植物β⁃葡萄糖苷酶的研究进展

Research progress of plant β⁃glucosidase

摘要

β⁃葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。β⁃葡萄糖苷酶能够水解非还原性末端糖基，在植物细胞壁代谢、植物激素激活以及逆境防御等方面发挥着重要作用。β⁃葡萄糖苷酶依据其氨基酸序列可以分为GH1、GH3、GH5、GH7、GH9、GH12、GH35、GH116等8个家族；但是，目前仅对GH1和GH3有较深入的研究，其他家族的功能依旧不清楚。综述了近年来植物中β⁃葡萄糖苷酶的结构、理化性质、底物特异性、催化机制以及糖苷水解酶家族在植物中的功能等方面的研究进展，总结了植物中β⁃葡萄糖苷酶研究中存在的问题，并指出今后的研究方向。

Abstract

β⁃glucosidase is a glycoside hydrolase， widely found in animals， plants and microorganisms. β⁃glucosidase can hydrolyze non⁃reducing terminal glucosides in plants， and thus it plays an important role in plant cell wall metabolism， phytohormone activation and defense response. β⁃glucosidase can be divided into GH1， GH3， GH5， GH7， GH9， GH12， GH35， GH116 based on amino acid sequence. However， only GH1 and GH3 have been studied deeply， and the functions of other families are still unclear. The research progress on the structure， physicochemical properties， substrate specificity， catalytic mechanism and the function of β⁃glucosidase in plants in recent years are reviewed in this paper. Problems in the research are summarized and the future research direction is pointed out.

Graphical abstract

关键词

β⁃葡萄糖苷酶 / 基因家族 / 活性位点 / 异源表达

Key words

β⁃glucosidase / gene family / active site / heterologous expression

0 引 言

β⁃葡萄糖苷酶（β⁃glucosidase，EC 3.2.1.21），也称为β⁃D⁃葡萄糖糖苷水解酶，是一类纤维素酶，能够从含糖化合物中催化水解末端的非还原性β⁃D⁃糖苷键，释放出β⁃D⁃葡萄糖及相应的单糖、寡糖或复合糖。β⁃葡萄糖苷酶广泛分布于动物、植物、微生物中，在不同的生物体中发挥着各种功能。在动物中，其可调节体内的糖脂和外源性糖苷代谢，例如人类缺乏乳糖酶根皮苷水解酶会导致乳糖不耐症^［1］。人类酸性β⁃葡萄糖苷酶的基因突变会破坏酶的活性，造成其作用底物葡萄糖神经酰胺的贮积，导致戈谢病^［2］。在微生物中，厌氧微生物如白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）^［3］、产琥珀酸丝状杆菌（Bacteriodes succinogenes）^［3］中的纤维素酶能够水解植物细胞壁中的纤维素并以此作为碳源，满足自身的代谢需求。

根据氨基酸序列和保守结构域相似度，植物中的β⁃葡萄糖苷酶可被划分为GH1（glycoside hydrolase （GH）families 1）、GH3、GH5、GH7、GH9、GH12、GH35、GH116等8个家族，且具有共同祖先和相似催化机制被归为一个部族（clan），clan GH⁃A具有最大的基因家族成员，包含了GH1，GH5和GH30，其中GH1家族拥有最多的糖苷酶成员^［4］。

一般而言，β⁃葡萄糖苷酶的功能与作用是依据相应酶的底物特异性、组织定位、细胞定位及与底物互作的条件所决定的。在植物中，β⁃葡萄糖苷酶参与植物体内的各类生理过程，如细胞壁的木质化、植物的激素代谢、植物对逆境的防御反应等^［5~9］。由于GH1和GH3水解酶家族在植物次生代谢及逆境胁迫中发挥重要作用，因而对植物中这两个基因家族的研究也相对较多。

本文从β⁃葡萄糖苷酶的结构、理化性质、催化机制、底物特异性以及在植物中的功能与作用等方面对国内外植物β⁃葡萄糖苷酶的相关研究现状作一系统论述。

1 植物β⁃葡萄糖苷酶的活性位点结构

β⁃葡萄糖苷酶具有多种结构，但是在其所属GH家族中，催化结构域的整体折叠是相似的（图1）。如GH1家族β⁃葡萄糖苷酶具有典型的8个（β/α）结构组成的筒状结构域，其活性位点包含两个羧酸残基，分别起着催化酸碱和亲核试剂的功能^［10］。其中催化酸碱的残基通常含有TFNEP保守序列，亲核谷氨酸（glutamic acid，Glu）总是存在于I/VTENG序列中^［11］。目前，由于大量的GH1家族酶的晶体结构得到解析，这使得活性位点氨基酸残基与配体组分之间的联系更加清晰。

