牛磺熊去氧胆酸抑制两种病毒的研究

Study of the inhibitory effect of Tauroursodeoxycholic acid on two kinds of virus

摘要

熊胆汁是自古就被用于消炎祛火的重要中药。牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）为熊胆汁的主要成分，人胆汁中也有低水平的存在。为了探究TUDCA对儿童手足口病重要病原体柯萨奇病毒A16型（coxsackievirus A16， CVA16）是否有抑制作用，在病毒感染不同阶段加入TUDCA处理，通过MTT法、流式细胞术等技术检测CVA16感染的细胞存活率以及TUDCA对人横纹肌肉瘤细胞（rhabdomyosarcoma cell，RD）内吞效率的影响。结果发现，TUDCA在病毒吸附进入阶段抑制CVA16感染细胞，但不影响宿主细胞的内吞活性。研究还发现TUDCA能在病毒入侵阶段抑制水泡口炎疱疹病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的感染，这提示TUDCA的抗病毒作用不具有特异性。本研究发现了TUDCA抑制CVA16和VSV病毒感染这一新用途，为抗手足口病和口炎疱疹药物的研发提供了新的思路和方案。

Abstract

Bear bile has been used as an important traditional Chinese medicine to eliminate inflammation and fire since ancient times. Tauroursodeoxycholic acid （TUDCA） is the main bile acid of bear bile， and also present at low levels in human bile. To investigate whether TUDCA has an inhibitory effect on coxsackievirus A16（CVA16）， an important pathogen of children’s hand， foot and mouth disease （HFMD）， MTT method， flow cytometry and other methods were used to detect the cell survival rate of CVA16 infection under TUDCA treatment at different stages of virus infection and the effect of TUDCA on the endocytosis efficiency of RD cells. In this study， it was found that TUDCA inhibited the infection of CVA16 at the stage of virus adsorption， but did not affect the endocytosis activity of host cells. TUDCA can also inhibit the infection of vesicular stomatitis virus （VSV） in the stage of virus invasion， which suggests that TUDCA has no specific antiviral effect. The study demonstrates a new use for TUDCA to inhibit infection of HFMD virus and VSV， and provides a new way of thinking and approach for developing drugs against HFMD and VSV.

Graphical abstract

关键词

柯萨奇病毒A16 / 水泡口炎疱疹病毒 / 牛磺熊去氧胆酸 / 抗病毒药物

Key words

CVA16 / VSV / TUDCA / antiviral drug

0 引 言

中医自古就将熊胆视为药之瑰宝，拥有几千年的用药历史。《本草纲目》记载： 熊胆“退热清心，平肝明目去翳，杀蛔、蛲虫”。牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）于1902年在熊胆中发现，为熊胆的主要胆汁酸，人体胆汁中也有低水平的存在。TUDCA化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰⁃N⁃牛磺酸，是由熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的一种亲水性胆盐，可与暴露于溶剂中的蛋白质疏水片段结合，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用^［1］。意大利贝思迪大药厂研制的滔罗特（taurolite），1991年首次在意大利上市，2007年获准在中国销售，临床上主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎，且无明显的不良反应。

TUDCA的药理研究十分广泛，不仅限于在胆石溶解、原发性胆汁性肝硬化、糖尿病等代谢性疾病中的作用^［2~6］，还在抗细胞调亡、抗病毒等领域发挥重要作用。研究表明TUDCA起一种分子伴侣的作用，可缓解细胞内质网应激反应^［7］。还有关于TUDCA改善内质网应激来抑制细胞调亡的报道^［8，9］。TUDCA还被报道具有抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus， HDV）病毒和甲型流感病毒（influenza A virus， IAV）的作用^［10~12］。

手足口病（hand， foot and mouth disease， HFMD）是一种常发于5岁以下儿童的病毒性传染病。手足口病的常见症状是发热和手足口疱疹，也有可能导致无菌性脑炎、肺水肿，甚至死亡^［13］。肠道病毒71（enterovirus 71， EV71）和柯萨奇病毒A16（coxsackievirus A16， CVA16）是引起手足口病的两种最常见病原体，它们都是正链RNA病毒。由于EV71疫苗的应用，现在中国出现的HFMD病类中，由CVA16感染的比例显著升高^{［14，15］}，目前还没有针对CVA16的有效抗病毒治疗药物或疫苗。因此，急需开发特定抗CVA16病毒药物。

