新疆特色药食两用植物恰玛古内生放线菌的分离与鉴定

Isolation and identification of endophytic actinomycetes from medicinal and edible plant Qamgur in Xinjiang

摘要

恰玛古（Qamgur， Brassica rapa L.）内生菌的研究主要集中在内生真菌，内生放线菌的研究报道较少。通过研究新疆药食两用植物恰玛古内生放线菌多样性，以期发现产新活性物质的放线菌或新种放线菌，为研究微生物药物奠定基础。从恰玛古根、茎和叶三个部位分离培养获得内生放线菌，对其菌落与个体形态进行观察，并利用序列测定方法进行鉴定，以获取其分类地位。从恰玛古三个部位共分离得到17株内生放线菌，其中12株为革兰氏阳性杆菌，3株为革兰氏阳性球菌，2株为革兰氏阳性丝状菌；17株内生放线菌分属于红球菌属（Rhodococcus）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、链霉菌属（Streptomyces）、短杆菌属（Brevibacterium）、小短杆菌属（Brachybacterium）、两面神菌属（Janibacter）和微杆菌属（Microbacterium）。从新疆药食两用植物恰玛古中分离获得17株内生放线菌以稀有放线菌为主。

Abstract

Endophytic actinomycetes can produce a variety of secondary metabolites and are important sources of new antibiotics. At present， the study of the endophytic actinomycetes from Qamgur （Brassica rapa L.） mainly focuses on endophytic fungi， and there are few reports of endophytic actinomycetes. In order to find new actinomycetes or new active substances， the diversity of endophytic actinomycetes from Qamgur， a dual⁃purpose plant for medicine and food in Xinjiang， was studied. Endophytic actinomycetes were isolated and cultured from the roots， stems and leaves of Qamgur， subjected to morphological observation， 16S rDNA sequencing and phylogenetic tree analysis. 17 strains were isolated， and 12 were G⁺ bacilli， 3 were G⁺ cocci and 2 were G⁺ filaments. Sequence analysis and phylogenetic tree show that 17 strains belong to Rhodococcus， Nocardiopsis， Streptomyces， Brevibacterium， Brachybacterium， Janibacter and Microbacterium， and most of them are rare actinomycetes.

Graphical abstract

关键词

恰玛古 / 内生放线菌 / 分离鉴定

Key words

Brassica rapa L. / endophytic actinomycetes / isolation and identification

0 引 言

人们对于新抗生素的需求越来越大，而现有的抗生素也越来越无法满足临床需要。放线菌是寻找和发现天然活性物质的生物资源之一^［1］，从微生物中发现的8 000多种生物活性物质中，近50%是由放线菌产生的^［2］。目前为止，越来越难发现新的放线菌以及新的活性物质，研究学者开始对之前研究较少的特殊环境进行研究，从中寻找有用的放线菌以及有效的活性物质。

植物内生菌主要包括内生细菌、内生真菌以及内生放线菌^［3］。作为植物微生态系统中不可或缺的组成部分，它们因长期生存于宿主体内，与其之间相互提供所需要的营养，同时能通过某些方式，如信号传导或者自身新陈代谢的方式对植物宿主的生长产生一定作用，且有利于增强植物宿主对于周围环境的适应能力。人们对于内生菌的研究，最早始于19世纪中叶^［4］。有研究指出，能从内生菌中分离得到 51%的具有生物活性的新物质，而从土壤中只能分离得到38%的新物质^［5］。因此从植物内生菌中分离得到的天然产物可能是新抗生素的来源。

内生放线菌是植物内生菌的一大类，广泛存在于植物组织内部，对于宿主植物不会引起明显伤害。它们在植物组织内部能促进植物吸收养分，维持植物体内的微生态的平衡。现已发现植物内生放线菌能够产生抗生素、酶类和植物激素等多种生物活性物质，对农药、医药的研制具有重要意义^［6⁃7］，已经成为人们利用的新兴生物资源^［8］。

