培养基灭菌方式对细菌分离效率的影响

Effect of the medium sterilization on bacterial isolation efficiency

摘要

自然界蕴含大量未/难培养微生物，分离这些微生物对理论研究和资源开发具有重要意义。本研究使用高压灭菌和过滤除菌方式制备培养基，采用稀释涂布方法，从红树林灰泥样品中分离获得123株细菌，通过16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定，进而探究培养基灭菌方式对细菌分离效果的影响。结果表明：过滤除菌培养基生长的单菌落数目（339±82）个显著多于高压灭菌培养基生长的单菌落数目（179±65）个；两种培养基分离细菌的群落结构在门、科和属分类水平上总体相似，但优势类群的数目和少数类群存在差异；过滤除菌培养基分离细菌的Shannon Wiener’s指数、均匀度、新种率、基因多样性均高于高压灭菌培养基，而其与近缘模式菌株相似度的平均值和中位数则低于高压灭菌培养基。因此，过滤除菌培养基分离获得细菌的多样性、均匀性和新颖性均高于高压灭菌培养基。本研究首次探究培养基灭菌方式对细菌分离效果的影响，具有更高分离效率的过滤除菌培养基为未/难培养微生物菌株资源获取提供了借鉴。

Abstract

Nature contains a large number of uncultured microorganisms， isolating these microorganisms is of great significance for theoretical research and resource development. In this study， 123 bacterial strains were isolated from the grey mud of the mangrove by spreading serial dilutions on media prepared by the autoclave sterilization （AS） and the filter sterilization （FS）， and were identified by 16S rRNA gene sequence analysis. The results showed that the number of colonies on the FS media （339±82） was significantly higher than that on the AS media （179±65）； the community composition of bacteria from the two media was similar at the phylum， family and genus levels， but their numbers and a few taxa were different. The Shannon Wiener’s index， evenness， proportion of new species and phylotype diversity of bacteria isolated from the FS media were higher than those of bacteria isolated from the FS media； while the average value and median of the similarity of bacteria from the FS media with the closest type strains were lower than those of bacteria from the AS media. Therefore， the diversity， evenness and novelty of bacteria obtained by the FS media were much higher than those of bacteria from the AS media. This study is the first time to explore the effect of the medium sterilization on bacterial isolation efficiency， and the filter sterilization with the higher isolation efficiency provides a clue for the acquisition of uncultured microbial strain.

Graphical abstract

关键词

过滤除菌 / 高压灭菌 / 16S rRNA基因 / 分离效率

Key words

filter sterilization / autoclave sterilization / 16S rRNA gene / isolation efficiency

0 引 言

自然界蕴含大量微生物。截至2020年6月，依照国际原核生物命名法发表的微生物共有19 527种（https：//lpsn.dsmz.de/text/numbers）。与这些可培养微生物相比，有数百万种^［1］至十亿种^［2］微生物仍未被培养，这些尚未获得纯培养物的微生物被称作未/难培养微生物^［3］。未/难培养微生物数目众多，类型多样，是地球生物圈的重要组成部分，参与碳、氮、硫等多种元素的生物地球化学循环和能量流动^［4］；它们具有高度异化的新陈代谢途径，能够产生结构复杂的代谢产物^［5］，是重要的生物资源。由于大量微生物未/难培养，在很大程度上限制了微生物资源的开发和利用。为了更加全面地认识微生物多样性和挖掘其潜在新功能，未/难培养微生物的分离重新得到了重视^［6］。

为了提高未/难培养微生物的分离效率，目前已经建立了多种培养方法，如极限稀释培养法^［7］、微流控芯片技术^［8］、模拟自然环境扩散盒技术^［9］、细胞微囊包埋技术^［10］和培养组学技术^［11］等。相对于传统的稀释涂布分离方法，这些新方法的使用显著提高了微生物的培养效率，获得了大量微生物新分类单元。微生物的生长繁殖需要多种营养成分，因此，培养基的组分对微生物可培养性有显著的影响^［12］。近些年，研究人员通过调整培养基组分（如寡营养^［8］、更换凝固剂^［13］、添加过氧化氢酶^［14］、不同电子供体和受体^［15］、信号分子^［16］和原位样品浸液^［17］等）和培养条件（延长培养时间^［18］和模拟原位培养^［10］等）来提高微生物可培养性。在微生物分离过程中，为了避免杂菌干扰，改良培养基通常要进行灭菌处理。但是，迄今为止，培养基灭菌方式对微生物可培养性的影响却鲜有报道。