许多天然产物如类黄酮、皂苷等都被证明具有抗病毒活性，植物类黄酮物质槲皮素可抑制包括EV71在内的多种病毒感染^{［16，17］}。我们的研究发现TUDCA可以在病毒入侵阶段抑制柯萨奇病毒A16和口炎疱疹病毒VSV对细胞的感染，为抗手足口病和口炎疱疹药物研究提供了新的思路和方案。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞

病毒CVA16、非洲绿猴肾细胞（Vero）、人横纹肌肉瘤细胞（rhabdomyosarcoma cell，RD）均来源于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；口炎疱疹病毒VSV⁃GFP和人肾上皮细胞系（293T）细胞来源于武汉大学病毒学国家重点实验室。

1.2 试剂

TUDCA，兔源EGFP一抗、酪氨酸磷脂酶抑制剂、丝/苏氨酸磷脂酶抑制剂、蛋白酶抑制剂来自西格玛奥德里奇公司；细胞培养基DMEM、胎牛血清FBS、胰酶、pHrodoTM内吞活性检测试剂盒，牛血清白蛋白BSA、ECL免疫反应条带检测试剂来自赛默飞世尔公司；青霉素⁃链霉素双抗，思拓凡公司；兔源EV71⁃VP1一抗来自亚诺法生技股份有限公司；鼠源EV71⁃3D一抗，GeneTex；兔源一抗β⁃Actin来自爱博泰克生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠/兔IgG，Jackson Imol/Luno Research；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒来自碧云天生物技术有限公司。

1.3 仪器

大型冷冻离心机（Eppendorf）；小型旋转混合仪（上海新芝）；生物安全柜（ESCO）；流式细胞仪（Beckman）；倒置荧光显微镜（宁波舜宇仪器）；酶标仪（Bio⁃Tek）。

1.4 细胞毒性测定

实验中设置TUDCA组、二甲基亚砜（DMSO）组及空白对照组。将RD细胞接种于96孔板中，接种密度为每孔1×10⁴个。当细胞生长至大约80%，分别用终浓度为1 mol/L的TUDCA处理每个孔中的RD细胞，以相同浓度的DMSO作为阴性对照，不加任何药物处理的细胞组作为空白对照组。药物处理16 h后，向每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT溶液，37 ℃孵育4 h。再向每孔加入100 μL甲瓒溶解液，轻轻混匀，37 ℃孵育4~5 h，直到在显微镜下观察发现甲瓒全部溶解，培养液中无紫色晶体沉淀。然后在570 nm下测定吸光度，记录结果。使用以下公式计算细胞存活率：

细胞存活率（%）=（实验组的吸光度-空白组吸光度）／（对照组的吸光度-空白组的吸光度）×100%。

1.5 TUDCA对CVA16感染效果的抑制实验

为了探究TUDCA是否具有抗CVA16感染的作用。实验设置A、B、C三组。在预处理阶段：提前2 h用含10% FBS的DMEM培养基处理A、B两组、用浓度为1 mol/L的含10% FBS的加药DMEM培养基处理细胞。在感染阶段：将细胞培养板中的培养基吸弃，PBS润洗2次，用感染复数（multiplicity of infection，MOI）=1的CVA16病毒液与等体积的DMEM培养基的预混液感染B组细胞2 h，用CVA16病毒液和TUDCA的预混液感染C组细胞2 h。用DMEM培养基处理A组细胞。在感染后阶段：弃去细胞培养板中的感染液，PBS润洗2次，A、B组换至2%新鲜培养基，C组换至加药2%新鲜培养基。37 ℃培养48 h后分别用MTT检测细胞活性。

1.6 TUDCA对CVA16感染细胞的保护实验

病毒感染分为胞外吸附进入和胞内复制组装等阶段，为了进一步探究TUDCA对CVA16感染的宿主细胞的保护作用发生在病毒感染的哪个阶段，我们分不同感染时间阶段用TUDCA处理Vero细胞和RD细胞，即感染前阶段：-2~0 hpi；病毒吸附进入阶段：0~2 hpi；胞内病毒复制组装阶段：2~48 hpi。48 h后用MTT法检测细胞的存活率。

