富硒产品中硒的形态分析及化学评分模式的建立

Speciation analysis of selenium in selenium⁃enriched products and establishment of chemical scoring model

摘要

采用微波水解、HPLC⁃HG⁃AFS法测定了硒蛋白粉、硒蛋白片、肽粉、富硒原料等19种硒产品中的总硒、硒代氨基酸和亚硒酸根离子［Se（IV）］，分析了硒代氨基酸、Se（IV）和其他形态硒占总硒的百分比及不同形态硒代氨基酸的组成比例。以此为依据，将硒产品分为硒蛋白型、单一硒代氨基酸型、其它形态硒型及有机无机硒混合型。根据DBS42/002⁃2014规定建立了富有机硒产品评分模式，其中18种为富有机硒产品；根据适硒地区母乳中硒代氨基酸的组成比例提出了硒代氨基酸的化学评分模式，评分结果显示13种以蛋白态硒为主的硒产品中硒代氨基酸的组成比例均与母乳相差甚远，不利于人体平衡吸收利用，其中10种SeMet含量远远超过人体所需，SeCys₂为限制硒代氨基酸。该评分模式的建立对硒产品的开发具有指导意义。

Abstract

Se⁃substituted amino acids， selenite ions ［Se（IV）］ and other forms of selenium in 19 selenium products including selenium protein powder， selenoprotein tablets， peptide powder and selenium⁃rich raw materials were determined by microwave hydrolysis⁃HPLC⁃HG⁃AFS method. As a percentage of total selenium， selenium in protein， Se（IV） and other forms and the percentage of selenium amino acids in different structures were analyzed. On this basis， selenium products can be divided into selenoproteins， selenopamino acid， selenium forms and mixed selenium in organic and inorganic forms. Chemical scoring model was established on the basis of the regulation of DBS42/002⁃2014， the result showed that 18 of 19 selenium products are rich organic selenium products. According to the proportion of seleno⁃amino acids in breast milk in suitable selenium area， the chemical grading standard of seleno⁃amino acids was proposed. Based on this standard， among the 13 selenoprotein⁃based selenium products， the selenoamino acid， SeCys₂， is the limiting amino acid， and the SeMet was far more than that human need. In composition ratio， all seleno⁃amino acids are quite different from that of human milk， and are not conducive to the balanced absorption and utilization of human body. The establishment of the scoring model has a guiding effect in the development and evaluation of selenium products.

Graphical abstract

关键词

富硒产品 / 硒形态分析 / 硒代氨基酸 / 化学评分模式

Key words

selenium products / speciation analysis of selenium / seleno amino acid / chemical scoring model

0 引 言

硒是人体必需的微量元素之一，对维护人体健康起着重要作用，如果人体血液内硒含量长期低于0.1 mg/kg，就有可能引起肝坏死、心肌损害、癌症、关节炎等疾病。作为一种多功能的生命营养素，硒具有清除自由基、抗氧化、增强免疫功能、防治癌症等保健作用^［1］，因其独特的预防、治疗及保健功能，被誉为“生命的奇效元素”。

硒在自然界中存在的形态分为无机态和有机态，其中无机态能够被人和动物吸收利用的是亚硒酸根离子［Se（IV）］、硒酸根离子［Se（VI）］和纳米硒（Se⁰），有机态以硒蛋白、硒多糖、硒代氨基酸等形式存在。有机硒毒性小，适宜摄入量范围较宽，对人体补硒较安全，但目前的国家标准中只规定了总硒的测定方法^［2］，不能区分有机硒和无机硒，更不能区分各种硒的形态，难以准确评价富硒产品的补硒功效。