本研究使用红树林灰泥样品，培养基分别采用高压灭菌和过滤除菌，利用稀释涂布方法分离微生物，并对分离菌株进行16S rRNA基因序列测序，确定其分类信息，最后通过单菌落数目、物种组成、物种和基因多样性以及相似度水平等方面分析，探索培养基灭菌方式对细菌分离效果的影响。

1 材料与试剂

1.1 样品采集

2019年10月，在惠州大亚湾近岸采集底泥（22°42′15″N，114°31′55″E），放置于4 °C样品箱后带回实验室。在超净工作台对样品进行分装，分别于4°C和-80 °C保存备用。使用上海仪电科学仪器股份有限公司的PHS⁃3C型pH计测定样品pH，使用奥豪斯仪器（常州）有限公司的便携式电导率仪ST300C测定样品电导率，并计算其盐度。

1.2 培养基制备

本研究使用R2A培养基进行细菌分离和培养。R2A培养基组成：0.25 g胰蛋白胨，0.5 g酸水解酪蛋白，0.5 g可溶性淀粉，0.3 g磷酸氢二钾，0.1 g硫酸镁，0.3 g丙酮酸钠，0.25 g 蛋白胨，0.5 g葡萄糖，15 g琼脂粉，1 L去离子水，pH 7.3。为了消除磷酸盐和琼脂高压灭菌过程产生过氧化氢的影响，将R2A营养成分和琼脂溶液分别单独在1×10⁵ Pa灭菌20 min，随后混匀制备高压灭菌（autoclave sterilization，AS）培养基。过滤除菌（filter sterilization，FS）培养基则先称取可溶性淀粉并加热使其溶解，而后称取其他成分并加入去离子水溶解获得R2A液体培养基；用0.22 μm滤膜将R2A液体培养基过滤至无菌三角瓶中，与高压灭菌琼脂粉溶液混合均匀，制备培养基。

1.3 细菌分离纯化

取2 g灰泥置于50 mL离心管中，加入18 mL生理盐水，混匀后放置于28 °C恒温摇床120 r/min震荡12 h。取2 mL混合液进行10倍梯度稀释，即10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，取0.1 mL不同稀释度的混合液涂布于高压灭菌和过滤除菌的R2A固体培养基上，每个稀释梯度6个重复，设置空白培养基为对照。涂布后将培养基放置于28 °C恒温培养箱中培养7 d，然后记录单菌落数目，并根据菌落形态特征进行菌株分离。挑取单菌落划线纯化，将获得的纯培养菌株与甘油溶液（25%，V/V）混匀后置于-80 °C保藏。

1.4 细菌鉴定和系统发育分析

基因组DNA通过美基生物科技有限公司DNA提取试剂盒进行提取。采用细菌通用引物27F和1492R扩增菌株的16S rRNA基因^［19］。PCR反应体系（25 μL）：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix（金客隆，RE0210），0.5 μL引物27F（10 mmol/L），0.5 μL引物1492R，0.5 μL模板DNA，11 μL ddH₂O。PCR扩增程序：95 °C预变性5 min，95 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸90 s，运行30个循环，72 °C延伸10 min，16 °C保存10 min。使用1%的琼脂糖对PCR扩增子进行凝胶电泳检测，合格扩增子送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。

使用软件DNAMA v8对16S rRNA基因序列进行拼接，并将拼接序列提交至EzBioCloud网站（www.ezbiocloud.net/identify）^［20］进行比对分析，确定其分类地位和近缘菌株的相似度。

1.5 细菌多样性分析

根据每个菌株的鉴定结果，在门、科和属等分类水平上比较其群落组成。定义97%的16S rRNA基因序列相似度作为划分不同分类单元的阈值，根据公式（1）和（2）分别计算Shannon Wiener’s指数（H）^［21］和均匀度指数（E）。新种率为新种（与已报道物种模式菌株间16S rRNA序列相似度低于98.65%^［22］）数目占分离获得细菌总数目的比例，基因多样性定义为不同基因型占总基因数目的比例。使用SPSS软件的T检验进行独立样品间的差异显著性分析。

H=-\sum _{i=\mathrm{1}}^S{P}_i\times lnPi(\mathrm{1})

E=\frac{H}{lnS}(\mathrm{2})