恰玛古（Qamgur），学名芜菁（Brassica rapa L.），属十字花科（Brassicaceae）芸薹属（Brassica）两年生草本植物，在新疆南北疆均有栽培，其肉质根为主要的食用和药用部分，是新疆少数民族传统的药食两用植物，具有润肺止咳、利尿消肿、润肠通便、抗菌、抗氧化、抗疲劳、降血糖及免疫调节等作用^［9~11］。临床方面，恰玛古的根部提取物已经被制作为“恰玛古胶囊”和“恰玛古蜜膏”，用于辅助治疗肿瘤和干预大肠癌患者后期化疗的疗效^{［12，13］}。目前对恰玛古的研究主要集中在其活性物质的功能方面，而对于恰玛古内生放线菌的研究报道相对较少。

本研究对恰玛古内生放线菌进行分离培养，得到可培养的内生放线菌菌株，对其进行形态学观察，并通过16S rDNA扩增及系统发育分析，确定其分类地位。本文研究新疆药食两用植物恰玛古内生放线菌多样性，以期发现产新活性物质的放线菌或新种放线菌，为研究微生物药物奠定基础。

1 材料和方法

1.1 植物样品

恰玛古植物组织样本（根、茎、叶）于2018年10月15日采集自新疆乌鲁木齐市三坪农场（43°54′58′′N， 87°19′52′′E），于4 ℃环境下保存备用。

1.2 培养基与试剂

高氏一号培养基购自青岛日水生物科技有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司，快速革兰染液购自珠海贝索生物科技有限公司。

1.3 恰玛古样本预处理

将恰玛古的根、茎和叶用流水冲洗干净，晾干。称取各组织部位标本1 g，进行表面消毒灭菌，用无菌水冲洗2次，用滤纸吸干水分后经75%的乙醇浸泡30~60 s，再用2%的次氯酸钠浸泡3 min，最后用无菌水冲洗3~5次，将表面消毒好的标本放入无菌研钵，充分研磨后均匀涂布于培养基上。将最后一次冲洗恰玛古的无菌液体收集涂布，作为对照。

1.4 内生放线菌的分离与纯化

恰玛古样本经表面消毒处理后接种于高氏一号培养基平板，28 ℃培养后观察并记录菌落的形态特征；取少许菌丝经革兰染色后在显镜下观察其特征。挑单个菌落以分区划线法接种于琼脂培养基进行纯化，纯化后接种斜面培养基4 ℃环境下保存备用；同时以20%（V/V）的甘油作为保护剂，将菌株进行保种。

1.5 内生放线菌DNA的制备及16S rRNA基因序列分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，并对其16S rDNA序列进行扩增。扩增引物为细菌通用引物，27F（5’⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3’）和1492R（5’⁃GGTTACCTTGTTACGACTT⁃3’）。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，DNA模板2 μL，灭菌双蒸水 8.5 μL，制成总体积为25 μL的反应体系。PCR反应条件：预变性，温度95 ℃，反应时间为3 min；变性温度95 ℃，反应时间为30 s；55 ℃退火，反应时间为30 s；72 ℃延伸，反应时间为90 s； 设置30个循环；72 ℃延伸，反应时间为10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。将得到的PCR扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

将获得菌株的16S rDNA序列，在NCBI数据库中利用BLAST分析软件进行比对分析，以同源性较高的序列为参考，获得其菌株序列的相似度。选取相似度高的序列，使用MEGA 7.0软件的邻接法（neighbour⁃joining）^［14］。根据N⁃J法聚类，选择1 000个重复，作Bootstrap值的分析，构建系统发育树，以此评价获得恰玛古内生放线菌株的亲缘关系及其分类状况。

2 结 果

2.1 恰玛古内生放线菌的分离与纯化

通过传统分离培养方法共获得恰玛古内生放线菌17株，对其进行形态学的描述，见表1和图1。

2.2 恰玛古内生放线菌16S rRNA基因序列系统分析

分离培养获得17株内生放线菌，与NCBI Blast中已公布的相关菌种之间的相似度均在99.0%~100%之间，分属于4亚目、7科、7属，其中红球菌属（Rhodococcus）1株、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）1株、链霉菌属（Streptomyces）1株、短杆菌属（Brevibacterium）2株、小短杆菌属（Brachybacterium）3株、两面神菌属（Janibacter）3株和微杆菌属（Microbacterium）6株，详见表2和图2。

