僵蚕药材酸溶性蛋白质的分离提取及鉴定

Isolation and identification of acid⁃soluble proteins of Bombyx Batryticatus

摘要

以Box⁃Behnken组合设计进行僵蚕药材酸法提取工艺的响应面优化，并对提取物中蛋白质进行定性定量分析。结果表明：酸法工艺获取僵蚕蛋白质的最佳条件为提取温度31.8 ℃、提取时间3.0 h、液料比49.6∶1（V∶m）、醋酸钠缓冲液浓度0.12 mol/L，此时蛋白质提取率为5.34%。十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE）指纹图谱结果表明，僵蚕酸溶性蛋白质主要分布于26 390~31 570和59 130~81 790区间，其中31 570与27 870蛋白约占总蛋白的59.9%，71 700与81 790蛋白约占总蛋白的24.3%。傅里叶变换红外吸收光谱（FTIR）结果表明，僵蚕酸溶性蛋白质具有特征性指纹图谱。上述结果有望用做僵蚕药材分子鉴定的依据，有助于僵蚕资源的开发利用。

Abstract

The response surface method of Box⁃Behnken design was used to optimize the acid extraction process of proteins from Bombyx Batryticatus extract， and the corresponding protein fingerprint was established. The results showed that the best extraction conditions were as follows： the extraction temperature at 31.8 ℃， the extraction time 3.0 h， the liquid⁃to⁃material ratio at 49.6∶1（V∶m）， and the sodium acetate buffer concentration 0.12 M. Under these conditions， the protein extraction rate was 5.34%. SDS⁃PAGE fingerprint results showed that the acid⁃soluble proteins of the Bombyx Batryticatus were mainly distributed in the 26 390~31 570 and 59 130~81 790 intervals， of which 31 570 and 27 870 accounted for about 59.9% of the total proteins， and 71 700 and 81 790 proteins accounted for about 24.3%. The results of FTIR showed that the acid⁃soluble proteins of the Bombyx Batryticatus had a characteristic fingerprint. The above results are expected to be used as the basis for the development of the resources and the molecular identification of Bombyx Batryticatus medicinal materials.

Graphical abstract

关键词

僵蚕蛋白质 / 酸法提取 / 响应面法 / 指纹图谱

Key words

Bombyx Batryticatus protein / acid extraction / response surface method / fingerprint

0 引 言

僵蚕（Bombyx Batryticatus）为我国常用的大宗动物类中药材，具有息风止痉，祛风止痛，化痰散结的功效，可用于抽动障碍、支气管哮喘、顽固性蛋白尿及多种儿科疾病的临床治疗，且疗效甚佳^［1，2］。当前僵蚕资源主要来源于桑蚕养殖过程中蚕蛹感染白僵菌后致死得到的干燥体，四川、云南、广西、江浙等蚕桑产业区每年均有大量出产。此外，陕西及河北等有桑无蚕地区也有人工感染法生产僵蚕的报道。因成本、质量及三费处理等诸多因素的制约，我国比较丰富的僵蚕资源主要被用于临床治疗，未能得到进一步的充分开发及利用。现代药理学研究表明，僵蚕还具有抗惊厥、抗凝血、降糖降脂、抗肿瘤、抗菌、镇静催眠等诸多药理作用^［3］，具有较高开发价值。

虽然已知僵蚕含有蛋白质、多肽、氨基酸、核苷、挥发油等多种成分，还有甾体类、脂肪酸类、黄烷类、香豆素类及杂环类化合物^［4~11］，但是由于各版《中国药典》中均未明确记载其药效活性成分，当前药材市场仍主要依其“身直、肥壮、质坚、色白、断面光亮”程度进行真伪鉴别及等级划分。此外，目前尚有依据红外指纹图谱及依据DNA条形码鉴定僵蚕的研究报道^{［12，13］}，但僵蚕蛋白质占其总重的67.44%，却长期鲜被关注，迄今未见相应提取工艺优化及特征种属蛋白质研究的报道。

