云斑白条天牛幼虫肠道纤维素降解菌的分离鉴定及产酶条件的优化

Isolation and identification of cellulolytic bacteria and optimization of enzymatic production conditions in the intestinal tract of the larva of Batocera lineaolata （Chaevroat）

摘要

为筛选云斑白条天牛［Batocera lineaolata （Chaevroat）］幼虫肠道中高效纤维素降解菌，实现纤维素的高效利用，以羧甲基纤维素钠为唯一碳源，并利用刚果红平板染色法初筛、纤维素酶活测定复筛，从云斑白条天牛幼虫肠道中分离产纤维素酶菌株；采用形态学观察和16S rDNA基因序列同源性分析方法对该菌株进行鉴定，单因素试验法对菌株的产酶条件进行优化。结果表明：从45株纤维素降解菌中通过刚果红染色获得2株高效产纤维素酶菌株A04、A07，鉴定分别为苍白杆菌属（Ochrobactrum）A04、拉乌尔菌属（Raoultella）A07。初步确定苍白杆菌属A04在温度32 ℃、初始pH=6、以酵母膏为氮源条件下滤纸酶（FPase）活力最大；拉乌尔菌属A07产纤维素酶在温度32 ℃、初始pH=7、以酒石酸铵为氮源条件下FPase活力最大。

Abstract

To identify high⁃efficient cellulose degrading bacteria from the intestinal tract of the larva of Batocera lineaolata （Chaevroat） and promote the efficient utilization of cellulose， high⁃yielding cellulase strains were isolated from the intestinal tract firstly by the methods of Congo red staining method and then by cellulase activity analysis. The strains were identified by morphological observation， physiological and biochemical characteristics and homology analysis of 16S rDNA gene sequence. The enzyme production of the strain was optimized by single factor test. The results showed that two efficient cellulase⁃producing strains A04 and A07 were obtained from 45 cellulose degrading bacteria by Congo red staining， and were identified as Ochrobactrum A04 and Raoultella A07. It was preliminarily determined that when the temperature was 32 ℃， initial pH=6 and yeast extract was used as the nitrogen source， the activity of Ochrobactrum A04 of FPase was the maximum. The optimum conditions for cellulase production of Raoultella A07 were 32 ℃， initial pH=7， and sodium sulphate used as nitrogen source.

Graphical abstract

关键词

云斑白条天牛幼虫 / 肠道 / 纤维素降解菌 / 产酶条件优化 / 酶活力测定

Key words

larva of Batocera lineaolata （Chaevroat） / intestinal tract / cellulose degrading bacterium / optimum conditions for enzyme production / enzyme activity determination

0 引 言

纤维素是自然界最丰富、来源最广泛的有机物质，是地球上重要的可再生资源^［1］。在能源危机不断加重的今天，纤维素能源受到越来越多的关注。如果将可再生的纤维素降解为便于利用的糖液，再进一步转化为具有经济价值的产品，如乙醇^［2］、单体蛋白^［3，4］以及有机酸^［5］等，对能源危机、食物短缺等问题具有重大意义。大规模纤维素生物转化工艺的发展，将有利于食品和动物饲料不足、废弃物处理、矿石燃料依赖性等一系列问题的解决^［6］。但由于纤维素组成结构复杂，有序的结晶区域和无序的不定区域组成纤维素结构单元原纤维^［7］，使其难降解、利用率较低。自然界中许多微生物能分泌多种纤维素酶类，如β⁃葡聚糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、过氧化物酶和酯酶等^［8］，且微生物处理法具有减少环境污染、提高利用率等优势。因此，筛选高效产纤维素酶的菌株具有重要的现实意义。

近年来，研究学者对纤维素的分解转化研究越来越广泛，研究发现，在桑粒肩天牛（Holotrichia parallela）幼虫肠道微生物中含有可降解纤维素的酶^［9］，松墨天牛（Monochamus alernatus）幼虫肠道微生物中具有完整的纤维素酶系^［10］。目前分离的具有纤维素降解能力的细菌较多，主要有芽胞杆菌属（Bacillus）、假单孢菌属（Pseudomones）、梭菌属（Clostridium）、纤维单孢菌属（Cellulomonas）^{［11，12］}。其中芽胞杆菌能产生大量纤维素酶，并且可产生抗逆性极强的芽胞，使其成为降解纤维素的优秀备选菌株之一，同时芽胞杆菌还具有遗传稳定性等优势^［13］，可消耗肠道内氧气使其形成厌氧环境，为有益微生物如乳酸杆菌等生长提供良好环境，有较强的分泌胞外酶能力并能产生丰富的代谢产物^［14］。为提高菌株产纤维素酶活力，人工诱变和基因修饰等生物工程逐渐应用于纤维素降解菌的改造，但仍存在酶活力低、适用范围有限的问题^［15］，筛选新的纤维素降解菌仍是研究热点。本研究拟以云斑白条天牛［Batocera lineaolata （Chaevroat）］幼虫为研究对象，综合采用刚果红水解圈测定法和滤纸条降解法，从云斑天牛幼虫肠道中筛选出能降解纤维素、产酶能力较强的菌株，并对其进行产酶条件优化，以开发具有纤维素降解能力的新菌株。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫及培养基