其中S为分类单元数目，P_i 为第i个分类单元相对多度，P_i =n_i /N，n_i 为第i个分类单元菌株数目，N为所有分类单元总菌株数目。

2 结果与分析

2.1 细菌分离和纯化

本研究所用的底泥样品呈现灰色，pH为7.45，电导率为2.62 ms/cm，对应的盐度为9.95‰。稀释样品涂布在AS和FS固体培养基培养7 d后，进行细菌分离和纯化。由于10^-5稀释度的培养基生长的单菌落数目适中，便于观察计数，因此选择该稀释度进行单菌落数目统计。两种固体培养基生长的单菌落数目如图1所示，AS培养基生长单菌落数目为（179±65）个，FS培养基生长单菌落数目为（339±82）个。这表明：FS培养基的单菌落数目显著多于AS培养基的单菌落数目（P=0.21）。通过标准稀释涂布和连续划线的方法，共分离纯化123株细菌，其中AS培养基对应65株，FS培养基对应58株。

2.2 细菌鉴定和系统发育分析

本研究共获得123个16S rRNA基因序列，其长度范围是1 336~1 436 bp，平均序列长度是1 400 bp。将测序获得的16S rRNA基因序列与EzBioCloud数据库模式菌株进行比对，获得其分类信息。如表1和表2所示，123株细菌分别属于放线菌门（Actinobacteria）（58株，47.2%），厚壁菌门（Firmicutes）（48株，39.0%），变形菌门（Proteobacteria）（13株，10.6%）和拟杆菌门（Bacteroidetes）（4株，3.2%）。在科分类水平上，123株细菌涵盖15个科，优势科包括芽胞杆菌科（Bacillaceae，46株，37.4%）、脱醌菌科（Demequinaceae，19株，15.4%）、原小单孢菌科（Promicromonosporaceae，15株，12.2%）和微杆菌科（Microbacteriaceae，14株，11.4%）。在属分类水平上，涵盖了22个属，优势属包括芽胞杆菌属（Bacillus，32株，24.2%）、脱醌菌属（Demequina，19株，14.4%）和白蚁菌属（Isoptericola，15株，11.4%）。在种分类水平上，其包括45个种，优势种为稻壳芽胞杆菌（Bacillus oryzaecorticis，19株，14.4%）和嘉义白蚁菌（Isoptericola chiayiensis，15株，11.4%）。123株细菌中，共有22株细菌（AS对应的7株细菌和FS对应的15株细菌）与最近缘模式菌株的16S rRNA基因序列相似度低于98.65%，为潜在新种。

2.3 两种培养基分离细菌的群落组成

本研究在门、科、属和种的分类水平上比较AS和FS两种培养基分离细菌的群落组成。如图2a所示，在门分类水平上，AS和FS培养基分离细菌对应的门分别是3和4个，其中4株拟杆菌门细菌仅从FS培养基有分离。如图2b所示，在科分类水平上，AS和FS培养基分离细菌对应的科分别是11和13个；两种培养基分离细菌中共有优势科为芽胞杆菌科、原小单孢菌科、脱醌菌科和微杆菌科；仅FS培养基分离获得了环杆菌科（Cyclobacteriaceae）细菌，AS培养基则分离获得更高比例的芽胞杆菌科、微杆菌科和赤杆菌科细菌。如图2c所示，在属分类水平上，AS和FS培养基分离细菌对应属的数目分别是15个和17个；AS培养基分离的属于芽胞杆菌属、白蚁菌属、微杆菌属（Microbacterium）、Cytobacillus属的细菌比例高于FS培养基，FS培养基分离的属于脱醌菌属的细菌比例则高于AS培养基。如表1和表2所示，在分离获得的45种细菌中，AS和FS培养基分离细菌共有物种数目仅有9个，其中共有优势种为嘉义白蚁菌；AS培养基分离细菌特有的优势种为稻壳芽胞杆菌，而FS培养基分离细菌特有的优势种为海滨生脱醌菌（Demequina activiva）和咸木脱醌菌（Demequina salsinemoris）；在稀有种（定义为该种为单菌株）方面，AS和FS培养基分离细菌中特有稀有种的数目均为14个。两种培养基分离细菌群落组成的比较分析表明：两种培养基分离细菌的种类存在显著差异。

2.4 两种培养基分离细菌的多样性

通过比较两种培养基分离细菌的多样性指数确定其分离效率。如表3所示，AS培养基获得细菌的Shannon Wiener’s指数和均匀度指数分别为2.14和0.81，均低于FS培养基获得细菌对应的数值（2.34和0.83）。这表明：相对于AS培养基，FS培养基分离获得细菌的多样性更丰富，均匀度也更高。AS培养基获得细菌的新种率和基因多样性同样低于FS培养基获得细菌对应数值，AS培养基获得细菌与近缘参考菌株相似度平均值和中位数均高于FS培养基获得细菌对应数值。这表明：相对于AS培养基，FS培养基分离获得细菌的新颖性更高，即采用FS培养基进行细菌分离，获得新资源的概率更高。因此，两种培养基分离细菌的多样性分析表明：过滤除菌的培养基具有更高的细菌分离效率。