蛋白质为一切生命体的重要组成部分，在几乎所有生命过程中都起着关键作用。稀盐缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，为最常用的提取溶剂，偏酸性或偏碱性提取液则可分别用于酸溶性或碱溶性蛋白质的提取。本文旨在研究僵蚕药材蛋白质的酸法提取工艺，并以Design⁃Expert软件进行响应面优化，同时对其中的蛋白质进行定性定量分析，为后续建立相应分子鉴定技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料

僵蚕样品购自荷花池、亳州、安国及玉林中药材市场，经江苏大学欧阳臻教授鉴定为蚕蛾科昆虫家蚕（Bombyx mori Linnaeus） 4~5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌〔Beauveria bassiana （Bals.）Vuillant〕而致死的干燥体。

1.2 试剂

牛血清白蛋白（BSA）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、三羟甲基氨基甲烷、N⁃［三（羟甲基）甲基］甘氨酸（生工生物工程（上海）股份有限公司），TEMED、溴酚蓝（AMRESCO公司）；甘油（浙江遂昌甘油厂）；β⁃巯基乙醇（BIO BASIC INC公司）；冰醋酸、三氯乙酸、丙烯酰胺、过硫酸铵（AP）、甘氨酸、考马斯亮蓝G⁃250等试剂（国药集团有限公司）。

1.3 仪器

TE601⁃L型电子天平（Sartorius公司），SpectraMax 190型酶标仪（Molecular Devices公司），Thermo Micro Pico 17型微量台式离心机（Thermo Scientific公司），DYY⁃6C型稳压稳流电泳仪（南京驰顺科技发展有限公司），Mini⁃Protean 3型电泳槽（Bio⁃Rad公司），Alpha 1⁃2 LD型冷冻干燥机（Marin Christ公司），Avatar⁃370型傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet公司）。

1.4 方法

1.4.1 僵蚕酸溶性蛋白质提取

僵蚕打粉后过70目筛，称取适量，以pH 4.3的醋酸钠缓冲液水浴振荡浸提蛋白质，12 000 r/min离心10 min，收集上清液备用。

1.4.2 蛋白质提取率测定

按标准方案以Bradford法测定蛋白质含量^［14］，以BSA为标准品，绘制得标准曲线方程： Y=4.932 9X+0.398 9 （R²=0.995 2） ，式中：Y为595 nm下测得的体系吸光度；X为蛋白质质量浓度（mg/mL）。

分别取僵蚕酸溶性蛋白质样品200 μL置于A、B管中，A管中加入20 μL三氯乙酸（TCA）后于12 000 r/min离心10 min，上清置于C管。595 nm下测定B、C管样品吸光度，以标准曲线计算蛋白质含量，并以下述公式计算蛋白质提取率。

\mathrm{僵蚕}\mathrm{酸溶}\mathrm{蛋白}\mathrm{质提}\mathrm{取率}=\frac{G_{\mathrm{B}}-G_{\mathrm{C}}}{G_{\mathrm{总}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：G_B为B管蛋白质质量；G_C为C管蛋白质质量；G_总为僵蚕粉末质量。

1.4.3 单因素试验

在预实验基础上选取提取时间、液料比、缓冲液浓度、提取温度进行单因素试验，分别测定其对僵蚕酸溶蛋白质提取率的影响，确定最佳因素水平。试验中固定其他三个因素条件，依次分别以提取时间2、3、4、5、6 h、液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1（V∶m）、缓冲液浓度0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mol/L和提取温度25、35、45、55、65 ℃为单因素变量，采取渐变式优化法以确定响应曲面的最优因素水平。

1.4.4 响应面试验设计

在单因素实验的基础上，采用Design⁃Expert 8.0.6中的Box⁃Behnken响应面法优化提取条件。设置液料比、醋酸钠缓冲液浓度、提取时间、提取温度为自变量，僵蚕蛋白质提取率为响应值，设计四因素三水平响应面试验，因素水平编码表如表1。