云斑白条天牛4龄幼虫采集于广西国有高峰林场六里分场（108°20′E，22°58′N）的桉树人工林，将虫害木据成约1 m的木段，木段两端用棉花和塑料薄膜包裹以防止水分散失，放置塑料箱以备实验需要。

选择培养基、产酶发酵培养基和种子培养基参照文献［16］的方法配制。

1.2 纤维素降解菌的筛选

选取3头云斑白条天牛4龄幼虫，用75%酒精冲洗并浸泡消毒3 min，随后用无菌水冲洗3次，在无菌操作台进行解剖获取肠道，将肠道上的脂肪等物质用无菌水冲走，放入匀浆器中，并加入1 mL无菌水进行充分研磨，制成肠道匀浆液。

分别取经过稀释10³、10⁴、10⁵倍的匀浆液100 μL均匀涂布在选择培养基上，每个浓度重复3次，27 ℃倒置培养2 d，长出菌落后采取四区划线法分离纯化菌株。将单菌落用接种环点种在CMC⁃Na培养基上，30 ℃倒置培养48 h后，取1 mg/mL刚果红溶液浸染30 min，倒去刚果红染液，再将1 mol/L的NaCl水溶液倒入培养基脱色30 min，待透明水解圈出现后，倒掉水溶液，观察水解圈大小，用游标卡尺测量水解圈直径（D）和菌落直径（d），计算水解圈和菌落直径比值（D/d），筛选出降解纤维素能力较强的菌株^［17］。

1.3 纤维素降解菌的鉴定

① 菌株形态观察：根据《伯杰氏细菌鉴定手册》^［18］和《常见细菌系统鉴定手册》^［19］对分离所得的菌株进行菌体形态观察、染色反应测定。

② 分子鉴定：采用细菌基因组DNA抽提试剂盒，操作步骤按说明进行，提取细菌基因组DNA。以提取出来的DNA为模板，利用细菌通用引物：正向引物27F（5'⁃AGAGTTTGATCCTGGCTCAG⁃3'）和反向引物1492R（5'⁃GGTTACCTTGTTACGACTT⁃3'）进行PCR扩增，具体方法参见文献［20］。反应完成后，用1%琼脂糖凝胶进行PCR扩增产物检测，合格后送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对，并用MEGA7.0建立系统发育树，确定菌属分类地位。

1.4 产酶条件的优化

菌株产酶条件优化采用单因素试验法

1.4.1 不同pH培养基对产酶活力的影响

为了确定最适合菌株产酶的培养基pH，配制pH分别为4、5、6、7、8、9的产酶培养基，以牛肉膏为氮源，每个pH梯度的菌株培养做3个重复，以1%的接种量将细菌培养液接种到50 mL的不同pH的产酶发酵培养基，32 ℃，150 r/min条件下振荡培养48 h，测定各培养基中菌株酶活力。

1.4.2 不同培养温度对产酶活力的影响

设置24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃的不同温度培养条件，培养基pH为7.0，氮源为牛肉膏。每个处理设置3个重复，150 r/min条件下震荡培养48 h，测定酶活力。

1.4.3 不同氮源培养基对产酶活力的影响

培养基分别以蛋白胨、酵母膏、酒石酸铵、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵为氮源，pH为7.0，每个处理设置3个重复，取细菌培养液以1%的接种量接种到50 mL含不同氮源的产酶发酵培养基中，在32 ℃，150 r/min条件下振荡培养48 h后，测定酶活力。

1.4.4 纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力采用滤纸酶（FPase）活力测定法^{［21，22］}。

2 结果与分析

2.1 菌株形态观察

在CMC⁃Na培养基上共筛选出45株可以在选择培养基上生长的细菌，刚果红染色表明，水解圈最大的是菌株A04（D/d值为2.45）和菌株A07（D/d值2.23）。菌株形态如图1。菌株A04在培养基上呈白色，表面光滑，边缘规则，单菌落呈现圆形，中间隆起，不透明，革兰氏染色呈现红色，杆状，可以判定菌株A04为革兰氏阴性菌。菌株A07在培养基上为白色，表面光滑，边缘规则，单菌落呈现圆形，中间凸起，不透明，染色呈现红色，杆状，判定菌株A07为革兰氏阴性菌。

2.2 菌株的16S rDNA鉴定和分析

提取菌株A04和A07的DNA之后，利用细菌通用引物27F⁃1492R进行PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，所得基因片段如图2表示，条带明亮清晰，均在1 500 bp左右。

根据测序结果在NCBI上进行分析比对，选取BLAST中相似度较高的细菌序列，并下载相关序列后，利用MEGA7.0计算细菌序列相似度，同时采用Neighbor⁃Joining法构建细菌系统发育树。如图3所示，菌A04和假中间苍白杆菌（Ochrobactrum pseudintermedium）NR043756.1在同一分支上，序列相似度达到98%。因此，初步判断该菌为苍白杆菌属（Ochrobactrum）A04；菌A07和土生拉乌尔菌（Raoultella terrigena） NR114503.1在同一分支上，序列相似度达到98%。因此，初步判断该菌为拉乌尔菌属（Raoultella）A07。