相比之下，GH3家族中的β⁃葡萄糖苷酶存在两个结构域构成其活性位点，分为A区和B区，B区存在SDW序列，有天冬氨酸（aspartate，Asp）残基活性位点^［12］。在结构上，GH3家族基因编码的蛋白一般由5个典型的结构域构成：N端、N段催化区、非同源区、C端未知功能区、C端残基。大麦（Hordeum vulgare L.）中ExoI编码的蛋白，具有典型的GH3双结构域，即（β/α）₈筒状结构和（α/β）₆夹层结构，每个结构域提供一个羧酸催化残基，两个结构域的交界处的口袋是酶的活性位点，可以通过结构域的空间分布来调节活性^［13］。

2 植物β⁃糖苷酶的理化性质

按照酶在生物体内存在的部位，β⁃葡萄糖苷酶可以分为胞内酶和胞外酶。有的生物体内只含有胞内酶，有的生物体只含有胞外酶，但也有少数生物体内同时含有两种酶。在植物中，β⁃葡萄糖苷酶由一个或者多个亚基组成，因而相对分子量差异很大，一般在40~300×10³之间。大部分植物来源的β⁃葡萄糖苷酶等电点在一个酸性范围内。

根据β⁃葡萄糖苷酶的来源和氨基酸序列的不同，β⁃葡萄糖苷酶的pH和稳定性也大不相同。不同植物来源的β⁃葡萄糖苷酶的基本理化性质见表1。由表可知，植物中大多数β⁃葡萄糖苷酶的最适pH为4~6，而这取决于它们的来源和所处的细胞位置。植物中β⁃葡萄糖苷酶的最适温度分布在20 ℃~60 ℃内，一般来说植物中的β⁃葡萄糖苷酶最适温度普遍低于微生物，从工业角度上看，酶的热稳定性越高越好。通常β⁃葡萄糖苷酶的存储温度为0~4 ℃，pH为7~8。

3 植物β⁃葡萄糖苷酶的催化机制

在β⁃葡萄糖苷酶中存在两种催化机制，一种是一步法异头物构型反转催化机制，另一种是Koshland双取代“两步法”构型保持机制^［30］。植物来源的β⁃葡萄糖苷酶遵循“两步法”保持机制，从β⁃异头碳构象端释放β⁃D⁃葡萄糖，催化过程可以分为糖基化和去糖基化两步（图2）。该反应过程中酶上的亲核基团和酸/碱氨基酸残基起重要作用。首先在第一步的糖基化过程中，β⁃葡萄糖苷酶上的亲核基团攻击底物糖苷键的异头碳，同时酸性氨基酸的羧酸基团与异头碳上的氧原子形成氢键，连接形成中间产物。在第二步的去糖基化反应中，之前作为酸催化的残基现在作为碱催化剂，从水分子中获取一个质子，提高其亲核能力来攻击异头碳并置换出β⁃葡萄糖苷酶，即完成中间产物的水解。最终的反应结果是两个催化残基恢复到原始状态，底物糖苷键水解释放出1个β单糖产物。

目前，对于β⁃葡萄糖苷酶催化机制的机理研究主要是通过动力学标记、序列比对分析、特殊氨基酸的化学修饰以及定点突变等方法来实现，现已在催化活性区域鉴定出一些具有特定作用的氨基酸残基。如酸性氨基酸Asp和Glu普遍存在于催化活性区域的亲核基团和酸碱催化中心。CH1家族中的β⁃葡萄糖苷酶属于4/7超家族成员，其β折叠结构中存在两个保守的Glu，分别位于C端的第4位和第7位。而在CH3家族中，氨基酸Asp高度保守，通常作为亲核试剂催化反应。

4 底物特异性

在植物中，糖苷的种类数是远远大于β⁃葡萄糖苷酶的，单个葡萄糖苷酶可能参与一个或者多个反应，所以β⁃葡萄糖苷酶的底物特异性对于确定它们的功能是至关重要的，特别是当同一细胞区室中存在多种底物和多种同工酶时。通常认为，GH1家族的β⁃葡萄糖苷酶具有很高的底物特异性，一种酶可以专一水解β⁃D⁃葡萄糖苷、β⁃D⁃岩藻糖苷、β⁃D⁃甘露糖苷、β⁃D⁃半乳糖苷，或者其他一种或几种糖基。例如，玉米β⁃葡萄糖苷酶ZmGlu1能水解包括其天然底物2⁃O⁃β⁃d⁃吡喃葡萄糖⁃4⁃二羟基⁃1，4⁃苯并恶嗪⁃3⁃酮（DIMBOAGlc）在内的一系列糖苷，但不能水解蜀黍苷，而与之具有72%相似度的高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）β⁃葡萄糖苷酶Dhr1只能水解其天然底物蜀黍苷^［31］。同样，尽管黄檀（Dalbergia cochinchinensis）的豆科异黄酮β⁃葡萄糖苷酶和黑黄檀（Dalbergia nigrescens）的β⁃葡萄糖苷酶氨基酸序列相似度超过80%，但是这两个酶几乎不能水解彼此的天然底物^［32］。因此，活性位点周围氨基酸序列的微小差异会导致结合底物的差异。