1.4.5 十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE）

蛋白质样品溶液经TCA及丙酮处理后离心，沉淀中加入适量ddH₂O和等体积的2×上样缓冲液，沸水浴10 min后获得电泳样品。常规方法制备12%分离胶及5%浓缩胶，SDS⁃PAGE分析电泳样品，至溴酚蓝前沿到合适位置后停止电泳，剥离凝胶进行染色及脱色处理。待凝胶脱色至背景无色时用凝胶成像系统获取图像，用Quantity One软件进行蛋白质分子量及含量分析。

1.4.6 傅立叶变换红外光谱（FTIR）检测

蛋白质样品溶液冷冻干燥后加适量KBr研磨混合，压片后以Avatar⁃370型傅立叶变换红外光谱仪于4 000~400 cm^-1波数范围下扫描，获得红外光谱图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

延长提取时间有利于溶出更多蛋白质。首先固定提取温度为45 ℃、液料比50∶1 （V∶m）、醋酸钠缓冲液浓度0.1 mol/L，考察提取时间对僵蚕酸溶性蛋白质提取率的影响。结果如图1a所示，提取时间小于3 h时，蛋白质提取率随时间延长呈上升趋势。当提取时间超过3 h后，蛋白质的提取率呈明显下降趋势。因此，最佳提取时间应取3 h。

缓冲液体积越大越有利于蛋白质提取，但过高的液料比会导致后处理较为困难。固定提取时间3 h、提取温度45 ℃、醋酸钠缓冲液浓度0.1 mol/L，考察液料比对僵蚕酸溶性蛋白质提取率的影响。结果如图1b所示，随着液料比的增加，酸溶蛋白质的提取率呈显著上升，后趋于平稳，至液料比为50∶1时，提取率变化趋于平缓，因此，50∶1（V∶m）为最佳液料比。

蛋白质为兼性分子，缓冲液浓度可以显著影响其溶解度。固定提取时间3 h、液料比50∶1（V∶m）、提取温度45 ℃，醋酸钠缓冲液浓度分别取0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mol/L，考察不同提取浓度对提取率的影响。结果如图1c所示，缓冲液浓度不超过0.12 mol/L时，提取率随缓冲液浓度增加而呈上升趋势，但是过高的缓冲液浓度（大于0.12 mol/L）会导致提取率明显下降，因此最适缓冲液浓度为0.12 mol/L。

提取温度升高有利于分子热运动，可以加速蛋白质溶出，且增加其溶出量。固定提取时间3 h、液料比50∶1（V∶m）、醋酸钠缓冲液浓度0.12 mol/L，考察提取温度分别为25、35、45、55、65 ℃时对蛋白质提取率的影响。结果如图1d所示，提取温度小于35 ℃时，蛋白质提取率较高，当提取温度超过35 ℃，蛋白质可能因热变性而导致提取率降低，因此最适提取温度为35 ℃。

2.2 响应面试验

2.2.1 试验结果及方差分析

根据单因素试验结果，以温度A、时间B、液料比C、浓度D为自变量，提取率为响应值，利用Box⁃Benhnken响应面分析法设计四因素三水平试验，结果见表2，方差分析结果见表3。蛋白质提取的回归方程（R1）如下： R\mathrm{1}=\mathrm{5.31}-\mathrm{0.12}A+\mathrm{0.056}B-\mathrm{0.12}C+\mathrm{0.12}D+\mathrm{0.023}AB-\mathrm{0.23}AC-\mathrm{0.054}AD+\mathrm{0.050}BC+\mathrm{0.030}BD-\mathrm{0.22}CD-\mathrm{0.18}{A}^{\mathrm{2}}-\mathrm{0.54}{B}^{\mathrm{2}}-\mathrm{0.95}{C}^{\mathrm{2}}-\mathrm{0.45}{D}^{\mathrm{2}}。

