甘肃巴丹吉林沙漠细菌多样性及其产酶特性

Biodiversity and characteristics of enzyme producing bacteria from Badain Jaran Desert in Gansu Province

摘要

为系统地探索甘肃巴丹吉林沙漠土壤中细菌多样性并评估其潜在的应用价值，采集6个代表性样点的沙漠土壤，运用高通量测序技术评估沙漠土壤细菌的群落结构和预测功能特征，同时选用5种培养基对其中细菌进行分离培养，并对代表性的菌株进行酶活性筛选。免培养结果显示，甘肃巴丹吉林沙漠土壤中的细菌分属于30门70纲155目227科343属，这些微生物主要参与碳氮硫等元素循环和有机物降解，此外还检测到1.5%的未知微生物。通过纯培养方法共获得368株细菌，归类于4门20目37科64属，其中24株属于潜在新分类单元，菌株中18.3%有淀粉酶活性，51.7%产蛋白酶以及55.5%有酯酶活性。结果表明甘肃巴丹吉林沙漠土壤中蕴藏着多样性较高、功能酶丰富的微生物资源，具有重要的研究意义和应用价值。

Abstract

In order to explore the diversity and enzyme of bacteria systematically from Badain Jaran Desert in Gansu Province， 6 representative soil samples were collected. The community structure and functional prediction of the bacteria in these samples were evaluated by high⁃throughput sequencing technology. At the same time， the bacteria were further isolated and cultivated by using 5 kinds of media， and the representative strains were screened for the ability of producing amylase， protease and esterase. Results from culture‑independent method showed that the bacteria were annotated into 30 phyla， 70 classes， 155 orders， 227 families and 343 genera. The predicted functions were related mainly to carbon， nitrogen and sulfur cycles and organic degradation. In addition， there were 1.5% of unidentified microbes. Through the comparative analysis based on 16S rRNA gene sequence similarities， a total of 368 strains were obtained. These strains were affiliated to 64 genera of 37 families in 20 orders within 4 phyla， of which 24 strains were potential new taxa. Of these strains， 18.3% produced amylase， 51.7% produced protease and 55.5% produced esterase. These results demonstrate that there are abundant bacteria and large number of functional strains in the Badan Jaran Desert in Gansu Province， which has important research significance and application value.

Graphical abstract

关键词

巴丹吉林沙漠 / 扩增子 / 分离培养 / 功能预测 / 生物多样性 / 功能酶

Key words

Badan Jaran Desert / amplicon / isolation / function prediction / biodiversity / enzyme function

0 引 言

沙漠是地球上最大的陆地生态系统之一^［1，2］，其具有极度干旱、强辐射、昼夜温差大和长期寡营养等特点，是典型的极端生态系统，多种极端环境因子共同作用，极大地限制了生命的延续，因此在很长时间里，沙漠被认为是一个相对来说十分简单的生态系统^［3，4］。随着研究的深入，人们认识到营养匮乏的沙漠反而是一个由多种生命形式组成的生态系统，其中，微生物是最重要和最活跃的组成部分，且类群极为多样^［5~7］。研究者通过免培养技术，从焦利斯坦沙漠、塔尔沙漠、巴哈尔沙漠和塔克拉玛干沙漠中均检测出大量的细菌和少量的古菌类群^［3］；从阿瓦隆湾海滩干沙漠分离到大量以放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）为主的微生物^［8］。此外，从阿塔卡玛沙漠中也发现了罕见而独特的真菌物种^［9］，因此沙漠微生物逐渐成为相关领域的研究热点之一^［10］。

酶是一种重要的生物催化剂，在生命科学、医药和新能源开发等多个领域拥有广阔的应用前景。有研究表明来自印度沙漠的一些高温单孢菌、小双孢菌和糖多孢菌能分泌热稳定性良好的木聚糖酶、淀粉酶和纤维素酶，这些高温酶在工业上体现出更经济有效的价值^［11］。因此，探索沙漠微生物群落功能，从中分离收集功能菌株，可以为新颖酶类的筛选提供上游资源。