β⁃葡萄糖苷酶的底物特异性可以通过控制酶催化口袋的大小来实现，如小麦的糖苷酶基因TaGlu1b和黑麦的糖苷酶基因ScGlu具有很高的序列同源性，在一级结构上仅有两个残基不同，TaGlu1b是Ser⁃464和Leu⁃465，而ScGlu是Glu⁃464和Ser⁃465，通过分析酶与底物结合的晶体结构发现，尽管这两个位置上的残基是小麦和黑麦结构上的唯一区别，但底物并未和这两个位点的氨基酸相互作用，说明这两个位置残基的不同改变了底物与酶结合的入口宽度，从而导致了酶与底物结合的差异^［33］。在玉米和高粱的相关研究中也得到相同的结论：色氨酸侧链所形成的不同构象，有助于酶识别其特异底物^［34］。因此，β⁃葡萄糖苷酶活性位点的残基对酶与底物的结合至关重要，正是通过这微弱的结构差异，从而得以区分作用于同一细胞区室中不同的β⁃葡萄糖苷酶。

除了通过改变酶和底物的接触面积来实现特异性外，不同β⁃葡萄糖苷酶作用的位置也有所不同，如水稻（Oryza sativa）的β⁃葡萄糖苷酶基因Os4bglu12可以水解β⁃1，3键连接的昆布二糖，也可以水解β⁃1，4键连接的聚合度为3~6的低聚糖，但是却不能水解β⁃1，4键连接的纤维二糖和β⁃1，6键连接的龙胆二糖^［35］。

5 植物中β⁃葡萄糖苷酶的功能应用

到目前为止，在植物中鉴定到的糖苷酶家族主要有GH1、GH3、GH5、GH12、GH35、GH116 （http：//www.cazy.org），同样，植物中的GH1也是最大的糖苷酶家族，其次是GH3家族。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中共鉴定到48个GH1基因^［36］、19个GH3基因^［37］，在水稻中共鉴定到38个GH1基因^［35］、13个GH3基因^［38］，玉米中鉴定到26个GH1基因^［39］、13个GH3基因^［40］。此外，在植物中还发现有GH5、GH9、GH12等基因家族。对GH5家族的系统发育分析显示，共有51个不同的亚家族，但是在植物中只发现了两个亚家族（GH5_11和GH5_14）^［41］。而GH9家族成员可能起源于陆生植物的垂直基因转移和渐进进化^{［42，43］}。

由于植物中许多化合物含有非还原性末端糖苷，植物β⁃葡萄糖苷酶因而能够发挥广泛的功能与作用，包括参与植物细胞壁的形成和降解、植物激素的激活、植物对生物与非生物胁迫的防御等，而参与这些过程的主要是GH1家族和GH3家族。

5.1 参与植物细胞壁的形成与降解

植物细胞壁由木质素及木质素类化合物等特殊聚合物组成，而细胞系的组成和结构的变化对胚胎的发育是至关重要的^［44］，纤维素含有大量的β连接糖基，β⁃葡萄糖苷酶通过降解细胞壁中的低聚糖和从糖苷中释放木质素单体，来维持细胞壁的次生结构。在种子发育过程中，β⁃葡萄糖苷酶能够水解淀粉和纤维素以及糖苷的脱糖基化导致葡萄糖的积累，形成尿苷⁃5'⁃二磷酸葡萄糖（uridine 5'⁃diphosphoglucose，UDPG），导致UDPG积累，而UDPG参与细胞壁的合成^［45］。水稻中的糖苷酶基因Os3BGlu7、Os3BGlu8和Os7BGlu26能在细胞壁发育过程中水解纤维素低聚糖释放葡萄糖^{［46，47］}；Os4BGlu14在水稻胚中的过表达能够降低种子中的淀粉含量，增加葡萄糖的含量而降低种子的寿命，但增加了种子中木质素的含量。