3 讨 论

3.1 未/难培养微生物分离方法

随着测序技术发展，大量未/难培养的微生物类群被发现。而且这些未/难培养微生物蕴含许多新颖独特的代谢途径、生化反应、代谢产物等，应用开发潜力巨大。因此，分离和获得未/难培养微生物具有重要意义^［23］。由于生存环境复杂，微生物演化出了多种多样的生理代谢途径来适应环境。相应地，提高微生物的可培养性存在多种方法^［24］。近些年，多种方法被用于未/难培养微生物的分离^［24］。按分离目标不同，可划分为“定向筛选”和“非定向筛选”。反向基因组学的分离方法^［25］和培养基中添加黏蛋白分离嗜黏蛋白阿克曼氏菌方法^［26］均属于定向筛选，它们均以特定的未/难培养微生物为目标。模拟原位环境的I⁃chip^［9］、高通量的微液滴^［8］、多种培养条件和培养组合的培养组学^［11］等技术属于非定向筛选，这些方法则是以分离更多未/难培养微生物为目标。培养基为微生物的生长繁殖提供了营养和介质，所以培养基的营养成分对于未/难培养微生物的分离非常重要。磷酸盐和琼脂共同高压灭菌会产生大量对微生物具有毒害作用的H₂O₂^［14］，因此建议两者分别高压灭菌后再混合。本研究中两者也是单独灭菌的。我们发现：过滤除菌培养基对应的微生物分离效率高于高压灭菌培养基。在排除H₂O₂影响的基础上，推测培养基（以R2A培养基为例）包含的复杂成分比如蛋白胨、淀粉、丙酮酸、葡萄糖和多种盐在高压灭菌过程中可能：① 发生复杂的反应进而产生一些对微生物生长有毒害的物质；② 破坏蛋白胨中的多种维生素进而影响微生物生长。相反，过滤除菌的处理方式则可以避免这些影响。由于本研究缺少对高压灭菌和过滤除菌后培养基成分比较，因此两种灭菌方式对应细菌分离效率差异的内在机制有待于深入研究。

3.2 微生物菌株资源

分布于热带和亚热带的红树林生态系统处于海洋、陆地和大气动态交界面，具有高盐、高湿、强日照、低氧以及海水周期性浸渍等特点，蕴育了丰富而又独特的微生物。采用纯培养分离技术对广西山口红树林土样可培养细菌多样性进行分析，在分离的117株细菌中，优势类群分属于芽胞杆菌门、放线菌门和变形菌门^［27］，这与本研究的优势类群相同。本研究的放线菌门中的优势属为白蚁菌属、脱醌菌属、微杆菌属，这与从印度洋红树林获得的优势类群为链霉菌和马杜拉菌属^［28］和从九龙江口红树林获得的优势类群为小单胞菌和链霉菌存在差异^［29］。从海南红树林分离的放线菌优势类群为脱醌菌属和微球菌属^［30］，从巴西红树林中分离的放线菌则以微杆菌居多^［31］，这些与本研究结果类似。分析表明：不同地区的红树林包含的可培养细菌的群落组成存在相似性，也存在差异，推测可能与红树林所处的地理位置、温度和沿岸人类活动相关，也与研究使用的培养基种类、灭菌方式和培养条件等相关。同时，本研究获得的22株潜在新种主要属于脱醌菌和白蚁菌，暗示红树林生境包含着丰富新颖的放线菌新资源，因此红树林已经成为放线菌资源调查、获取和天然产物分离鉴定及其生物合成机制研究的热点^［32］。

本研究首次探讨了培养基灭菌方式对细菌分离效率的影响，从红树林泥样中分离获得了123株细菌，包含22株潜在新种，发现过滤除菌培养菌的分离效率高于高压灭菌培养基。本研究获得了大量的微生物菌株资源，为后续的开发和利用奠定了物质基础，针对灭菌方式对细菌分离效率的探索也为未/难培养微生物的分离培养提供了指导。

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基金资助

广东省重点领域研发计划(2018B020205003)

广东省省级科技计划项目(2019B030316017)