我国沙漠面积超过陆地总面积的百分之十，其中巴丹吉林沙漠是八大沙漠之一，绝大部分在内蒙古，在甘肃省也有分布，该区域位于黑河流域下游金塔县境内、弱水以东，以流动沙丘为主，同时由于长年受强大的西北风侵蚀形成了密集的高大沙山^［12］，沙丘和沙山上长有不同类型的植物，如芦苇、梭梭、胡杨、骆驼刺等。虽然气候干旱，年降水量仅50~200 mm^［13］，但沙山间还分布有多个内陆小湖，且以咸水湖为主，除此之外沙漠中还生存着狼、狐狸、沙蜥等多种野生动物。因此甘肃巴丹吉林沙漠的生物资源具有多样性。然而对于该沙漠土壤中微生物资源的分布和应用价值缺乏研究，本研究首次采用免培养技术手段、微生物纯培养方法以及酶学活性检测法对甘肃巴丹吉林沙漠土壤中细菌展开研究，对甘肃巴丹吉林沙漠土壤中细菌及其群落功能的多样性和微生物资源进行了探究，同时挖掘了具有应用潜力的功能菌株， 对促进沙漠微生物多样性及资源利用的研究具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 样品来源

6份代表性的样品于2019年7月采集自甘肃省巴丹吉林沙漠土壤（表1），分别标记为D1、D2、D3、D4、D5、D6。样品采集过程如下：用无菌采样勺将地表以下1~5 cm土样分别装入无菌采样袋，并标记样点信息，常温转移至实验室后置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.2 土壤样品总DNA的提取及16S rRNA基因高通量测序

按照Fast DNA®SPIN Kit （MP Biomedicals）试剂盒的使用说明提取土壤微生物总DNA。以338F（5'⁃ACTCCTACGGGAGGCAGCA⁃3'）和806R（5'⁃GGACTAC HVGGGTWTCTAAT⁃3'）作为引物扩增细菌的16S rRNA基因。PCR扩增体系（25 µL）： 5×reaction buffer， dNTPs（2.5 mmol/L） 2 µL， 引物（10 µmol/L）各1 µL， 模板2 µL，Q5DNA Polymerase 0.25 µL以及ddH₂O 8.75 µL。扩增程序：98 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环。PCR扩增产物送金唯智（广州）生物科技有限公司利用Illumina MiSeq平台（Illumina，美国圣地亚哥）进行高通量测序，测得的原始序列上传至NCBI的Sequence Read Archive（SRA）数据库，登录号为 SRR13830017⁃SRR13830022。运用QIIME2软件^［14］对高质量序列按97%的序列相似度^［15］进行OTU（operational taxonomic units）划分及分析各样本在不同分类水平的群落组成。使用QIIME2软件计算α多样性指数。将生成的OTU表与FAPROTAX 1.2.4数据库^［16］比较，进行群落功能预测，结果基于R4.0.0平台，采用ggplot2（3.1.1）进行统计分析及可视化。

1.3 培养基的制备

本研究使用5种分离培养基，其中R2A培养基营养均衡，适用于大多数细菌和放线菌的分离培养，柠檬酸培养基和YIM 38培养基则适用于放线菌的分离^［17~19］。每种培养基中加入终浓度为50 mg/L的制霉菌素，以抑制真菌的生长。

1.3.1 分离培养基组成

1/5 R2A培养基：蒸馏水1 L，酵母浸出粉 0.1 g，蛋白胨0.1 g，酪蛋白水解物0.1 g，葡萄糖0.1 g，可溶性淀粉0.1 g，磷酸二氢钾0.06 g，无水硫酸镁0.004 8 g，丙酮酸钠0.06 g，琼脂15 g，微量盐 1 mL，复合维生素B 1 mL， pH 7.2±0.2；

