributed in 6 genera of Streptomyces， Kitasatospora， Paraburkholderia， Burkholderia， Bacillus and Paenibacillus. The phosphate solubilizing activities of PSB isolates were higher for calcium phosphate， lower for iron phosphate， and median for lecithin. The phosphate solubilizing activities of Kitasatospora and Paenibacillus were higher than the overall average， indicating that they were the potential PSB of high activity. Halo zone can be employed to screen PSB， but can not be used to evaluate the level of phosphate solubilizing activity. These results provide the basis for the isolation of PSB resources from red soil of citrus orchards and for the application of PSB to promote phosphorus nutrition of citrus plants.

Graphical abstract

关键词

柑橘园 / 解磷细菌 / 多样性 / 溶磷圈 / 红壤 / 解磷活性

Key words

citrus orchard / PSB / diversity / halo zone / phosphate solubilizing activity

0 引 言

解磷细菌（phosphate solubilizing bacteria， PSB）是重要的土壤微生物资源。研究表明，PSB能够通过各种机制活化土壤中的难溶性磷，提高其生物有效性，从而促进作物根系对磷的吸收利用^［1］。到目前为止，被报道具有解磷活性的细菌包括假单胞菌（Pseudomonas）、肠杆菌（Enterobacter）、不动杆菌（Acinetobacter）、节杆菌（Arthrobacter）、沙雷氏菌（Serratia）、泛菌（Pantoea）、芽胞杆菌（Bacillus）、无色杆菌（Achromobacter）、伯克氏菌（Burkholderia）、根瘤菌（Rhizobium）等20多个属，其中肠杆菌、泛菌、芽胞杆菌、假单胞菌、沙雷氏菌和不动杆菌几个属是常见的PSB资源^［2］。土壤中的难溶性磷主要包括难溶性无机磷（如磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝等）和有机磷（如卵磷脂、磷酸肌醇、核酸等）。PSB分泌的有机酸能够活化难溶性无机磷，其中葡萄糖酸的效应最强^［3］；对有机磷的活化则是通过分泌磷酸酶来实现^［1］。许多PSB菌株兼具活化难溶性无机磷和有机磷的功能，甚至分泌生长素类物质，从而促进作物生长和发育，因此，PSB也是重要的促进植物生长的根际细菌（plant growth promoting rhizobacteria， PGPR）。

柑橘是重要的亚热带果树，大多分布在热带亚热带的红壤区域。红壤呈酸性，土壤磷的生物有效性低，通常与铁和铝结合成磷酸铁和磷酸铝，难以被作物利用。柑橘根毛稀少，根系分布浅，对土壤养分有效性低、较敏感，在自然条件下通常与丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）建立共生关系，大大增加了根系对磷等养分的吸收和植株的生长^［4］。与AMF相比，对柑橘园土壤中PSB资源的研究相对较少，这可能是因为PSB对柑橘植株磷营养的促进效果低于AMF的促进效果^［5，6］。另一方面，研究者也指出PSB和AMF在促进柑橘生长上具有显著的协同效应，单独接种AMF或PSB使得植株生物量增加15.1%或71.9%，但是双接种使得植株生物量增加3.6倍^［5］。这些研究结果为强化柑橘园土壤中的PSB研究提供了契机。

为此，本研究以华南农业大学教学柑橘园为研究对象，利用平板分离培养技术对柑橘园土壤中的PSB的资源和多样性进行了调查，进而用液体培养基评价了分离到的PSB菌株的解磷活性，并利用回归分析等数据分析手段探讨了不同属的菌株的解磷活性和应用潜力，以期为利用PSB或者PSB与AMF协同促进柑橘植株磷营养奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

用于分离PSB的土壤采自华南农业大学长岗山教学果园（柑橘园，113^o22'4''E、23^o9'53''N）。在柑橘园中随机选取6株树，去除树冠滴水线内3~5 cm表土，用土钻取0~20 cm的土壤约每株200 g带回实验室，过夜稍微自然风干后用2 mm筛过筛混匀，置于4 ^oC保存。土壤的理化性质为：pH 4.43，有机质33.00 g/kg，全氮1.66 g/kg，全磷0.46 g/kg，全钾10.30 g/kg，有效氮151.00 mg/kg，有效磷6.06 mg/kg，有效钾98.30 mg/kg。

1.2 PSB菌株的分离、纯化与保存

按照Nautiyal的配方配制PVK、NBRIP和NBRIY培养基^［7］，用于分离活化难溶性无机磷的PSB；按照标准NY/T 1847-2010的配方配制有机磷培养基^［8］，用于分离活化有机磷的PSB，其中有机磷源采用0.2 g/L卵磷脂。