2.3 产酶条件优化

2.3.1 培养基不同pH对菌株A04和A07产酶活力的影响

苍白杆菌属A04和拉乌尔菌属A07分别在不同pH的培养基中生长情况和酶活测定见表2。随着pH逐步增加至6，苍白杆菌属A04的FPase活力逐渐增加，当pH=6时，达到最大值，FPase活力为9.39 U/mL。随后FPase活力随着pH的增加而下降，说明苍白杆菌属A04在pH为6时FPase活力最大。拉乌尔菌属A07的FPase活力在pH 为4增加到7的过程中，也逐渐增加；当pH=7时，达到最大值，FPase活力达到17.74 U/mL，拉乌尔菌属A07不同pH下的FPase活力无显著性差异，说明偏酸性和偏碱性的培养基对拉乌尔菌属A07的FPase活力的影响不大。

2.3.2 不同培养温度对菌株A04和A07产酶活力的影响

设置5个不同的温度条件分别对苍白杆菌属A04和拉乌尔菌属A07进行培养，结果见表3。苍白杆菌属A04的FPase活力从28 ℃增加到32 ℃时，以较大幅度提升，在32 ℃达到最大值12.41 U/mL。但在24 ℃时菌株的FPase活力为10.27 U/mL，在28 ℃时菌株的FPase活力为2.79 U/mL，可能由于28 ℃下的环境条件发生变化。苍白杆菌属A04在常温条件下FPase活力较强。菌株A07在24~28 ℃的FPase活力逐渐降低，28~32 ℃大幅度提高，在32 ℃达到最大值，FPase活力达到21.99 U/mL。随着温度的升高，32~36 ℃时，拉乌尔菌属A07的FPase活力下降，但在36~40 ℃时，FPase活力有较小程度提高。

2.3.3 不同氮源对菌株A04和A07产酶活力的影响

为研究最适合菌株产FPase的氮源，将苍白杆菌属A04和拉乌尔菌属A07分别接种到含6种不同氮源的培养基培养，测定菌株的FPase活力，经SPSS软件分析苍白杆菌属A04在不同氮源条件下的 FPase活力无显著性差异，见表4所示。苍白杆菌属A04在酵母膏作为氮源时的FPase活力最高，达到8.56 U/mL，在酒石酸铵、牛肉膏作为氮源时FPase活力较高，分别为8.44 U/mL和6.84 U/mL；拉乌尔菌属A07在酒石酸铵作为氮源时FPase活力最高，达到21.06 U/mL，在硫酸铵、牛肉膏、酵母膏作为氮源时FPase活力较高，分别为17.30 U/mL、14.56 U/mL、14.22 U/mL。

3 讨 论

纤维素在自然界中的储量巨大，主要以农作物废物的形式存在^［23］，纤维素经过分解后可以参与生态环境中的碳循环，作为生物能源、养殖饲料、化学化工等方面的原料，如将其高效利用对改善能源结构具有重要的意义。从低等白蚁肠道成功分离出10株菌，其中以坚强芽胞杆菌（Bacillus firms）的纤维素综合酶活力最高^［24］。从牦牛粪便中筛选出的高效纤维素降解菌为短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）^［25］，从大熊猫粪便中筛选出的降解纤维素的菌株为库氏芽胞杆菌（Paenibacillus cookii）^［26］。本研究从云斑白条天牛肠道内分离获得具有降解纤维素能力的苍白杆菌属A04和拉乌尔菌属A07。买尔哈巴·艾合买提^［27］发现假中间苍白杆菌具有降解纤维素的活力，假中间苍白杆菌分泌胞外多糖可作为针对废机油的生物乳化剂^［28］。拉乌尔属细菌是广泛存在于生态环境中的一类革兰氏阴性菌^［29~31］，具有降解多种环境污染物的作用^［32］。

不同的纤维素降解菌的最适产酶条件存在差异。从白蚁肠道分离出的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）在pH=8.0时，产酶活力最强^［33］。牦牛粪便中短小芽胞杆菌在pH=6.5时产纤维素酶活力最强^［25］。通过对蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）培养条件的优化，发现该菌株在起始pH=5.0的培养基中酶活最高^［33］。本研究分离获得的苍白杆菌属A04在pH=6.0、温度32 ℃、以酵母膏为氮源时酶FPase活力最高，拉乌尔菌属A07在pH=7.0、温度32 ℃、以酒石酸铵为氮源条件下产酶活力最高。本研究从云斑白条天牛肠道内首次分离获得具有降解纤维素能力的苍白杆菌属和拉乌尔菌属细菌，关于其应用前景有待于进一步研究。

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基金资助

广西自然科学基金(2017GXNSFAA198142)

广西大学“大学生创新创业训练计划”资助项目(201810593089)