木质素是细胞壁的重要组成部分，能增强植物对干旱、盐和其他胁迫的耐受性。水稻β⁃葡萄糖苷酶基因OsBGlu1在嫩枝中有很高的表达量，同时能高效水解β连接的二糖和小分子寡糖，并且对纤维素寡糖也具有高转糖基化活性，表明它可能有多种功能，既在水稻萌发和花膨胀期间参与细胞壁的水解，又能通过回收细胞壁水解的糖残基来生成新的低聚糖^［32］。此外，GH5与GH9家族成员也被证明参与被子植物细胞壁的代谢，包括纤维素的合成与降解，细胞壁多糖的修饰，以及在细胞伸长过程中细胞壁的松动等过程^［48］。

5.2 参与植物激素的激活

植物体内存在着许多激素糖苷，一些β⁃葡萄糖苷酶能激活激素从而调节植物生长发育。如在干旱胁迫下，拟南芥β⁃葡萄糖苷酶AtBG1活性增加到4倍，聚合水解脱落酸葡萄糖基酯（abscisic acid glucose ester，ABA⁃GE）生成ABA来响应环境变化^［49］。大麦中未激活的ABA从根运输到叶片，被叶片中胞外的β⁃葡萄糖苷酶水解来抵抗盐胁迫^［50］。同时在体外实验中，β⁃葡萄糖苷酶已被证明能水解反式玉米素、生长素、细胞分裂素和赤霉素的糖苷，从而激活这些激素^［51~53］。水稻GH1基因家族成员Os3BGlu6和Os4BGlu13基因对赤霉素A4 1⁃O⁃β⁃d⁃糖基酯的水解活性较高，Os3BGlu6还能水解ABA⁃葡萄糖酯，提高ABA水平，从而影响水稻的耐旱性和光合作用^［54］。

研究发现，GH3基因家族启动子序列中存在一些与植物激素相关的元件，GH3基因基于其序列相似性以及底物特异性分成3类：第一类，具有茉莉酸（jasmonic acid，JA）和或者水杨酸（salicylicacid，SA）酰胺合酶活性，以JA和SA作为底物；第二类， 具有吲哚⁃3⁃乙酸（indole⁃3⁃acetic acid，IAA）酰胺合酶活性，能够被生长素诱导表达；第三类，很大程度上依旧未知^{［55，56］}。马铃薯（Solanum tuberosum）中JA腺苷化与GH3基因表达的关系分析表明，StGH3.12对茉莉酸甲酯（methyl Jasmonate，MeJA）处理有显著的响应。在水稻OsGH3基因中，OsGH3⁃1、OsGH3⁃2、OsGH3⁃8和OsGH3⁃13调控IAA、JA和SA信号通路之间的串联，从而影响水稻对生物或/和非生物胁迫的耐受性^［56］。

5.3 参与植物对生物与非生物胁迫的防御

β⁃葡萄糖苷酶家族除了参与植物的细胞壁代谢，植物激素的激活过程外，还在植物逆境胁迫的防御反应中起重要作用。植物在适应性进化过程中已经逐步演化出多种抵御外界胁迫（生物胁迫与非生物胁迫）的机制，其中最常见的就是化学防御。在植物中存在大量的化学防御物质，如含氰β糖苷，包括三叶草（Trifolium pratense）中的芳樟苋、木薯（Manihot esculenta Crantz）和其他植物中的芳樟苋、高粱中的杜林、樱桃（Cerasus pseudocerasus）和其他核果中的洋李甙等，β⁃葡萄糖苷酶通过水解相对惰性的糖苷，释放出有毒化合物，如氰化氢、皂甙、香豆素、醌、异羟肟酸、鱼藤酮等，帮助植物抵御食草动物和入侵真菌^［4］。

一般来说，防御糖苷通常储存在液泡中，相应的β⁃葡萄糖苷酶则储存在质体中，在植物细胞受到植食性昆虫的破坏时，植物防御相关的β⁃葡萄糖苷酶和β⁃硫代糖苷酶会结合并激活酶的聚合因子蛋白，释放出可溶性的毒性化合物来防御^［57］。此外，β⁃葡萄糖苷酶通过调节植物内生菌的生长来发展共生关系从而使植物具有防御特性。因此，植物中不同细胞间隔的各种防御β⁃糖苷酶及其多重聚合因子的相互作用需要更加系统深入的研究来解析。