改良1/10 R2A培养基：蒸馏水1 L，酵母浸出粉 0.05 g，蛋白胨0.05 g，酪蛋白水解物0.05 g，葡萄糖0.05 g，可溶性淀粉0.05 g，磷酸二氢钾0.03 g，无水硫酸镁0.002 4 g，丙酮酸钠0.03 g，琼脂15 g，微量盐 1 mL，复合维生素B 1 mL，土壤浸取液^［16］100 mL，pH 7.2±0.2；

1/5柠檬酸培养基：蒸馏水1 L，柠檬酸0.024 g，柠檬酸铵0.024 g，硝酸钾0.3 g，磷酸氢二钾0.08 g，硫酸镁0.02 g，氯化钙0.01 g，EDTA 0.004 g， 碳酸钠0.04 g，琼脂15 g，微量盐 1 mL，复合维生素B 1 mL，pH 7.5；

改良1/10柠檬酸培养基：蒸馏水1 L，柠檬酸0.012 g，柠檬酸铵0.012 g，硝酸钾0.15 g，磷酸氢二钾0.04 g，硫酸镁0.01 g，氯化钙0.005 g，EDTA 0.002 g， 碳酸钠0.02 g，琼脂15 g，微量盐 1 mL，复合维生素B 1 mL，土壤浸取液100 mL， pH 7.5；

YIM 38培养基：蒸馏水1 L， 葡萄糖4 g， 酵母提取物4 g， 麦芽提取物5 g，琼脂18 g，pH 7.4。

微量盐配方：在1 L蒸馏水中添加ZnSO₄·7H₂O 0.1 g， MnCl₂·4H₂O 0.03 g， H₃BO₃ 0.3 g， CoCl₂·6H₂O 0.2 g， CuCl₂·2H₂O 0.01 g， NiCl₂·6H₂O 0.02 g， Na₂MoO₄·2H₂O 0.03 g。

1.3.2 酶活性检测培养基成分

淀粉酶活性检测培养基（g/L）：可溶性淀粉10 g，碳酸镁0.3 g，KNO₃ 1.0 g，NaCl 0.5 g，K₂HPO₄ 0.3 g，琼脂15 g， pH 7.2~7.4。

蛋白酶活性检测培养基（g/L）：脱脂牛奶 10 g，大豆蛋白胨5 g，胰蛋白胨15 g，NaCl 5 g，琼脂15 g， pH 7.2~7.4。（脱脂牛奶与其他成分分开灭菌，105 ℃ 15 min，倒平板前混匀即可）

酯酶活性检测培养基（g/L）：蛋白胨1 g，CaCl₂·7H₂O 0.1 g，NaCl 5 g，琼脂9 g， pH 7.4。（底物Tween20， Tween40， Tween60， Tween80终浓度为1%，与其他成分分开121 ℃灭菌25 min）

1.4 样品的预处理和分离

称取1 g新鲜土壤样品于装有10 mL无菌水的锥形瓶中（含有10粒无菌玻璃珠），45 Hz超声波处理1 min，然后置于摇床中37 ℃，180 r/min震荡1 h。用无菌水对其进行10倍梯度稀释，吸取100 μL 1×10^-4悬浮液于分离培养基中，用无菌涂布棒均匀涂布于分离平板，为了防止培养基水分蒸发过快，用封口膜包裹平板并装入保鲜袋中28 ℃恒温培养3~4 wk。

1.5 菌株的纯化和保藏

依据菌落的大小、颜色及表面形态去除肉眼可见的重复，挑取单菌落后进一步采用相同的培养基划线纯化并28 ℃扩大培养，纯化的菌株使用20%无菌甘油管在-80 ℃下保藏。

1.6 菌株基因组DNA的提取及分子生物学鉴定

使用Chelex法^［20］对上述分离到的菌株进行基因组DNA的提取。采用16S rRNA基因通用引物27F（5'⁃GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3'） 和1492R（5'⁃CTACGGCTACCTTGTTACGA⁃3'）进行PCR扩增^［21］，PCR产物送至广州擎科生物技术有限公司进行测序。利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）工具在NCBI（美国国家生物技术信息中心）数据库和EzBioCloud（http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）网站进行相似性比对分析^［22］。系统发育树采用IQ⁃TREE软件^［23］基于ML算法构建，可视化及功能注释使用iTOL平台^［24］完成。