如表3所示，此模型极显著（P<0.000 1）。该回归模型的确定系数为R²=0.914 5，意味着91.45%的变化可用拟合模型来解释，校正系数R²_adj=0.829 0，失拟项P=0.870 3>0.05，不显著，说明回归方程拟合程度良好，可用于僵蚕酸溶蛋白质提取率的理论预测。通过数据可以看出，2次项B²、C²、D²对响应值的影响极显著，其余各项不显著。根据表3得四个因素对提取率的影响程度依次为：C>D>A>B，即液料比>浓度>温度>时间。

2.2.2 等高线分析及验证实验

僵蚕酸溶蛋白质提取的响应面及等高线分析见图2。各因素之间的交互作用对僵蚕酸溶蛋白质提取率的影响可以通过响应面及等高线反映出来。曲线的上升趋势越陡峭，说明该因素对蛋白质提取率的影响越大；曲线的上升越平稳，表明该因素对蛋白质提取率的影响较小。由图可得出，各因素之间的交互作用对僵蚕酸溶蛋白质提取率均有显著影响。对提取率影响最大的因素为液料比，其次为浓度、温度和时间，结果与表3回归分析中的一致。按上述最佳提取条件进行3次重复实验，僵蚕酸溶蛋白质的平均提取率为5.32%，与预测值5.34%十分相近，说明回归模型可靠。

2.3 僵蚕酸溶蛋白质的SDS⁃PAGE指纹图谱

按上述优化条件提取的僵蚕酸溶蛋白质按1.4.5所述方法进行SDS⁃PAGE指纹图谱分析，结果如图3所示。僵蚕酸溶蛋白质分子量主要集中于26 390~31 570和59 130~81 790区间，其中31 570与27 870蛋白质含量最高，约占总蛋白的59.9%，71 700与81 790KDa蛋白质含量约占总蛋白的24.3%。此外，在分子量31 570~71 700范围内还有7条含量较少的蛋白质条带（图3），为僵蚕分子鉴定提供了丰富的指纹信息。

2.4 僵蚕酸溶蛋白质的FTIR指纹图谱分析

对僵蚕酸溶蛋白质按1.4.6所述进行FTIR指纹图谱检测，结果如图4所示，样品在3 349.36，

2 360.63，1 647.26，1 569.25，1 410.70，1 322.31，1 082.58，776.15，669.00 cm^-1处有明显吸收峰，峰型优于直接以僵蚕粉末进行FTIR检测结果^［12］。

3 讨论与结论

僵蚕为一种富含蛋白质的动物类中药材，但其蛋白质资源开发及应用长期未受重视。本研究以提取时间、液料比、缓冲液浓度、提取温度为考察因素，并以响应面法优化僵蚕药材酸法提取工艺，并对其中酸溶蛋白质进行定性定量分析，确定如下最佳提取条件：提取温度31.8 ℃、提取时间3.0 h、液料比49.6∶1 （V∶m）、醋酸⁃醋酸钠缓冲液浓度0.12 mol/L，此时蛋白质提取率为5.34%，为后续资源的开发应用创造了前提条件。

蛋白质指纹图谱技术可以较为全面地反映复杂体系中所含蛋白质成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。高效液相色谱法具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点，例如梁政洋等^［15］及雷颖颖等^［16］建立了水牛乳及羊奶粉的蛋白质RP⁃HPLC指纹图谱并对其进行质量评价。SDS⁃PAGE具有化学性质稳定、凝胶强度好、样品用量少、分辨率高等优点，也已逐步用于人参、厚朴、芸豆及其他植物源性食品中蛋白质指纹图谱的建立^［17~20］。本研究建立了僵蚕酸溶蛋白质的SDS⁃PAGE指纹图谱及FTIR指纹图谱，提供了僵蚕蛋白质分子鉴定较丰富的指纹信息，具有方法简便、条带清晰、特征峰明显的优点，为建立相应分子鉴定方法提供了理论依据，有助于僵蚕生物资源的开发利用。

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基金资助

江苏省镇江市重点研发计划（社会发展）项目(SH2018023)

江苏省大学生实践创新训练计划项目(201910299052Z)

亳州学院院内科研项目(BYZ2018B02)