6 β⁃葡萄糖苷酶目前的问题和亟待解决的问题

6.1 完善β⁃葡萄糖苷酶的分离与功能鉴定

在β⁃葡萄糖苷功能的鉴定中，传统的做法是将某一种或特定几种底物与纯化分离出来的β⁃糖苷水解酶反应，通过检测底物是否发生变化从而验证其功能。拟南芥根中的3种β⁃葡萄糖苷酶正是用这种方式鉴定出来，它们均能水解其天然产物东莨菪碱^［58］。但植物中含糖化合物的种类是远远大于水解酶的数量的，所以一种β⁃葡萄糖苷酶可能水解多种底物。因此，此种方法获取的酶的功能是局限的，不能准确清晰地定义酶的功能。目前，β⁃葡萄糖苷酶功能的鉴定还有以下几个难点：①实验鉴定中，作为底物的糖苷种类是有限的；②某些β⁃葡萄糖苷酶只在植物特定的生长期特异的组织中表达，难以检测到；③部分β⁃葡萄糖苷酶的天然底物结构复杂，难以分离纯化，给功能鉴定造成了困难；④底物的水解可能是由多种同工酶协同催化的，仅通过观测底物是否水解，难以鉴定出特异的酶。例如，拟南芥中的β⁃葡萄糖苷酶AtBGLU21，AtBGLU22和AtBGLU23就不能水解人工合成的显色底物4NPGlc和2NPGlc，因此无法检测到^［58］。综上所述，在研究β⁃葡萄糖苷酶的功能时，我们首先需要了解酶的结构，预测其可能的功能，并进行细胞定位，从而预测可能的底物。

6.2 β⁃葡萄糖苷酶的异源表达

在酶的功能验证中，常规的方式是克隆相应的cDNA、构建表达载体然后获得重组蛋白以检测其活性。从植物体中很难直接纯化得到大量的β⁃葡萄糖苷酶，而异源表达系统的建立能够有效解决这个问题。目前植物β⁃葡萄糖苷酶常用的异源表达系统有以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表的原核表达系统、酵母表达系统以及昆虫细胞表达系统。原核表达系统虽然能高效获得大量目的蛋白，但是由于缺少翻译后的加工修饰，所得到的蛋白的活性往往较低甚至没有，因此不利于植物来源的β⁃葡萄糖苷酶基因的表达。近年来，随着真核表达系统的建立与完善，其中毕赤酵母（Pichia pastoris）的应用最为广泛，但同样也存在一些局限性。根据实验经验发现，大约有一半的蛋白不能在大肠杆菌或者毕赤酵母中检测到^［36］。同时，表达菌体自身也会存在一定的β⁃葡萄糖苷酶活性，如毕赤酵母自身带有甲醇诱导的外切β⁃1，3⁃葡聚糖酶（EXG1）^［59］，因而会出现背景干扰。与微生物表达系统相比，昆虫表达系统背景活性干扰很小甚至没有，已用于表达纯化拟南芥中的β⁃葡萄糖苷酶，但缺点是比较昂贵，操作也更为复杂。相较于动物表达系统，在植物细胞中表达植物蛋白更加理想。目前，许多外源β⁃葡萄糖苷酶已经在拟南芥^［60］、烟草（Nicotiana tabacum L.）^{［61，62］}中成功表达。尽管植物表达系统能最大限度地保留外源β⁃葡萄糖苷酶的结构和活性，并能为反应提供相似的内源环境和辅佐因子，但仍不易对目的蛋白纯化分离以及大量获取。因此对转基因植物的酶动力学研究造成了极大阻碍，所以亟待建立一种简便且高效的表达纯化系统，便于对植物中的β⁃葡萄糖苷酶分离鉴定。

7 小 结

随着科学技术的发展，部分植物来源的β⁃葡萄糖苷酶的蛋白晶体结构、催化机理、生物功能、遗传改造取得了一定进展，但还有一些问题是未知的，比如尽管结构模型为测试底物能否与活性位点残基相互作用提供了一定的基础，但目前并没有明确的方法可以直接从结构预测底物的特异性。目前酶功能和结构的深入研究主要集中在GH1、GH3、GH5家族中，因此需要进一步的工作来评估这些家族对植物的作用。未来的研究还需要将蛋白的生化特性和功能鉴定与物理表型、代谢水平相结合，开发用于在植物中表达β⁃葡萄糖苷酶的表达系统，以便在植物提取物和蛋白纯化中能完整保留酶的活性。通过基因工程或蛋白质工程对植物中的β⁃葡萄糖苷酶定向改造，以实现所需表型或进一步提高植物的病虫抗性或降解能力。另外，为了更全面地了解植物中β⁃葡萄糖苷酶的作用，需要在鉴定其生长发育中的作用与特点、酶与底物作用的位置和运输途径、底物的功能和反应过程中相关因子的辅助作用等方面开展更加深入的研究。

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基金资助

国家自然科学基金(31470388)