1.7 TUDCA对细胞内吞活性的影响

0~2 hpi是病毒吸附进入细胞阶段，我们用可检测细胞内吞作用的荧光探针pHrodo^TM 来检测TUDCA是否通过影响宿主细胞的内吞作用抑制CVA16在0~2 hpi阶段入侵细胞。pHrodo^TM 染料进入细胞的过程与与病毒进入宿主细胞相似，因此被当作是内吞过程的特异性标记物。pHrodo^TM对pH敏感，在 pH 值中性条件下不发荧光，在酸性条件下发绿色荧光。细胞内涵体pH呈酸性，所以进入内涵体中的pHrodo^TM会发绿色荧光，因此，可根据pHrodo^TM荧光强度判断细胞的内吞活性。实验设置了阴性对照组、TUDCA组。将RD细胞以每毫升2×10⁵个细胞均匀地铺在24孔板上，待细胞密度达到80%时，TUDCA组用CVA16病毒和1 mol/L的TUDCA的预混液感染RD细胞，阴性对照组用CVA16病毒和DMSO的预混液处理细胞。再分别加入40 g/mL浓度的pHrodo^TM指示剂，置于37 ℃、5%CO₂培养箱中分别孵育20 min和60 min。分别在20 min和60 min 通过流式细胞分析仪检测RD细胞对pHrodoTM的内吞活性。

1.8 TUDCA对VSV⁃GFP感染效果的影响

为了验证TUDCA对CVA16感染的抑制作用是否具有特异性，我们用实验室保存的另一种RNA病毒即水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）来验证TUDCA是否也对其有抑制感染作用。VSV属于水泡病毒，为负链RNA病毒，可感染马、牛、猪等多种动物以及人类，VSV具有嗜上皮性，易引起皮肤出现水疱疹症状，人感染后还会出现流感样症状如冷颤、肌痛、咽炎等。本实验使用的水泡口炎病毒为基因中插入GFP序列得到的VSV⁃GFP重组病毒株，VSV⁃GFP在感染宿主细胞后会产生绿色荧光。

用MOI=1的VSV⁃GFP感染293T细胞，分别在病毒感染的3个阶段加入终浓度为1mol/L的TUDCA处理，用DMSO作阴性对照，不加病毒作为空白对照。在普通荧光显微镜下能观察到明显绿色荧光后进行流式分析。

2 结果与分析

2.1 TUDCA对细胞毒性的影响

与空白对照组相比，TUDCA处理后细胞存活率略有提高，见图1，显示TUDCA对RD细胞无毒性。

2.2 TUDCA对CVA16感染细胞的保护实验

与细胞存活率为50.6%的阴性对照B组相比，TUDCA处理组显著地提高了被CVA16病毒感染的Vero细胞的存活率（存活率为107.5%），即TUDCA对病毒感染的细胞产生了显著的保护作用，推测TUDCA的这种保护作用可能是由于它抑制了病毒感染所致（图2）。

2.3 TUDCA对CVA16感染不同时间阶段的影响

结果见图3，与没有添加TUDCA处理的阴性对照组（细胞存活率分别为48.9%和50.9%）相比，-2~0 hpi组TUDCA对于随后被CVA16感染的细胞并不产生保护作用，细胞存活率为36.8%和42.8%；而在0~2 hpi组TUDCA对Vero和RD细胞产生最大的保护效果（细胞存活率分别为74.2%和83.7%）。TUDCA在CVA16进入细胞后的复制组装阶段即2~48 hpi组也发挥了细胞保护作用。因此TUDCA对于CVA16感染的宿主细胞所起的保护作用不是由它对宿主细胞的作用而引起的；此保护作用发生在病毒感染阶段（0~48 hpi），即胞外吸附进入和胞内复制组装等阶段。

2.4 TUDCA对细胞内吞活性的影响

结果见图4，加入TUDCA不仅没有降低RD细胞的内吞作用，反而还表现出一定的促进细胞内吞作用。在20 min时，TUDCA组细胞对pHrodoTM的内吞率为24.7%，而对照组为18.3%；在60 min时，TUDCA组细胞对pHrodoTM的内吞率为54.2%，而对照组为39.9%。因此，图3所示的TUDCA在0~2 hpi时间段对病毒的抑制作用不是由于TUDCA影响宿主细胞的內吞功能引起的。