3 讨 论

植物内生放线菌是内生菌群落组成中的重要部分^［15］。从药用植物中分离得到的内生菌，尤其是内生放线菌，是一个能产生具有多种生物学活性产物的宝库，因此发掘新的放线菌资源，尤其是药用植物的内生放线菌，仍然是研究的热点之一^［16］。多项研究结果均表明，具有极强环境适应性的链霉菌属（Streptomyces）和小单孢菌属（Micromonospora）在各个不同地区的不同植物中均是优势菌群，而且这两个菌属也是土壤放线菌的优势菌属^［17］。Kim等^［18］从11种韩国本土植物分离的内生放线菌中，链霉菌属是优势菌群；此外还有小单孢菌属、微杆菌属、微球菌属和红球菌属。Salam等^［19］从中国江西萍乡和云南西双版纳采摘的龙血树根、茎及叶中共分离得到304株内生放线菌，链霉菌属占86.84%。Shan等^［20］从福建19株茶树样本中分离得到46株内生放线菌，其中链霉菌属占51.1%，还分离出马杜拉放线菌属（Actinomadura）、韩国生工菌属和诺卡菌属（Nocardia）。祁付云等^［21］从新疆酿酒葡萄中分离得到14株内生放线菌，分属于链霉菌属和诺卡氏菌属，其中链霉菌属占78.57%。本实验共分离获得17株内生放线菌，分属于链霉菌属、红球菌属、拟诺卡氏菌属、短杆菌属、小短杆菌属、两面神菌属和微杆菌属等。与其他文献报道不同的是，本实验分离的恰玛古内生放线菌以稀有放线菌数目较多，链霉菌只有1株。王丽^［22］在对福建红树林的研究中用14种选择性分离培养基分离得到诺卡菌属、红球菌属等数个稀有放线菌属，其中2株疑似新种。陈名洪等^［23］从福建红树林分离得到放线菌，其中链孢囊菌亚目中的菌株可能存在新种。本实验从恰玛古中同样分离得到链孢囊亚目中的菌株以及红球菌属的菌株，但未发现新种。用于本实验分离培养的培养基较为单一，因此获得的菌株数量及种类较少。目前已经报道过的植物内生菌的研究表明，植物的根、茎、叶、花及果实等各个部位都可存在内生菌^{［24⁃25］}，而植物内生菌在植物组织各个部位中的分布具有多样性，其中植物根中分布最为广泛，多是由于根是其主要的生活部位^［26］。廖敏等^［27］从四川阿坝地区狼毒中分离到的内生放线菌，在根中分布最多。祁付云等^［21］从新疆酿酒葡萄中分离得到14株内生放线菌，也主要来自根部，约占总数的64.29%。本实验分离得到17株内生放线菌，根中分离得到6株，茎中6株，叶中5株，分布并无明显差异，原因可能是由于培养环境的不同造成的，也可能是本实验研究分离得到的内生菌仅是可分离培养获得的内生菌中的一部分，已有研究已经证实，存在于自然界中的很多微生物还不能通过目前的培养技术获取，因而实验采用的不同的样本处理方法和样本分离培养基能得到的菌种种属的多样性差异较大^［28］。

恰玛古（芜菁）富含的多种营养物质均高于同为根菜类的萝卜，它的多种营养物质为人体所需成分，具有很好的营养价值^［29］。本研究针对新疆特色药食植物恰玛古，利用传统分离培养方法分离获得内生放线菌，分离所得的稀有放线菌较多。用于治疗人类疾病的抗生素，它的产生菌大多数为放线菌，故开发新的放线菌的生物活性，可以为新型药物的研究奠定一定基础，特别是稀有放线菌，而稀有放线菌产生的某些抗菌化合物，早已广泛应用于临床，如红霉素、万古霉素、庆大霉素等^［30］。本研究为进一步筛选多种生物活性及开发利用提供了良好的菌种资源。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017D07C212)