1.7 酶活性筛选

选取系统发育上有代表性的180株菌，采用点接法分别接种于淀粉酶、蛋白酶和酯酶相应的酶学活性筛选培养基上，28 ℃培养3~4 d。蛋白酶和酯酶结果通过观察菌落周围是否出现透明圈，淀粉酶则使用碘液染色法，经碘液染色后出现透明圈则记为阳性^［25］。测量水解圈半径（R）和菌落半径（r），活性记录方法：水解圈半径（R）/菌落半径（r），依据半径比值判断酶活性强弱，并将R/r≥2作为较高活性范围。

2 结果与分析

2.1 免培养分析沙漠土壤细菌的群落结构

各样品16S rRNA基因高通量测序结果的覆盖率均在99%以上，能够很好地反应此区域细菌的群落结构。六份样品获得3 529个OTU，归属于细菌域的30门70纲155目221科343属。各样品间微生物的Shannon指数为5.513~6.439（表2），其中样品D1的Shannon指数最高，为6.439，其次是D3样品，指数为6.406，样品D5的指数最低。这些细菌类群中放线菌门相对丰度最高（41.2%），其次是变形菌门（16.7%）（图1）。从属水平分析，样品中检测到41.5%的未知微生物和13.4%的未培养菌属，表明甘肃巴丹吉林沙漠蕴藏着大量的尚未被认识的微生物。

2.2 功能预测

为了探究样品中微生物群落参与的潜在生态学过程， 我们对其功能进行了预测。统计分析过程中，只出现在单一样品中的功能被提前去除，如图2显示了参与每个过程的OTU数量，other表示未知生态功能的OTU数量。沙漠微生物群落参与了有机物的降解，光合作用及C、N、S等生源元素的生物地球化学循环，另外，49.9%未知功能的出现说明此沙漠微生物功能及参与的生态学过程十分丰富，有待深入研究。化能异养、好氧化能异养、好氧氨氧化、硝化和硝酸盐还原是主要功能，可以看出参与碳氮循环和有机物降解类微生物是该沙漠的优势物种。

2.3 可培养细菌的多样性

依据菌落的质地、颜色、大小、边缘、透明度、是否产生可溶性色素等形态特征对比去重复后，将分离到的368株菌株进行16S rRNA基因序列测序（序列号为：MT847019，MW040156，MT832765⁃MT832766，MT905114⁃MT905123，MT909153⁃MT909506）。结果表明这些菌株隶属放线菌门、变形菌门、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门下的9纲64属（图3），放线菌共177株，占主导地位，涵盖节杆菌属（Arthrobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、库克菌属（Kocuria）等22个属。此外还分离到与已发表模式菌株的序列相似度低于98.65%^{［26，27］}的潜在新分类单元24个（表3）。

2.4 可培养细菌多样性和免培养细菌多样性比较分析

在不同分类水平上，纯培养与免培养的菌株数都存在显著的差异（图4），其中纯培养分离到属级别的菌株数量仅为免培养分析结果的18.7%。纯培养结果中的优势类群为放线菌门（48.1%），其次是变形菌门（45.1%），此结果与免培养结果相一致。但是免培养所得OTUs在门水平上分布的主要类群中绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门、异常球菌⁃栖热菌门（Deinococcus⁃Thermus）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和装甲菌门（Armatimonadetes）并未分离到任何菌株（表4），表明上述类群较为特殊，由于分离条件的限制不易获得纯培养物。