硒蛋白是生物有机硒的主要存在形式之一，主要含硒代半胱氨酸（SeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet），可从富硒酵母或富含蛋白的高聚硒植物中提取，作为食品、保健品、化妆品的原料。由于硒蛋白是一种新型食品添加剂，常规氨基酸评分方法中没有涉及到硒代氨基酸，因此无法评价其补硒功效^［3］。硒代氨基酸的检测方法研究报道虽然较多^［4~10］，但由于提取方法不完善，现形成的标准中仅能测定硒代蛋氨酸^［11］，难以对硒产品补硒功效进行合理的评价。为此，我们开发了微波水解、HPLC⁃HG⁃AFS法测定富硒产品中硒形态^［12］，将富硒产品中的硒分为蛋白态硒、Se（IV）和其它形态硒，分析各种形态硒的含量占总硒的比例作为富有机硒产品化学评分的依据；分析各种硒代氨基酸占蛋白态硒的比例，根据适硒地区母乳中硒代氨基酸的比例，建立富硒产品中硒代氨基酸的化学评分模式，为科学开发富硒产品提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究选取了19种硒产品，其中硒蛋白粉、马铃薯蛋白、绿豆蛋白、碎米荠蛋白、碎米荠、肽粉、西兰花、硒多糖、青钱柳提取物等来自恩施清江生物工程有限公司；硒酵母来自安琪酵母有限公司；植物硒精华片来自恩施硒谷科技有限公司；硒萃、硒蛋白片来自南京盛硒生物科技发展有限公司旗下企业；硒蛹虫草压片糖果来自湖北珍硒堂生态农业发展有限公司；硒都麦草来自恩施超植生物科技有限公司（表1）。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器

高效液相色谱⁃原子荧光联用仪：Waters2695分离单元（美国）+SAP⁃10形态预处理装置+AFS⁃930d原子荧光光谱仪（北京吉天仪器公司），带阴离子交换柱和硒空心阴极灯；微波蛋白水解仪（意大利Milestone Ethos UP）；分析天平：感量0.01 g、0.000 1 g（赛多利斯）；pH计（METTLER TOLEDO）。

1.2.2 试剂

甲酸、氢氧化钾、氢氧化钠、碘化钾、硼氢化钾、磷酸氢二铵、盐酸（优级纯）；硒代胱氨酸（SeCys₂）标准溶液（GBW10087）、甲基⁃硒代半胱氨酸（SeMeCys）标准溶液（GBW10088）、硒代蛋氨酸（SeMet）标准溶液（GBW10034）、亚硒酸根离子［（Se（IV）］标准溶液（GBW 10032）。

1.3 总硒的测定

采用氢化物原子荧光光谱法^［2］。

1.4 硒代氨基酸和Se（IV）的测定

称取富硒产品20 mg（精确到0.1 mg），放入微波蛋白水解仪配套的石英插杯内，加入6 mol/L盐酸溶液1.0 mL，将插杯对称插到样品支架上，在水解内罐中加入6 mol/L盐酸溶液120~150 mL，放入样品支架，将内罐放入外罐，安装好温度传感器和蛋白质水解转子；打开仪器顶部的抽真空流路，抽真空2~3 min后关闭，再打开氮气流路，充氮气（0.2~0.3 MPa） 1~2 min，如此反复3次。设置功率1 500 W，运行程序升温：15 min升温至150 ℃，保持40 min，降温到50 ℃左右，将插杯内样品溶液转移到25 mL小烧杯中，加入0.95 mL 6 mol/L 氢氧化钠溶液，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.5，转入25 mL容量瓶中，用水定容，混匀后，用0.45 µm针筒式过滤器（水系）过滤，收集滤液，采用HPLC⁃HG⁃AFS法测定。同时做空白实验。

1.5 仪器条件

HPLC色谱分离条件：XP阴离子交换柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5μm ），流动相为40 mM （NH₄）₂HPO₄，甲酸调节pH=6.0，流速1.0 mL/min，进样体积：10~50 μL（具体根据试液中硒代氨基酸的浓度确定），分离周期：8 min。

HG发生条件：氧化剂为0.5%KOH+2.0%KI溶液；还原剂为0.5%KOH+1.5%KBH₄溶液；载流为10%HCl；紫外灯开。

AFS测定条件：元素灯为Se空心阴极灯；负高压为300 V；灯电流（总电流/辅电流）为80/40 mA；载气为300 mL/min；屏蔽气为600 mL/min。

1.6 数据处理与分析

采用WPS Office计算和作图，其中蛋白态硒=SeCys₂+SeMeCys+SeMet，其它形态硒=总硒-［蛋白态硒+Se（IV）］。

2 结果与分析

2.1 硒产品中总硒和不同形态硒含量分析

19种硒产品的总硒含量和硒形态测定结果见表1。表1中数据采用3次测定（平均值±标准差）表示。硒蛋白在微波蛋白水解仪中经盐酸水解成SeCys₂、SeMeCys和SeMet，硒酸根离子［Se（VI）］在盐酸水解过程中被还原成Se（IV）。蛋白态硒为SeCys₂、SeMeCys、SeMet之和，其它形态硒为总硒与蛋白态硒、Se（IV）之差。