准确称取5.00 g土样到装有95 mL无菌去离子水的250 mL三角瓶中，在28 ^oC、200 r/min条件下摇床振荡30 min，然后在超净工作台上将土壤悬液静置20~30 s，取1 mL上清液进行十倍稀释，制成10^-3、10^-4、10^-5的系列稀释液。各取3个稀释浓度样品100 µL涂布于前述的四种分离培养基中，每个浓度3个平板，置于生化培养箱中28 ^oC培养5 d，挑取形成明显溶磷圈的菌落，在相应分离培养基中进行纯化并编号。每个菌株在纯化约5次后均不含杂菌，进一步在LB培养基上纯化3次，然后在LB斜面培养基上培养并保存，留待后用。

1.3 PSB的分子鉴定

将纯化后的PSB分别划线到LB固体培养基中，28 ^oC生化培养箱培养24~72 h。挑取单菌落，使用细菌16S rDNA基因通用引物的全长引物27F/1492R进行16S rDNA全长扩增^［9］，PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，使用EzTaxon database（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）对分离菌株的16S rDNA测序结果进行序列比对，鉴定菌株。

1.4 PSB的解磷活性测定

本研究以PSB在液体培养基中活化难溶性磷而形成的可溶性磷浓度来表征解磷活性。按1%的接种量，将PSB菌液加入到装有15 mL难溶性的磷酸钙、磷酸铁或蛋黄卵磷脂的液体培养基的50 mL离心管中，每个菌株3个重复，置于恒温摇床28 ^oC，200 r/min培养5 d。培养结束后于冷冻离心机4 ^oC，6 500 r/min离心15 min，吸取适量的上清液，使用钼锑抗比色法测定上清液中的可溶性磷含量^［10］。同时，使用pH计测定上清液的最终pH值。

1.5 PSB的溶磷圈大小测定

挑取PSB菌株的单菌落装于有10 mL LB液体培养基的50 mL离心管中，置于恒温摇床，28 ºC，200 r/min培养。待菌长到对数期，使用点接法将2 μL活化菌液点在含难溶性的磷酸钙、磷酸铁或蛋黄卵磷脂的固体培养基中，每个菌株3个重复。菌株在难溶性无机磷和有机磷培养基中分别培养7 d和5 d，记录下溶磷圈直径（D）以及菌落直径（d），计算出D/d的值。

1.6 数据分析

除菌株数量外，所有数据均为3个重复的平均值；回归分析用MicroSoft Excell 2010进行。

2 结果与分析

2.1 柑橘园土壤中PSB的多样性

利用3种选择性培养基，我们从柑橘园土壤中分离到54株PSB，分别属于3个门、5个纲、10个属、17个科、20个属，表现出很高的多样性（表1）。放线菌门有26个菌株，占48.1%，是最大的类群；变形菌门和厚壁菌门分别有11和17个菌株，占20.3%和31.5%。从属的分类水平看，放线菌门、变形菌门和厚壁菌门的菌株分属于12、5和3个属，表明来自放线菌门的PSB的多样性水平高于其他两个门。在20个属中，来自链霉菌（Streptomyces）、北里孢菌（Kitasatospora）、副伯克氏菌（Paraburkholderia）、伯克氏菌（Burkholderia）、芽胞杆菌和类芽胞杆菌6个属的菌株数量较多，均大于3个（表1）。

2.2 柑橘园土壤中PSB的解磷活性

以磷酸钙、磷酸铁或卵磷脂为唯一磷源，我们在液体培养体系中评估了54个菌株的解磷活性。图1表明，在添加磷酸钙的培养基中，4个菌株导致磷浓度低于对照，其他50个菌株导致磷浓度达到对照的1.0~29.5倍，其中达到10.0~14.9倍的有16个菌株，倍数较低或较高的菌株数量依次减少，可见PSB对磷酸钙的解磷活性表现出经典的正态分布；在添加磷酸铁的培养基中，高达38个菌株导致磷浓度低于对照，其他16个菌株导致磷浓度达到对照的1.0~9.8倍，其中菌株数量随着倍数的增加而降低，可见PSB对磷酸铁的解磷活性弱，且高活性菌株少；在添加卵磷脂的培养基中，13个菌株导致磷浓度低于对照，其他41个菌株导致磷浓度达到对照的1.0~6.2倍，其中菌株数量也随着倍数的增加而降低（图1），这与磷酸铁的PSB类似。