2.5 TUDCA对VSV⁃GFP复制的抑制作用及发生阶段

感染了VSV⁃GFP的293T细胞中可观察到绿色荧光（图5）。从图6可知，在不加TUDCA处理的阴性对照中（DMSO组），VSV⁃GFP感染293T细胞48 h后约有72%的细胞受到感染。在-2~48 hpi和0~2 hpi添加TUDCA处理都能显著抑制VSV⁃GFP的感染作用（仅有0.39%和0.30%的细胞受到感染），而在病毒感染前2 h加TUDCA处理细胞不能抑制VSV⁃GFP感染，反而病毒复制略微增强（77.6%的细胞有绿色荧光产生），这说明TUDCA对于VSV⁃GFP感染的293T细胞的保护作用发生在病毒吸附侵入阶段。在病毒感染后（2~48 hpi组）用TUDCA处理也具有轻微抑制VSV⁃GFP感染作用（只有10.6%的细胞受到感染而有绿色荧光产生）。

3 讨 论

实验结果显示，TUDCA能够抑制CVA16感染细胞，显著提高受CVA16感染细胞的存活率（从50.6%提高到107.5%）。用TUDCA在CVA16感染的不同时间阶段处理Vero或者RD细胞，发现TUDCA的抑制作用主要发生在病毒吸附进入阶段（细胞存活率为74.2%和83.7%），而在病毒感染之前2 h预处理宿主细胞不影响病毒对细胞的感染（细胞存活率为36.8%和42.8%）。大多数病毒利用宿主细胞的内吞作用进入细胞。本研究用pHrodoTM指示剂检测TUDCA处理是否通过影响细胞的内吞活性，从而抑制病毒的入侵，结果显示TUDCA处理细胞不仅没有抑制细胞的内吞效率，还一定程度上促进了细胞的内吞效率，这说明TUDCA不是通过抑制细胞内吞而阻止病毒入侵细胞的。我们还发现TUDCA还可以在病毒入侵阶段抑制水泡口炎病毒对细胞的感染，这提示TUDCA可能具有广谱抗病毒的作用。TUDCA可能主要通过作用于病毒粒子、影响病毒吸附而非在病毒进入阶段影响细胞内吞作用来抑制CVA16的感染性。此外，TUDCA在病毒进入细胞之后（>2 hpi）的处理也能抑制病毒感染，其具体分子机制尚有待研究。

关于抗CVA16的抗病毒药物研究并不多。近年，鉴定出一种小分子药物单宁酸（chebulagic acid，CHLA）通过与CVA16衣壳蛋白结合，从而在CVA16入侵阶段抑制其对RD细胞的感染^［18］。CVA16病毒粒子表面有一个凹陷，又称“峡谷”，其负责受体的结合，在“峡谷”底部是VP1衣壳蛋白内的一个疏水囊，它可以结合天然脂质，而CVA16与受体结合过程中脂肪酸分子的排出是病毒粒子衣壳构象改变的前提^［19］。TUDCA是一种双亲性分子，具有分子伴侣的作用，可与蛋白的亲水端结合^［20］。我们推测，TUDCA也可能通过与病毒衣服蛋白的结合而改变了衣壳蛋白的构象，进而影响病毒的吸附和进入细胞。但这需要进一步通过质谱、低温电子显微镜分析等方法来详细确认TUDCA对病毒结构的影响。

熊胆位列中国四大动物药材之首，被誉为“药中黄金”，拥有几千年用药历史。TUDCA作为熊胆汁的主要功能成分，现在已经人工合成并作为一种药物早已上市投入临床使用，其安全性和稳定性能得到保证，这非常有利于开展后续TUDCA在体内抗病毒效果研究。本研究发现了TUDCA能抑制CVA16和VSV⁃GFP病毒复制这一新用途，同时也为抗手足口病和口炎疱疹药物研究提供了新的思路和方案。

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基金资助

国家自然科学基金(31070147)