从表1中可以看出，硒产品中总硒含量为0.54~3 356.58 mg/kg，其中含硒量在1 000 mg/kg以上的有硒蛋白粉、水解硒蛋白、硒酵母、肽粉、碎米荠、马铃薯蛋白、硒蛹虫草压片等9种，100~1 000 mg/kg之间的有硒多糖、绿豆蛋白、碎米荠蛋白、植物硒精华片1等4种，10~100 mg/kg之间的有硒蛋白片、硒萃、植物硒精华片2、西兰花、青钱柳提取物等5种，硒都麦草总硒含量低于10 mg/kg。

硒蛋白粉、硒蛋白片、肽粉、硒多糖、马铃薯蛋白、绿豆蛋白、碎米荠、碎米荠蛋白、硒蛹虫草压片等13种产品均含有蛋白态硒，其中蛋白态硒含量在1 000 mg/kg以上的有硒蛋白粉、硒酵母、水解硒蛋白等5种，100~1 000 mg/kg的有肽粉、碎米荠、马铃薯蛋白、硒多糖、硒蛹虫草压片、绿豆蛋白等6种，在10~100 mg/kg的有碎米荠蛋白、硒蛋白片2种，植物精华片、西兰花、硒萃、青钱柳提取物、硒都麦草等6种产品不含蛋白态硒；水解硒蛋白、肽粉、西兰花、硒蛋白粉2、硒蛹虫草压片等6种产品中含有Se（IV），其他产品均不含Se（IV），19种产品中有5种产品既含蛋白硒也含Se（IV），8种产品含蛋白硒不含Se（IV），1种含Se（IV）不含蛋白态硒，有5种产品是既不含蛋白硒也不含Se（IV）。

2.2 产品中硒的形态结构分析及产品来源推测

根据表1的测定结果，计算蛋白硒、Se（IV）、其它形态硒占总硒的比例及各种硒代氨基酸占蛋白硒的百分比，结果见图1~图6。

根据图1~图6的结果分析，硒蛋白粉、水解硒蛋白、硒蛋白片、硒酵母中的硒主要以蛋白硒形态存在，占总硒含量的83.55%~99.93%；肽粉、马铃薯蛋白、绿豆蛋白、碎米荠蛋白、碎米荠、硒多糖、蛹虫草中蛋白硒占总硒的15.67%~68.22%；除西兰花中Se（IV）占总硒的54.86%外，其它产品Se（IV）很少，为0~1.51%。其它形态硒除在硒蛋白粉、水解硒蛋白、硒蛋白片、硒酵母中含量较低外，在其它产品中含量均较高，在肽粉、碎米荠、碎米荠蛋白、绿豆蛋白、马铃薯蛋白、硒多糖、西兰花等8种产品中占31.78%~84.20%，在植物硒精华片、硒萃、青钱柳提取物、硒都麦草等5种产品中占100%。

在硒蛋白粉、水解硒蛋白、硒蛋白片、肽粉、马铃薯蛋白、绿豆蛋白中，蛋白硒主要以SeMet存在，占蛋白硒的66.02%~100.00%，其中硒蛋白片中SeMet占100%。在硒多糖、碎米荠蛋白和碎米荠中，蛋白硒主要以SeMeCys存在，占72.83%~88.72%，不含SeMet；SeCys₂在各种蛋白粉、肽粉、碎米荠、硒多糖、蛹虫草中都存在，但含量较低，仅占蛋白硒的3.58%~27.17%。

以3种硒代氨基酸的比值可以初步判定产品中硒的来源：硒蛋白粉1、硒蛋白粉2、硒蛋白粉3、水解硒蛋白、肽粉4种产品SeMet∶SeMeCys∶SeCys₂比值≈74∶16∶10，由此可以推出这些蛋白粉可能是从硒酵母中提取的，因为硒酵母的主要蛋白硒成分是SeMet，而碎米荠中蛋白硒的主要成分是SeMeCys。马铃薯蛋白与绿豆蛋白具有相似的硒代氨基酸结构，SeMet∶SeMeCys∶SeCys₂≈68∶25∶7；硒蛹虫草压片与硒酵母具有相似的硒代氨基酸结构，SeMet∶SeMeCys∶SeCys₂≈48∶42∶10；碎米荠蛋白和碎米荠具有相似的硒代氨基酸结构，SeMeCys∶SeCys₂≈15∶85，植物硒精华片、硒萃、青钱柳提取物、硒都麦草等均为其它形态硒，西兰花中Se（IV）占44.84%，其它形态硒占55.16%，不含硒蛋白；硒蛋白片中SeMet占100%，来源于单一SeMet。