表1的结果表明，来自链霉菌、北里孢菌、副伯克氏菌、伯克氏菌、芽胞杆菌和类芽胞杆菌6个属的菌株数量较多，可能是分离获得的PSB的主要类群。我们依据液体培养体系的数据对其解磷活性进行进一步分析，结果表明北里孢菌、芽胞杆菌和类芽胞杆菌对磷酸钙的解磷活性高于所有菌株的均值，链霉菌、北里孢菌、类芽胞杆菌和副伯克氏菌对磷酸铁的解磷活性高于所有菌株的均值，链霉菌、北里孢菌和类芽胞杆菌对卵磷脂的解磷活性高于所有菌株的均值（表2）。综合来看，北里孢菌和类芽胞杆菌对所有三种难溶性磷源的解磷活性均高于均值，表明两者可能是潜在的高活性PSB。

我们计算了六个属所含的3~11个菌株的解磷活性的变异系数，以了解各个属不同菌株解磷活性的一致性。总体而言，PSB活化难溶性磷源的变异系数较高，为15.4%~206.2%，说明不同解磷菌株的解磷活性差异非常大，其中活化磷酸钙、磷酸铁和卵磷脂的变异系数均值分别为66.0%、153.5%和75.6%（表2）。值得注意的是，北里孢菌活化磷酸钙、磷酸铁和卵磷脂的变异系数分别为34.6%、49.2%和41.3%，类芽胞杆菌活化磷酸钙、磷酸铁和卵磷脂的变异系数分别为15.4%、65.2%和39.9%，均是六个属中最低的两个属，表明来自这两个属的大多数PSB菌株具有较高的解磷活性。

北里孢菌和类芽胞杆菌属的菌株生长缓慢，在LB培养基上生长5 d后菌落大小1~2 mm；菌体呈长杆状或短杆状；在以磷酸钙、磷酸铁或卵磷脂为唯一磷源的培养基上均能形成明显的溶磷圈（图2）。

pH是影响难溶性无机磷有效性的重要因子。我们测定了不同唯一磷源的液体培养基的pH值，对培养基中磷浓度和pH进行了回归分析，结果发现在以磷酸钙和磷酸铁为唯一磷源的培养基中，pH值与磷浓度显著相关，随着pH值增加磷酸钙和磷酸铁的有效性降低，且前者的降低幅度远大于后者，表明磷酸钙的有效性对pH值变化更为敏感（图3）。相反，在以卵磷脂为唯一磷源的培养基中，pH值与磷浓度无相关性，表明pH值不能影响有机磷的有效性。

2.3 溶磷圈评估解磷活性的可靠性

与液体培养体系相比，利用固体培养基上形成的溶磷圈大小来判断PSB的解磷活性更为便捷，被广泛应用。我们对液体培养基中的磷浓度和固体培养基上的溶磷圈大小进行了回归分析，发现在以磷酸钙或卵磷脂为唯一磷源时，磷浓度和溶磷圈大小没有相关性；而在以磷酸铁为唯一磷源时，磷浓度和溶磷圈大小之间的相关性刚刚达到显著水平（图4）。这些结果表明，以固体培养基上的溶磷圈大小来判断PSB的解磷活性，存在一定的风险，并不能很好地反映菌株真实的解磷活性。

3 讨 论

3.1 柑橘园土壤中蕴藏丰富的PSB资源

柑橘根系分布浅、根毛稀少，对土壤磷的吸收利用能力差，通常依赖于土壤微生物获取更多的磷营养^［11］。许多研究报道了柑橘对共生真菌AMF的依赖性^［4，12］，而对PSB的研究报道较少，但是PSB对磷营养的促进效应在许多草本和木本作物上都有大量报道^{［13，14］}。本研究调查了柑橘园土壤中的PSB的多样性，从一个柑橘园中分离获得54个菌株，属于20个属，表现出较高的多样性，为利用PSB提高柑橘的磷营养奠定了物质基础。