2.5 淀粉酶、蛋白酶和酯酶活性筛选

如图5和图6所示，71.1%的菌株表现出至少一种功能酶活性，其中产淀粉酶、蛋白酶和酯酶的菌株所占比分别为18.3%、51.7%和55.5%。它们对不同底物表现出不同程度的水解酶学特性，44.4%的菌株对Tween 60呈现出较好的水解能力，多数菌株对淀粉和Tween 20的水解性能较弱。放线菌中能同时水解两种以上底物和水解能力较强的菌株 （活性2~4）比例较高，分别为41.1%和27.2%。上述结果说明该沙漠产酶活性菌株类群繁多，放线菌是筛选酶活性的主要对象。

3 讨 论

本研究利用免培养技术和纯培养方法^［28~30］对甘肃省巴丹吉林沙漠的细菌多样性进行分析。高通量测序的数据显示该沙漠的细菌类群分属于放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门等30个细菌门，其中放线菌门和变形菌门为优势菌门，通过纯培养也印证了此结果，这与前人研究结果一致^{［31，32］}，因此放线菌和变形菌是该沙漠微生物群落的重要成员。此外放线菌门是丰富度最高的类群，表现为其对于高温、高盐碱、强辐射具有良好的适应性，这可能和放线菌能产生抗逆性极强的孢子、广泛的代谢能力、次级代谢抗生物活性物质的竞争以及多重紫外线损伤修复能力有关^［33］。α多样性指数通常用来估计环境群落的物种多样性，结果显示含有植被的D1、D3和D6样品的Shannon和Simpson指数较高，表明沙漠中植被对维持土壤微生物多样性有积极作用。然而根据细菌的物种组成和α多样性分析，六份样品间细菌的组成差异不明显，这可能与本研究涉及到的样点范围较小有关，另外免培养结果中未知微生物类群的出现，说明有必要对甘肃巴丹吉林沙漠开展系统的微生物多样性研究，以揭示其微生物分布规律。

此次功能预测获得51种有效功能分组，其中参与碳氮元素循环和有机物降解是甘肃巴丹吉林沙漠中微生物群落的主要功能。这些独特的生理功能具有重要的理论研究和应用价值，一方面，元素循环相关的功能对维持生态系统中营养平衡具有重要意义；另一方面对芳香族化合物及碳氢化合物等有机物的高效降解可用于环境污染的治理，因此对此类微生物的发掘有助于推进生物修复和环境保护 ^{［29， 34，35］}。此外，尚有大量功能被归为未知功能类群（49.9%），表明目前对沙漠微生物的功能认识还不足，同时也说明该沙漠中蕴藏着代谢和功能新颖的微生物资源，极具开发价值。

本研究分别以淀粉、牛奶和吐温20、40、60、80作为碳源，对微生物的潜在应用价值进行评估，从180株代表性菌株中筛选出71.1%的阳性菌株，其中41.1%的类群能产生两种以上的酶且部分菌株酶活性较高，表明此沙漠含有丰富的功能酶产生菌。活性菌株分散于系统发育树的不同分支，即功能菌株在遗传学上具有丰富的多样性，意味着沙漠微生物在长期的适应过程中已演变出多样的产酶机理，蕴藏丰富的酶类资源。因此，该沙漠环境微生物在研发相关酶制剂方面显示出广阔的应用前景。

综上所述，甘肃巴丹吉林沙漠是良好的微生物资源库，系统性地开展其中微生物的挖掘工作对补充微生物物种资源信息库十分必要^［36~38］。其次功能预测及酶活性筛选的结果表明该沙漠蕴含大量的功能微生物，它们在生物修复、环保、医药、工农业生产和新能源开发等多个领域拥有广泛的应用潜力^［39］，因此进一步挖掘沙漠功能微生物对推动创新生物技术具有积极作用^［40］。

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基金资助

国家科技部及教育部“111计划”(国科发专(2019)475)

贵州省第六批人才基地项目(RCJD2018-22)

贵州省科技厅社会发展攻关支撑项目(黔科合支撑(2019)2873)

贵州省科学技术厅国际科技合作基地(黔科合平台人才(2020)4101)

贵州省科技厅优秀青年科技人才培养计划项目(黔科合(20175639)┣黔科合支撑(2020)4Y220)