2.3 富硒产品的补硒效果评价

2.3.1 富有机硒产品的评分方法

根据DBS42/002⁃2014规定^［13］，无机硒含量小于总硒15%以上食品为富有机硒产品，有机硒为总硒含量与无机硒含量之差，富有机硒产品评分的计算公式为：

有机硒评分=［（总硒含量-无机硒含量）/总硒含量×100%］/（1-15%）×100

有机硒评分应在100~120之间，评分越高，有机硒含量越高；评分在100以下，不能评为富有机硒食品。按照该标准，19种硒产品的有机硒评分见表2。

表2中除西兰花有机硒评分小于100外，其它产品均评分大于100，为富有机硒产品。

2.3.2 硒代氨基酸评分方法

① 以SeCys₂、SeMeCys和SeMet为标准的化学评分

参照常规氨基酸的评分方法，以适硒地区母乳中总硒含量为25.31 µg/L，酶解后SeCys₂和SeMet含量分别为21.41 µg/L和2.51 µg/L^［14］，SeMeCys未报道，可能在酶解后未检出，但根据酸水解后会生成SeCys₂、SeMeCys和SeMet三种形态，母乳中硒主要以有机硒形式存在，可推算出SeMeCys含量为1.39 µg/L，SeCys₂、SeMeCys和SeMet占总硒的比例分别为85%、5%和10%，富硒产品中硒代氨基酸的评分计算公式为：

硒代氨基酸评分=（产品硒代氨基酸含量/产品蛋白态硒含量）/（人乳硒代氨基酸含量/人乳蛋白态硒含量）×100。

结果取整数。产品硒代氨基酸的评分越接近100，与人乳中硒代氨基酸的比例契合度越高，越容易被人体吸收利用，得分最低者为限制氨基酸。

以此为标准，19种富硒产品中13种含蛋白态硒的产品适用于硒代氨基酸评分模式，其评分结果见表3。

根据表3中13种产品的评分，SeCys₂均为限制硒代氨基酸，硒蛋白片中SeCys₂和SeMeCys为限制硒代氨基酸，碎米荠、碎米荠蛋白和硒多糖中SeMet为限制硒代氨基酸，产品中硒代氨基酸的结构严重失衡，不利于人体吸收利用。

② 以SeCys₂+SeMeCys和SeMet为标准的化学评分

鉴于硒蛋白水解过程中SeCys₂和SeMeCys可以互相转化，以人乳中SeCys₂和SeMeCys占蛋白态硒含量的90%、SeMet占蛋白态硒含量的10%计算硒代氨基酸的化学评分，计算公式如下：

SeCys₂+SeMeCys评分=（产品SeCys₂+SeMeCys含量/产品总蛋白态硒含量）/90×100

SeMet评分=（产品SeMet含量/产品总蛋白态硒含量）/10×100

结果见表4。

表4中碎米荠、碎米荠蛋白和硒多糖SeCys₂+SeMeCys评分接近100，但SeMet为限制硒代氨基酸，其余产品SeCys₂+SeMeCys为限制氨基酸，SeMet评分远高于100，与母乳中硒代氨基酸比例仍然相差很大。

3 结 论

采用微波水解、HPLC⁃HG⁃AFS法对市场上19种不同类型硒产品中硒的形态进行了测定分析，根据结果，将富硒产品分为四类：一类以硒蛋白为主，如硒蛋白粉、水解硒蛋白、硒酵母、肽粉等，水解后含有SeCys₂、SeMeCys和SeMet；第二类是是单一硒代氨基酸产品，如硒蛋白片，仅含SeMet；第三类是其它形态硒产品，如植物硒精华片、硒萃、青钱柳提取物、硒都麦草等产品，其它形态硒占100%，可能来源于硒多糖或Se⁰；第四类是有机无机混合硒产品，如西兰花，无机硒含量较高，可能是硒酸盐或亚硒酸盐没有完全转化的结果，作为食品添加剂要合理应用。提出了富有机硒产品和硒代氨基酸的化学评分模式，19种硒产品中有18种为富有机硒产品；在13种以蛋白态硒为主的富硒产品中，硒代氨基酸的组成比例与母乳中硒形态相差很大，不利于人体平衡吸收利用。采用单一来源的硒产品在补硒效果上存在缺陷。

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基金资助

湖北省技术创新专项(鄂西民族专项2017AKB073)