本研究获得的54个菌株对磷酸钙具有较好的解磷活性，仅有4个菌株（7.4%）的磷浓度低于对照；而对磷酸铁的解磷活性较弱，高达38个菌株（70.4%）的磷浓度低于对照；对卵磷脂的解磷活性介于两者之间，为13株（24.1%）。这可能是因为磷酸钙对土壤pH的变化比磷酸铁更为敏感^［15］。对果园红壤磷分级发现，磷酸钙、磷酸铁和有机磷分别占总磷的13.8%、45.1%和23.6%^［16］，即磷酸铁是红壤中主要的难溶性磷，可见分离获得对磷酸铁具有较强解磷活性的菌株对红壤柑橘园具有更大的应用价值，应该加强研究。另一个值得探讨的问题是PSB活化磷酸铁的机制。既然磷酸铁对pH的敏感性较差，那么PSB分泌有机酸可能不是其活化磷酸铁的主要机制或唯一机制，可以考虑把分泌铁载体这一特性作为磷酸铁活化菌株的筛选指标^［17］。

3.2 北里孢菌和类芽胞杆菌是重要的高活性PSB资源

由于PSB具有明确的实际应用价值，一直是土壤微生物研究的热点。根据前人的报道，假单胞菌和芽胞杆菌是常见的PSB来源属^［2］，但是本研究中并未分离到假单胞菌。在本研究中，尽管链霉菌、北里孢菌、副伯克氏菌、伯克氏菌、芽胞杆菌和类芽胞杆菌6个属的菌株的分离频率较高，但是基于液体培养基的磷浓度数据表明北里孢菌和类芽胞杆菌属的菌株的解磷活性更高。北里孢菌属于放线菌纲（Actinobacteria），从巴西的热带亚热带土壤中分离并首次认定为PSB^［18］；低磷土壤中北里孢菌的丰度高于高磷土壤^［19］，可能与其较高的解磷活性有关。类芽胞杆菌属菌株具有多功能特征，不仅能够解磷，还能固氮、产生铁载体、分泌植物激素等^［20］。此外，本研究还利用变异系数建立了评价各个属菌株解磷活性的新策略，用于表征某个属中不同菌株的解磷活性的一致性程度，发现来自北里孢菌和类芽胞杆菌属的菌株的解磷活性比较一致。显然，本研究表明，如果从果园红壤中分离筛选PSB，北里孢菌和类芽胞杆菌可能是最重要的高活性菌株来源，因此，应该成为今后PSB资源研究的重点关注对象。

3.3 以溶磷圈大小评价解磷活性存在局限性

难溶性磷源在固体培养基中以不可溶的沉淀形式存在，PSB分泌的有机酸或者磷酸酶活化难溶性磷后形成易于识别的透明溶磷圈，为PSB的分离提供了便捷，因此，溶磷圈及其大小一直是重要的PSB分离筛选指标^［21］。然而，本研究发现在活化磷酸钙和卵磷脂时，PSB形成的溶磷圈大小并不与其解磷活性显著相关，仅在活化磷酸铁时表现出显著的相关性。这表明我们只能根据溶磷圈的有无来识别PSB，而并不能根据溶磷圈的大小来判定菌株的解磷活性高低，至少在磷酸钙和卵磷脂上是这样。多个PSB菌株在固体培养基上不能形成溶磷圈，但是在液体培养基中具有很好的解磷活性，因此认为溶磷圈大小不适合用于评价PSB的解磷活性^［22］。溶磷圈大小不能表征解磷活性可能与有机酸或者磷酸酶在固体培养基上的扩散距离有关，不同菌株分泌的有机酸和磷酸酶的组成并不相同，不同有机酸的溶磷能力并不相同^［3，23］，不同磷酸酶水解有机磷的能力不同，而不同有机酸和不同磷酸酶在琼脂中的扩散能力也不相同。这些差异可能导致溶磷圈大小并不能代表解磷活性。

4 结 论

本研究以磷酸钙、磷酸铁或卵磷脂为唯一磷源，通过平板培养和观察溶磷圈调查了柑橘园土壤中PSB的资源和多样性，利用液体培养体系评价了PSB菌株的解磷活性，并进一步分析了各个属菌株的应用潜力。试验结果表明，柑橘园土壤中PSB资源丰富，分离到的54个菌株分属于3个门、5个纲、10个属、17个科、20个属，链霉菌、北里孢菌、副伯克氏菌、伯克氏菌、芽胞杆菌和类芽胞杆菌6个属的分离频率较高；PSB对磷酸钙的解磷活性最强，对磷酸铁的解磷活性最弱；来自北里孢菌和类芽胞杆菌属的菌株的对三种磷源的解磷活性都较强，是重要的PSB来源；pH显著影响磷酸钙和磷酸铁的活化，与卵磷脂的活化无关；溶磷圈可以用于PSB的分离，但是其大小不适于评价解磷活性的强弱。

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基金资助

广东省科技创新战略专项资金（重点领域研发计划）(2018B020205001)